麻杏石甘湯對哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達的影響

虞琳 潘建偉 葉樂平

麻杏石甘湯對哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達的影響

虞琳 潘建偉 葉樂平

目的 研究麻杏石甘湯對哮喘模型大鼠肺組織STAT4及其mRNA表達的影響，探討其在哮喘治療中的作用及可能機制。方法 將55只SPF級SD大鼠隨機分為5組，對照組（A組）、哮喘組（B組）、高、中、低劑量麻杏石甘湯+哮喘組（C組、D組、E組），每組11只。采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏與霧化吸入激發法制作哮喘模型。留取肺泡灌洗液（BALF）測定IL-12及IL-13水平；并取肺組織標本HE染色后觀察氣道炎癥，免疫組化法及原位雜交法分別檢測STAT4及其mRNA表達。結果 （1）哮喘組大鼠BALF中IL-13水平升高，IL-12水平下降，肺組織炎癥細胞浸潤明顯。（2）STAT4及STAT4 mRNA在各組大鼠氣道平滑肌及血管肌層中均有表達，正常對照組呈陽性表達，哮喘組陽性表達最弱。（3）麻杏石甘湯干預后哮喘大鼠IL-13水平下降，IL-12水平上升，炎癥反應減輕；STAT4表達上調，其中高劑量組與哮喘組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量、中劑量麻杏石甘湯組STAT4 mRNA表達與哮喘組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論 卵蛋白致敏大鼠氣道及血管肌層STAT4表達受抑制，麻杏石甘湯可能通過上調STAT4及其mRNA的表達，減輕哮喘大鼠氣道炎癥反應。

哮喘 麻杏石甘湯 STAT4 STAT4 mRNA

近10余年來，我國兒童支氣管哮喘（簡稱哮喘）患病率從 2000年的 1．97%上升為2010年的 3.02%[1]，嚴重影響兒童身心健康，給家庭及社會造成極大負擔。氣道慢性炎癥被公認為是哮喘發病的中心環節。信號轉導及轉錄激活因子4（signal transduction and activator of transcription 4，STAT4）作為一種新型轉錄因子家族成員，在哮喘氣道炎癥和氣道高反應形成中的調控作用備受關注[2]。麻杏石甘湯作為祛痰、平喘中成藥在歷史上應用已久，現代藥理學研究亦證實其具有鎮咳、祛痰、平喘、解熱的功效，但對哮喘作用的具體機制尚未明確，對STAT4的影響國內更未見報道。因此，筆者擬通過建立卵蛋白致敏哮喘大鼠模型，觀察STAT4及其mRNA在肺組織中的表達，進一步探討麻杏石甘湯對氣道炎癥的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 55只SPF級幼年雄性SD大鼠（購自溫州醫科大學實驗動物中心），體重120～180g；卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）、焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）、氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司）；大鼠IL-12、IL-13 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；STAT4兔抗大鼠多克隆抗體（美國Abcam公司）；STAT4原位雜交檢測試劑盒、多聚甲醛、水合氯醛（武漢博士德生物公司）；二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液（北京中衫金橋）；HE染色試劑盒（江蘇碧云天生物工程有限公司）；其余試劑為市售分析純試劑。

1.2 麻杏石甘湯的制備 麻黃6g、杏仁6g、甘草5g、石膏20g（購自溫州醫科大學附屬第二醫院），麻杏石甘湯的煎制參照衛生部國家中醫藥管理局發布的《醫療機構中藥煎藥室管理規范》。雙蒸水浸泡麻黃、杏仁、甘草30min，煮石膏20min，后同煎15min，留取第一道汁后，再加入雙倍雙蒸水煎15min，取汁，混合第一、二道汁，濃縮至相應體積，高、中、低劑量中藥組體積分別為50ml、100ml、200ml，含生藥 24.6g/kg、12.3g/kg、6.15g/kg。于 4℃冰箱保存備用。

