奶山羊miRNA-451表達譜分析及靶基因初步鑒定

郭文嬌 李轉見 張博文 藍賢勇 雷初朝 陳宏*

(1，西北農林科技大學動物科技學院陜西省農業分子生物學重點實驗室 712100;2，河南農業大學牧醫工程學院 450000)

奶山羊miRNA-451表達譜分析及靶基因初步鑒定

郭文嬌1李轉見2張博文1藍賢勇1雷初朝1陳宏1*

(1，西北農林科技大學動物科技學院陜西省農業分子生物學重點實驗室 712100;2，河南農業大學牧醫工程學院 450000)

基于實驗室應用高通量測序得到的奶山羊泌乳峰期和干奶期乳腺組織中小RNA結果的基礎上，利用實時熒光定量PCR、基因克隆、重組腺病毒以及細胞培養等技術并結合生物信息學的方法，對miRNA-451的表達譜及其靶基因進行了預測與驗證分析。miRNA-451在不同組織和不同泌乳時期乳腺組織中的表達量結果顯示：miRNA-451在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、卵巢組織表達量都很低，在4個泌乳時期（泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期）的變化與泌乳曲線的變化有相似之處，同時在泌乳4個時期有逐漸降低趨勢。本研究構建了攜帶奶山羊miRNA-451前體序列404bp的重組腺病毒載體。雙熒光素酶報告檢測系統檢測結果表明，CAST基因為miRNA-451的靶基因。

奶山羊；miRNA-451；表達譜分析；靶基因

miRNA是一種22個核苷酸（nt)左右的單鏈小分子RNA。它的發現開啟了人類認識非編碼RNA的新篇章，miRNA在生物的生長過程中參與了細胞的增殖、分化、生物發育及代謝等許多生物學過程，同時也在疾病發生發展過程中扮演了重要的角色[1]。miRNA在乳腺發育過程中具有重要作用。Liu等[2]首次利用miRNA芯片掃描了人的全基因組miRNAs，結果在乳腺組織中發現有23種miRNAs的表達量較高，但和其他21個組織中發現的miRNAs數量相比，乳腺組織中發現miRNAs的數目較少。Iorio等[3]研究表明，miRNA-125b在乳腺發育的各個階段都處于高表達狀態。在乳腺癌組織中miRNA-125b處于表達量較低，這表明抑制miRNA-125b的表達對乳腺上皮細胞的分化具有破壞作用。Silveri等[4]利用Northern blot的方法分析發現在小鼠的乳腺中有9種特異表達的miRNAs。Wang等[5]應用miRNA芯片已分析出在小鼠的懷孕和哺乳期miRNA-138和miRNA-431有下調的作用，而miRNA-133和miRNA-133a-133b具有上調的作用。Gu等[6]研究發現 miRNA-21，miRNA-23a，miRNA-24和miRNA-143在乳腺的生長和發育期這些miR-NAs發揮著重要的功能。Tanaka等[7]研究表明，miRNA-101a對乳腺上皮細胞的發育和分化具有調控作用。Avril-Sassen等[8]研究發現，在乳腺發育過程中miRNA的表達可能共同來調節一些集群，而在這些集群中與乳腺癌相關的miRNAs表達量顯著增高，影響這些miRNAs共同調節的機制和功能為我們提供了一條新的研究乳腺生物學的途徑。Cui等[9]的研究表明，miRNA-126-3p對乳腺上皮細胞的增殖有調控作用，其通過與其靶基因--孕酮受體（PGR）的3′UTR結合從而發揮作用的。

目前關于miRNA-451研究主要集中在癌癥上。Scholl等研究發現，miRNA-451在診斷中的表達水平與IM療法有相關性[10]；Cheng等研究發現，miRNA-451靶向干擾素調節因子參與全身性紅斑狼瘡的發生[11]。巢海潮等分析發現，miR-451在不同膀胱癌細胞中差異表達，其表達異常可影響癌細胞生物學功能[12]。Pigati等研究表明，miR-451在正常乳腺上皮細胞高表達[13]。miRNA-451的超表達可以抑制細胞周期的進程、細胞的遷移、入侵和促進非小細胞肺癌細胞的凋亡。本研究以西農薩能奶山羊泌乳峰期和干奶期的乳腺組織為研究材料，基于本實驗室以前的高通量測序及分析結果[14]，鑒定與奶山羊乳腺泌乳生理密切相關的miRNA-451及其靶基因，為西農薩能奶山羊的定向選育提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織樣品的采集與總RNA的提取

