實驗條件對宣城水體中藻藍蛋白提取結果的影響

羅 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工業大學 安徽宣城 242000）

實驗條件對宣城水體中藻藍蛋白提取結果的影響

羅 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工業大學 安徽宣城 242000）

通過改變不同的實驗條件，研究從藍藻中提取藻藍蛋白的最佳條件，以實現藍藻的資源化利用。以宣城水體的新鮮秋季藍藻水華為研究對象，利用液氮和50℃恒溫水浴，通過反復凍融法提取藻藍蛋白。以光譜吸收特征和濃度值為評價指標，研究和比較了不同凍融介質（磷酸鹽緩沖液和乙醇溶液）和不同稀釋比例（0.4，0.5,0.67，1）對藻藍蛋白的提取效果的影響。結果表明：以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液作提取劑的藻藍蛋白提取效果比100%乙醇好；稀釋比例對藻藍蛋白的提取效果的影響與提取介質有關。

藍藻，藻藍蛋白，反復凍融法

引言

由于污染物的排放，河流或湖泊中總氮和總磷的含量過高，水體富營養化狀況日益嚴重，在高溫的季節，易爆發藍藻，導致水生動植物的死亡。目前，常見處理水華藍藻的方法有：盡量控制外源性（點源、面源）營養物質輸入；削減內源性營養物質的負荷；水華爆發前后應急除藻抑藻。機械和人工打撈是治理藍藻的重要應急措施，但打撈上岸的藍藻處置不當會造成二次污染。雖然在特定的條件下發揮了一定的作用，但是總的說來大多數措施往往曠日持久、耗資巨大、收效甚微，因此探究快速、高效、經濟的新型治理方法顯得尤為重要。

國內外關于藍藻資源化利用主要有如下研究和開發：(1)厭氧發酵，采用藍藻厭氧發酵技術生產沼氣和肥料；(2)好氧堆肥，主要包括藍藻堆肥和藍藻直接做肥料；(3)提取藻藍蛋白(C-phycocyanin，C-PC)等生物活性物質；(4)藍藻飼料化，主要包括藍藻處理后加工成飼料或提取氨基酸作為飼料添加劑等[1]。目前，藍藻資源化的主要途徑有兩種，一是制沼氣，二是制肥料。這兩種途徑適合處理大規模暴發的藍藻，但其產品(沼氣和肥料)附加值較低，經濟效益僅與處理成本持平，這也是目前難以進行市場化推廣的根本原因。本研究以打撈藍藻資源化利用為目標，開展藍藻藻藍蛋白提取的技術研究。

目前細胞破碎的主要方法有超聲波破碎法、反復凍融法、溶脹法、研磨法、化學試劑處理法及高壓均質法等，Bennett[2]等用反復凍融法來破碎藻細胞，張靜等對比反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的提取效果，得到反復凍融法提取的提取效果優于其他3種方法。細胞破碎方法眾多，且各有優缺點，超聲波破碎法易產生高溫引起PC變性，溶脹法提取周期較長，化學試劑法易產生污染等。由于液氮溫度較低，可達-196℃，冷凍效果好、時間短，且反復凍融法過程中，可以做到避免光解、不易污染，人為干擾最小，能保證測定的準確性。因此本文選用液氮反復凍融法作為細胞破碎方法[3]，以光譜吸收特征和藻藍蛋白濃度為評價指標，研究了不同凍融介質對藻藍蛋白的提取效果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

水樣采自于宛陵湖湖區表層30 cm水體，采集日期為2016年11月23號。采樣期間天氣晴朗，水體pH值為7.3。風力為微風。水樣采集后放入采樣瓶內運回實驗室立刻進行分析。

1.2 樣品準備

將采集來的藍藻放入若干支50ml離心管內配平，放置在冰柜冷藏（2℃）保存備用。用抽濾機和布氏漏斗對藍藻進行預處理。

1.3 標準樣品配置

分別使用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇為提取劑，配置濃度為25、20、15和10g/l的藍藻溶液，每組設兩支試管，共16支試管，用P1至P8，Y1至Y8表示。

1.4 藻藍蛋白的提取

反復凍融法：將裝有配置好的藻藍蛋白標準樣品的離心管先放入液氮中冷凍20min，然后置于50℃水浴中加熱20min，反復凍融3次后，經離心機以8000r/min離心20min。

1.5 藻藍蛋白濃度的測定根據Bennet公式計算藻藍蛋白濃度。

式中，藻藍蛋白濃度Cpc的單位為mg/L；OD615、OD652分別是藻藍蛋白提取液在615、652 nm處的吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取的藻藍蛋白濃度結果