1.3 實驗動物分組及處理 將大鼠隨機分為對照組(A組)、哮喘組（B組）、哮喘+高劑量麻杏石甘湯組（C組）、哮喘+中劑量麻杏石甘湯組（D組）、哮喘+低劑量麻杏石甘湯組（E組），每組11只。哮喘模型的制作分致敏和激發兩階段。致敏階段：B組～E組大鼠于第1天和第8天分別注射OVA和氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液1ml,A組予等量的0.9%氯化鈉溶液。激發階段:第2次致敏1周后，將B組～E組大鼠放入自制的密閉有機玻璃箱（40cm×30cm×20cm）中，予含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液霧化吸入，1次/d，每次持續30min，連續定時激發3d；A組用0.9%氯化鈉溶液替代OVA進行。C組～E組在第2次致敏后第4天開始分別予不同濃度麻杏石甘湯灌胃，2次/d，激發階段則每次激發前后4h灌胃同等劑量麻杏石甘湯。

1.4 標本的制備 末次激發24h后予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射，后行腹主動脈切開處死。即刻切開氣管，切取左肺中下段組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋后切片。經氣管插管行右肺灌洗，留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）8ml（10ml分2次灌洗，回收率確保在80%以上），離心后取上清液-80℃凍存備用。

1.5 BALF中IL-12和IL-13水平測定 應用Sandwich ELISA法檢測BALF中IL-12、IL-13的表達水平。實驗過程參照試劑說明書進行。

1.6 免疫組化法檢測STAT4的表達 切片脫蠟后高壓修復3min，3%H2O2滅活內源性酶后沖洗，5%山羊血清封閉非特異性抗體，37℃水浴箱孵化30min，滴加STAT4兔抗鼠多克隆抗體（1∶200），4℃過夜；復溫后滴加生物素標記二抗山羊抗兔的IgG37℃孵化30min，沖洗后行DAB染色，蘇木素復染，PBS返藍后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。陽性結果呈棕黃色，用圖像分析儀IPP6.0測定肺組織平均吸光度值（IOD）作為STAT4相對水平。

1.7 原位雜交法檢測STAT4 mRNA的表達 石蠟切片常規脫蠟后用3%H2O2滅活內源性酶，3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶消化，滴加采用經地高辛標記的針對STAT4的寡核苷酸探針雜交液，封閉后再加入生物素化兔抗地高辛，染色、封片。陽性細胞著色呈棕黃色。同用圖像分析儀IPP6.0測定肺組織平均吸光度值（IOD）作為STAT4 mRNA相對水平。

1.8 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比較 B組BALF中IL-13水平顯著高于A組，不同劑量麻杏石甘湯組中均較哮喘組低，其中C、D組與B組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。與A組相比，哮喘組IL-12水平明顯下降，而采用麻杏石甘湯干預后BALF中IL-12水平隨著麻杏石濃度升高而升高。詳見表1。

表1 各組大鼠BALF中IL-12、IL-13水平的比較（pg/ml）

2.2 麻杏石甘湯對大鼠氣道炎癥的影響 A組大鼠氣道、血管形態規整，氣道平滑肌及血管肌層無增生，未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡腔無明顯滲出。B組大鼠氣道、血管肌層明顯增生，周圍嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤明顯，基底膜增厚，部分氣道上皮脫落，管腔內可見黏液栓，肺間質增寬。麻杏石甘湯組肺組織炎性細胞浸潤、血管平滑肌增生均較B組減輕，且隨著劑量的增高，改善越顯著。詳見圖1（見插頁）。

2.3 麻杏石甘湯對STAT4表達的影響 STAT4主要表達于正常大鼠氣道及血管肌層（0.3617±0.0812），呈棕黃色強陽性表達，在B組大鼠表達減少，其IOD為0.1396±0.0711，麻杏石甘湯干預后B組STAT4表達上調，其中C組IOD為0.2251±0.0540，差異有統計學意義（P＜0.05）。D組IOD 為 0.1872±0.0396，E組為 IOD 為0.1539±0.0306，與B組比較無統計學差異。詳見圖2（見插頁）。

2.4 麻杏石甘湯對STAT4 mRNA表達的影響 A組大鼠氣道及血管肌層均可見STAT4 mRNA呈棕黃色陽性表達（0.2848±0.0616），B 組大鼠 STAT4 mRNA 表達（0.1671±0.0532）較A組明顯減弱（P＜0.05）。麻杏石甘湯灌胃后大鼠氣道肌層及血管亦可見STAT4 mRNA陽性表達，且表達強于B組，其中C組（0.2193±0.0722）、D組（0.1962±0.0708）與B組比較有統計學差異（P＜0.05）。詳見圖3（見插頁）。