健康的成年西農薩能奶山羊母羊（3周歲），采自楊凌姚南新村屠宰場。采取Trizol法提取西農薩能奶山羊乳腺組織，及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、卵巢組織的總RNA。

1.2miRNA的定量分析

依據Chen等人提出的Stem-loop實時定量PCR的方法自行設計了特異性的反轉錄引物及相應的PCR引物，本研究根據牛miRNA-451的序列（NC_007317.5)克隆出miRNA-451前體序列404 bp，設計帶有SalⅠ、HindⅢ酶切位點的引物，見表1。

1.3 奶山羊miRNA-451靶基因預測

根據Allen[15]和Schwab[16]方法和原則進行miRNA的靶基因預測，同時利用TargetScan在線軟件預測了miRNA-451的靶基因，即ING3、FLT-1、CAST基因。

1.4 候選靶序列的擴增引物設計

根據NCBI GenBank數據庫的牛ING3（NC_007302.5）、FLT-1（NC_007310.5）、 CAST（NC_007305.5） 基因的序列設計引物（表2），擴增預測靶位點兩側目的片段。

1.5 統計分析

利用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析以及Dunnett's多重比較統計兩組間的差異。*：＜0.05； **：＜0.01。

2 結果與分析

2.1 乳腺發育相關的miRNA-451的表達譜分析

如圖1表達譜分析結果，肝臟（Liver，Li）、肺臟（Lung， Lu）、 心臟（Heart He）、 腎臟（Kidney， Ki）、 肌肉（Skeletal muscle， Mu）、 脾臟（Spleen， Sp）、 脂肪（Inner Fat，Fa）和卵巢組織（Ovary，Ov））和不同的泌乳時期乳腺組織（泌乳前期（30 DAL）、泌乳峰期（75 DAL）、泌乳末期（200 DAL）和干奶期（320 DAL））。MiRNA-451在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、卵巢組織表達量都很低，在泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期的變化與奶山羊泌乳曲線的變化有些相似，同時在泌乳的4個時期有逐漸降低的趨勢。總體來說，奶山羊乳腺組織的miRNA-451在乳腺組織中表達量相對較高，并且在不同泌乳時期的表達存在顯著差異。

表1 miRNA-451實時定量引物信息

表2 候選基因引物

圖1 miRNA-451的表達譜分析

2.2 miRNA-451腺病毒過表達載體的構建與轉染

2.2.1 重組質粒表達載體的構建

克隆得到了包含miR-451前體的目的片段，并將該目的片段與載體pAdTrack-CMV重組，得到重組載體pAdTrack-CMV-miRNA-451，雙酶切鑒定結果證明該載體構建成功。pAdTrack-CMV-miRNA-451載體與骨架載體pAdEasy-1進行同源重組，得到重組質粒pAd-miRNA-451，酶切結果表明腺病毒重組成功。

2.2.2 重組腺病毒表達載體的包裝和擴增與最佳滴度確定

重組質粒pAd-miRNA-451線性化后，轉染至293A細胞，2 d后在熒光顯微鏡下可觀察到細胞中有綠色熒光，第7天可觀察到噬菌斑，說明細胞出現病變，9d后80%細胞游離脫落，此時收集的病毒為第一代病毒，反復感染3次后得到高滴度的病毒。

取生長狀態良好的293T細胞鋪于6孔板中，將包裝好的腺病毒載體pAd-miRNA-451和腺病毒空對照載體pAd-Control（由本實驗室保存）分別感染293T細胞。pAd-miRNA-451 的 MOI為 150、 200、 250， pAd-Control的 MOI為50、100、150，每組重復3次，72h后觀察其綠色熒光表達情況，最佳的MOI為熒光強度亮并且細胞形態不變時的腺病毒感染量。pAd-miRNA-451的最佳MOI為200，pAd-Control的最佳MOI為100，如圖2所示：