表1 以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍藻溶液的吸光值

表2 以100%乙醇為提取 劑的藍藻溶液的吸光值

表3 以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液為提取劑的藻藍蛋白濃度

表4 以100%乙醇為提取劑的藻藍蛋白濃度

圖1 不同凍融介質條件下藻藍蛋白濃度

凍融完成后，用分光光度儀分別測出不同凍融介質條件下藻藍蛋白溶液的在615、652 nm處的吸光度（表1和表2），之后通過Bennet公式計算得到藻藍蛋白濃度（表3和表4）并將兩組數據繪與一張圖上（圖1）。由圖可得，除了第三組（P-3和Y-3）外，其余組中，用磷酸鹽緩沖液作提取劑的藻藍蛋白濃度均大于用乙醇作提取液的藻藍蛋白濃度，且提取到的藻藍蛋白濃度差距較大，說明磷酸鹽緩沖液的提取藻藍蛋白效果明顯好于乙醇。

2.2 稀釋比例的影響

圖2 磷酸鹽緩沖液稀釋比例與藻藍蛋白濃度關系

圖3 100%乙醇稀釋比例與藻藍蛋白濃度關系

以10g/l的藍藻溶液為標準液，分別用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇配制出稀釋比例為0.4，0.5，0.67，1的藍藻溶液。經過反復凍融法，得到藻藍蛋白溶液，通過分光光度儀測出藻藍蛋白濃度，繪出下圖（圖 2,和圖 3）。

通過圖2可以發現，以磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍藻溶液，在稀釋比例為1時，所得到的藻藍蛋白濃度最高，在稀釋比例為0.67時，得到藻藍蛋白濃度最低。在稀釋比例由0.4增加到0.67時，得到藻藍蛋白濃度不斷降低，在稀釋比例為1倍時升高，可以推斷，在0.67到1之間存在藻藍蛋白濃度的最低點。

通過圖3可以發現，以乙醇為提取劑的藍藻溶液，在稀釋比例為0.5時，所得到的藻藍蛋白濃度最高。在稀釋比例為0.4和0.67之間存在藻藍蛋白濃度的最高點。當稀釋比例由0.67增加到1時，得到藻藍蛋白濃度降低。

3 討論

在水體水華日益加劇的情況下，提取藻藍蛋白溶液，實現藻藍蛋白高附加值資源化的研究顯得尤為重要，它本身就符合循環經濟的理念。該試驗選取宣城水體水華時新鮮藍藻作為試驗對象，利用藻藍蛋白粗提液得率為評價指標，研究不同凍融介質、不同稀釋比例對藻藍蛋白提取效果的影響。

每種物質都有自身的特征吸收光譜，吸收峰波長可以對已知物質定性[4]。已有研究結果[5]表明，藻藍蛋白吸收峰位于620 nm附近。反復凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法等方法的藻藍蛋白提取液在620 nm附近具有吸收峰，而其中反復凍融法620 nm的峰高最強。由此可得反復凍融法的提取效果優于其他方法，因此本次實驗采用凍融法提取藍藻中的藻藍蛋白。

已有研究結果表明[6]，隨凍融次數的增加，得到藻藍蛋白的純度，得率均有所下降。本次實驗通過反復凍融三次，用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇為提取劑，獲得藍藻中的藻藍蛋白。實驗結果表明，用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為提取劑所得到的藻藍蛋白濃度遠遠大于用100%乙醇為提取劑得到的藻藍蛋白。

可能是由于一定濃度的磷酸鹽緩沖液最接近生物體的環境溶液，藻藍蛋白在該環境中易于保存，而其他凍融介質不具備該特性。

本實驗同時研究了磷酸鹽緩沖液和乙醇的最適稀釋比例。實驗結果表明，以磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍藻溶液，在稀釋比例為0.67到1之間存在藻藍蛋白得率的最低點。在稀釋比例為1時，為藻藍蛋白得率的最高點。以乙醇為提取劑的藍藻溶液，最適稀釋比例位于0.4和0.67之間。

[1]李輝東.太湖藍藻藻藍蛋白提取純化工藝研究,南京理工大學,2012

[2]Bennett A，Bogorad L．Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga．Journal of Cell Biology，1973，58(2):419-435．

[3]龐曉宇.富營養化湖泊水體中藻藍蛋白提取方法的對比:中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室，南京210008

[4]劉志廣.分析化學.北京:高等教育出版社，2008:227-228．

[5]張允允，陳敏.藍隱藻藻藍蛋白的分離、純化及性質研究．煙臺大學學報:自然科學與工程版，2011，24(4):281-286．

[6]趙冰冰.不同凍融條件對破壁提取巢湖水華新鮮藍藻中藻藍蛋白的影響．安徽合肥:安徽農業科學，2014，42(17):5345-5347，5392