3 討論

哮喘發病率逐年攀升,目前我國兒童哮喘的總體控制水平尚不理想[3]，對其發病機制的深入探索一直是學者研究的重點。STATs是一種新型的轉錄因子家族成員，可進入細胞核內直接結合DNA調控靶基因轉錄，在介導多種細胞因子和趨化因子的信號轉導過程中起到關鍵作用[4]。在目前已發現的7種STATs家族成員中，STAT1、STAT4、STAT6與哮喘氣道炎癥和重塑中關系是哮喘防治領域的熱點問題，其中STAT4在CD4+T細胞向輔助性T淋巴細胞1（Th1）分化中起著至關重要的作用[5-6]。經典免疫學認為，Th1/Th2細胞在數量、活化及功能方面的比例失衡是哮喘發病的核心環節。Th1主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ，Th2則通過分泌 IL-4、IL-13 等細胞因子，誘導趨化因子介導肺部炎癥，誘導分泌免疫球蛋白 E（immunglobulin E，IgE），促進黏液高分泌，加重氣道高反應（airway hyperresponsiveness，AHR），還可直接刺激成纖維細胞參與氣道重塑，在變態反應中起著獨特而重要的作用[7]。

本研究應用卵蛋白致敏建立哮喘大鼠模型，激發過程中可見哮喘組大鼠表現煩躁不安、呼吸急促、四肢顫動、毛色失去光澤，嚴重者四肢癱軟，俯伏不動，呼吸節律不規則。留取標本時可見哮喘大鼠肺臟體積增大、腫脹，可見不規則暗紅色充血區。哮喘大鼠肺組織切片HE染色見氣道平滑肌及血管肌層增生，與對照組相比，周圍炎性細胞（嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞）大量浸潤，部分氣道上皮損傷、脫落。同時，與正常組比較，哮喘大鼠BALF中Th2細胞因子IL-13明顯升高，Th1細胞因子IL-12減少，證實存在Th1/Th2比例失衡，表明哮喘模型復制成功。

IL-12與受體結合后，可引起STAT4磷酸化、同源二聚化及核易位[8]，從而誘導其下游的CD4+T細胞向Th1 分化，促進 IFN-γ 的表達[1，5-6，9-10]。當 STAT4 缺乏時，CD4+Th1的分化和IFN-γ的表達受到抑制，CD4+Th1的完整分化需要STAT4和T-bet共同參與[10]。本實驗通過免疫組化、原位雜交法從蛋白及基因水平發現，STAT4及STAT4 mRNA在各組大鼠氣道平滑肌及血管肌層中均有表達。哮喘組大鼠STAT4及STAT4 mRNA的表達顯著低于正常對照組，提示哮喘時氣道平滑肌和血管肌層的STAT4基因轉錄、蛋白翻譯均受到抑制。筆者推測，哮喘時肺組織中IL-12等Th1細胞因子分泌不足，STAT4表達減少，間接促進了Th2的優勢分化，參與哮喘氣道炎癥的發病。但Dulek等[11]應用呼吸道合胞病毒（RSV）感染STAT4-/-小鼠的研究發現，STAT4基因敲除的小鼠亦未能產生Th2優勢應道，沒有出現AHR、粘液高分泌及嗜酸性粒細胞聚集等現象。Kim等[12]研究也發現IL-13介導的Th2哮喘表型，如AHR和非嗜酸性炎癥等，也必須依賴IL-12-STAT4-IFN-γ軸。說明STAT4在哮喘發病中的作用除了減少Th1的形成，在促進Th2細胞因子表達方面可能也發揮了重要作用。本研究僅從IL-12、IL-13及STAT4基因、蛋白的層面進行闡述，STAT4通路相應的其他上游及下游細胞因子、結合蛋白等具體信號途徑尚未研究，特別是對Th2細胞因子的具體作用及機制，還有待更深入的研究。