圖2 轉染腺病毒后的293T細胞（100×）

2.2.3 重組腺病毒在293T細胞中的表達情況

取生長狀態良好的293T細胞鋪于6孔板中，當細胞融合度達到90%時，根據最佳MOI，感染293T細胞，并設置對照，每組3個重復。72 h后提取細胞內的RNA，進行實時熒光定量。結果顯示，試驗組重組的過表達腺病毒pAdmiRNA-451的表達量是對照組重組的過表達空載體pAd-Control的27倍（如圖3），差異極顯著。此結果說明，本研究構建的重組腺病毒pAd-miRNA-451能高水平的表達目標基因，為以后繼續研究miRNA-451調控乳腺上皮細胞的作用及機制以及對奶山羊泌乳的調控提供一定的實驗基礎。

2.3 奶山羊miRNA-451靶基因的初步研究

2.3.1 靶基因的預測

圖3 pAd-miRNA-451在293T細胞中的表達

利用預測軟件預測靶基因，并結合Grimson等[17]提出的miRNA靶位點的序列特征，獲得如下較為可信的靶位點：ING3（inhibitor of growth family，member 3，生長抑制因子3基因）；CAST（calpastatin，鈣蛋白酶抑制蛋白）；FLT-1（fms-related tyrosine kinase 1，fms相關的酪氨酸激酶1），如圖4。

圖4 靶基因預測AING3基因；B CAST基因；C FLT-1基因

2.3.2 對應山羊靶基因序列的擴增與比對

經PCR克隆與測序，獲得山羊的序列后，利用序列分析軟件BioXM 2.6進行序列的同源性和保守性分析。分析結果如圖5。

2.3.3 psiCHECK-2載體構建與鑒定

克隆ING3和CAST基因上miRNA-451的靶序列，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。將擴增得到的片段與psiCHECK-2載體連接，得到含有目的基因3'UTR的雙熒光素酶報告載體。用Overlap PCR的方法擴增ING3（圖6）和CAST（圖7）上miRNA-451的靶序列的突變體。將擴增得到的片段與psiCHECK-2載體連接，得到含有目的基因3'UTR的突變型雙熒光素酶報告載體。

2.3.4 雙熒光素酶實驗

本研究利用雙熒光素酶報告檢測系統實驗鑒定山羊miRNA-451的靶基因。即利用miRNA-451 mimics分別與野生型重組載體（psiCHECK-2-ING3和psiCHECK-2-CAST）和對應的突變型重組載體共轉染293T細胞，以單獨分別用野生型重組載體和突變型重組載體轉染293T細胞為對照。統計海腎熒光素酶的活性變化。分析結果表明，miRNA-451的miScript mimic與psiCHECK-2-CAST共轉染的293T細胞中psiCHECK-2-CAST重組質粒表達海腎熒光素酶與對照組的海腎熒光素酶的活性變化顯著（＜0.05）（圖 8）， 突變分析結果顯示miRNA-451的miScript mimic不能使CAST基因突變重組質粒表達的螢火蟲熒光素酶活性的降低（圖8），說明CAST基因是miRNA-451作用的靶基因。

圖5 牛與山羊的靶序列比對注：方框內的序列是預測的與miRNA結合序列；小寫字母為錯匹配堿基

圖6 ING3基因的overlap-PCR電泳圖。372bp為上游片段，67bp為下游片段，重合32bp。372+67-32=407

圖7 CAST基因的overlap-PCR電泳圖。190bp為上游片段，192bp為下游片段，重合32bp。190+192-32=350片

圖8 miR-451的CAST靶基因的驗證

A預測的miR-451靶基因CAST位點，構建缺失種子區（粗體）的突變體載體。B miR-451 mimics分別與野生型psiCHECK-2-CAST重組載體和突變型psiCHECK-2-CAST重組載體共轉染HEK293T細胞，以單獨分別用野生型psiCHECK-2-CAST重組載體和突變型psiCHECK-2-CAST重組載體轉染HEK293T細胞為對照（*＜0.05)。

3 討論

很多研究證明，miRNA的表達具有明顯的時序和組織特異性。miRNA的特異性表達依賴于特定的生理功能和生理狀態。Ji等[17]比較嶗山奶山羊泌乳中期和泌乳后期乳腺差異表達情況，發現了1113種保守miRNA和31種新miRNA，其中，697個保守的miRNA表達差異顯著，包括272個具有上調功能的miRNA和425個具有下調功能的miRNA，還揭示了這兩個不同泌乳階段中共表達最豐富的10種miRNA（miR-143， miR-143-3p， miR-138a-3p， let-7-5p， let-7b，let-7b-5p， miR-30a， miR-30a-5p， miR-738e， miR-378d）。而本研究發現miRNA-451在乳腺組織中表達量很高，并且在不同的泌乳時期的表達存在顯著差異，泌乳峰期miRNA-451的表達量是干奶期表達量的一倍多。

腺病毒具有高效率感染其他細胞的優勢，同時可以避免自然腺病毒的毒性對人及其他動物的危害。在基因功能的研究中，腺病毒載體得到了越來越廣泛的應用。Russell等[18]通過管內注射重組腺病毒載體到小鼠的乳腺上皮細胞中，發現腺病毒并沒有破壞乳腺上皮細胞的正常形態及其功能，這樣就可以通過這種非侵害性的方法來研究乳腺上皮細胞這種腔類細胞中基因的功能。本研究中的奶山羊miRNA-451的前體序列長度是404bp屬于短片段基因，而腺病毒載體最高可以表達10 kb的基因，因此，腺病毒載體可以高效的表達miRNA-451的前體序列。

本試驗主要是通過生物信息學的方法來預測miRNA的靶基因。由于沒有專門預測山羊靶基因的數據庫，只能利用物種間的同源性來預測。利用TargetScan在線軟件和一些靶基因的預測規則進行預測。最后通過基因功能確定ING3、CAST和FLT-1為候選靶基因，又進一步通過克隆及同源性的比對最終確定了ING3和CAST為候選的靶基因。

因為miRNA-451在泌乳峰期的乳腺組織中是上調的，而miRNA-451在轉錄后抑制靶基因的表達。因此，本研究結合靶基因的預測篩選了一些在乳腺發育或泌乳生理過程中具有負向調控的基因。構建野生型和突變型靶序列的雙熒光報告載體，利用雙熒光檢測系統檢測熒光素酶活性的變化，據此來判斷miRNA與某一特定的靶基因識別情況。這種方法在miRNA靶基因驗證研究中廣泛應用[19-22]。293T細胞在這里只是工具，在研究中只利用細胞的翻譯系統，所以實驗得出的結果是可靠的和具有普遍性的。本研究中利用雙熒光素酶報告實驗證明了CAST基因為miRNA-451的靶基因。

[1]Kloosterman,W.P.,E.Wienholds,R.F.Ketting,et al.Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo[J].Nucleic Acids Res,2004,32:6284-6291.

[2]Liu,C.G.,G.A.Calin,B.Meloon,et al.An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101:9740-9743.

[3]Iorio,M.V.,M.Ferracin,C.G.Liu,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer research,2005,65:7065-7068.

[4]Silveri,L.,G.Tilly,J.L.Vilotte,et al.MicroRNA involvement in mammary gland development and breast cancer[J].Reprod.Nutr.Dev,2006,46:549-556.

[5]Wang,Y.M.,D.L.Dai,M.Martinka,Prognostic significance of nuclear ING3 expression in human cutaneous melanoma[J].Clin.Cancer Res,2007,13:4111-4116.

[6]Gu,Z.,S.Eleswarapu,and H.Jiang.Identification and characterization of microRNAs from the bovine adipose tissue and mammary gland[J].FEBS Letters,2007,581:981-988.

[7]Tanaka,T.,S.Haneda,K.Imakawa,et al.A microRNA,miR-101a,controls mammary gland development by regulating cyclooxygenase-2 expression[J].Differentiation,2009,77:181-187.