近年來中西醫結合治療兒童哮喘受到越來越多學者的重視，一些中草藥已被證實具有抗炎、抗過敏及免疫調節的作用，最新的國內兒童哮喘指南[13]也將中藥提入治療方案中。麻杏石甘湯出自張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、炙甘草、石膏四味藥組成，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效。現代藥理研究證實麻黃所含的麻黃堿為β2受體激動劑，可舒張支氣管平滑肌痙攣；杏仁所含的苦杏仁苷經酶水解后產生氫氰酸，可使呼吸運動趨于安靜而奏止咳平喘作用，并能促進動脈壁前列腺I2（PGI2）樣物質生成，擴張微血管，改善微循環；生石膏的成分主要為含水硫酸鈣對支氣管神經肌肉有抑制及鎮靜作用，加上鈣質能降低支氣管通透性，故有解除支氣管痙攣的作用[14]。筆者前期研究已發現，麻杏石甘湯能下調哮喘大鼠氣道上皮STAT6及STAT6 mRNA的表達，抑制IL-13的分泌[15]。本研究發現麻杏石甘湯能減輕卵蛋白致敏大鼠激發后的躁動不安、呼吸急促等表現，減少氣道EOS浸潤。進一步研究發現，哮喘大鼠在不同濃度麻杏石甘湯灌胃后，BALF中IL-13有不同程度的下調，IL-12水平上升，氣道平滑肌及血管肌層STAT4及STAT4 mRNA表達均有增強。因此筆者推測麻杏石甘湯可能通過促進Th1細胞因子分泌，間接抑制Th2，上調STAT4表達，進而減少EOS的浸潤，減輕氣道炎癥反應。國內有報道認為麻杏石甘湯可調節哮喘小鼠Th1/Th2平衡，但主要通過STAT6等途徑[16]。本研究中麻杏石甘湯的方劑劑量根據人及動物間藥物換算公式所得，若能有標準化片劑等制型，相信實驗數據將更具有指導意義。

綜上所述，麻杏石甘湯能上調Th1細胞因子IL-12的表達，下調Th2細胞分泌，促進肺組織中STAT4的表達，減少哮喘大鼠氣道炎癥，參與哮喘防治的調控，為其在哮喘現代臨床應用提供了依據。相信隨著哮喘機制研究的進一步深入，臨床麻杏石甘湯片劑、STAT4制劑等的研發，將為哮喘的中西醫結合治療提供更廣闊的空間。

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Expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction

YU Lin,PAN Jianwei,YE Leping.
Department of Pediatrics,the Fourth Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine,Yiwu 322000,China

Objective To investigate the expression of STAT4 in asthma rats treated with Chinese medicine Maxingshigan Decoction. Methods Fifty five SPF SD rats were randomly divided into 5 groups:control group(group A),asthma group(group B),high-dose,medium-dose and low-dose Maxingshigan Decoction treatment groups(group C,group D,group E).The rat model of asthma was established by ovalbumin(OVA)challenge methods.The bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues were obtained.The concentrations of IL-12 and IL-13 in BALF were measured by ELISA,the inflammation of airways was observed by HE staining;the expressions of STAT4 protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization,respectively. Results Compared with the control group,the concentration of IL-13 in BALF of asthma group was higher,while it was decreased in Maxingshigan Decoction treatment groups of asthma rats.On the contrary,the concentration of IL-12 in BALF was lower in asthma group than that in control group.The IL-12 levels in BALF were increased in Maxingshigan Decoction groups,and compared with asthma rats,the levels in groups C and D were significantly elevated(P＜0.05).HE staining showed airway smooth muscle and vascular muscle hyperplasia and peripheral inflammatory cells infiltration in asthma rats.Maxingshigan Decoction dose-dependently alleviated the pathological changes in asthma rats.STAT4 and its mRNA were expressed in airway smooth muscles and vascular muscle layers in all groups.The expression of STAT4 in Maxingshigan Decoction groups was higher than that in control group,and the expression of STAT4 protein in group C was significantly higher than that in asthma group (P＜0.05).The expression of STAT4 mRNA in groups C and D were significantly up-regulated compared with the asthma group (P＜0.05). Conclusion Chinese medicine Maxingshigan Decoction can reduce airway inflammation in asthma rats through up-regulation of STAT4 expression.

Asthma Maxingshigan Decoction STAT4 STAT4 mRNA

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.21.2017-1672

322000 義烏，浙江大學醫學院附屬第四醫院兒科（虞琳、潘建偉）；溫州醫科大學附屬第二醫院兒童呼吸科（葉樂平）

葉樂平，E-mail：yeleping@163.com

2017-07-13）

嚴瑋雯）