[8]Avril-Sassen,S.,L.D.Goldstein,J.Stingl,et al.Characterisation of microRNA expression in post-natal mouse mammary gland development[J].BMC Genomics,2009,10:231-242.

[9]Cui,W.,Q.Z.Li,L.Feng,et al.MiR-126-3p regulates progesterone receptors and involves development and lactation of mouse mammary gland[J].Mol.Cell.Biochem,2011,355:17-25.

[10]Cheng J,Wu R,Long L,et al.miRNA-451a Targets IFN Regulatory Factor 8 for the Progression of Systemic Lupus Erythematosus[J].Inflammation,2017:1-12.

[11]巢海潮,董志峰,張古月,等.miRNA-451在膀胱癌細胞中的表達及對其生物學功能的影響 [J].臨床與病理雜志,2016,36(9):1350-1355.

[12]Pigati L,Yaddanapudi SC,Iyengar R,Kim DJ,Hearn SA,Danforth D,Hastings ML,Duelli DM.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells[J].PLoS One.2010,5(10):e13515.

[13]Scholl,V.,R.Hassan,and I.R.Zalcberg.miRNA-451:A putative predictor marker of Imatinib therapy response in chronic myeloid leukemia[J].Leukemia Research,2012,36:119-121.

[14]Zhuanjian Li,Xianyong Lan,Wenjiao Guo,et al.Comparative Transcriptome Profiling of Dairy Goat MicroRNAs from Dry Period and Peak Lactation Mammary Gland Tissues[J].PLoS ONE,2012,7(12):e52388.

[15]Allen,E.,Z.Xie,A.M.Gustafson,et al.microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants[J].Cell,2005,121:207.

[16]Schwab,R.,J.F.Palatnik,M.Riester,et al.Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J].Developmental cell,2005,8:517-527.

[17]Grimson,A.,K.K.-H.Farh,W.K.Johnston,P.Garrett-Engele,L.P.Lim,and D.P.Bartel.2007.MicroRNA targeting specificity in mammals:determinants beyond seed pairing[J].Mol Cell.27:91-105.

[17]Ji,Z.,G.Wang,Z.Xie,J,et al.Identification of Novel and Differentially Expressed MicroRNAs of Dairy Goat Mammary Gland Tissues Using Solexa Sequencing and Bioinformatics[J].PloS one,2012,7:e49463.

[18]Russell,T.D.,A.Fischer,N.E.Beeman,et al.Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo[J].J.Virol,2003,77:5801-5809.

[19]Liu Y,Huang H,Liu M,Wu Q,Li W,Zhang J.MicroRNA-24-1 suppresses mousehepatoma cell invasion and metastasis via directly targeting O-GlcNActransferase[J].Biomed Pharmacother,2017,91:731-738.

[20]Bao H,Yao QP,Huang K,Chen XH,Han Y,Jiang ZL,Gao LZ,Qi YX.Platelet-derived miR-142-3p induces apoptosis of endothelial cells inhypertension[J].Cell Mol Biol,2017,63(4):3-9.

[21]Wu F,Li J,Guo N,Wang XH,Liao YQ.MiRNA-27a promotes the proliferation and invasion of human gastric cancer MGC803 cells by targeting SFRP1 viaWnt/β-catenin signaling pathway[J].Am J Cancer Res,2017,7(3):405-416.

[22]Zhang S,Wang R,Su H,Wang B,Sizhu S,Lei Z,Jin M,Chen H,Cao J,Zhou H.Sus scrofa miR-204 and miR-4331 Negatively Regulate Swine H1N1/2009 Influenza AVirus Replication by Targeting Viral HA and NS,Respectively[J].Int J Mol Sci,2017,18(4).pii:E749.

本研究由高等學校博士學科點專項科研基金（博導類）、西農薩能奶山羊泌乳生理相關miRNA調控機理研究（20120204110007）、西北農林科技大學基本科研費項目（No.QN2011102)、西農薩能奶山羊乳腺泌乳相關miRNAs的鑒定及其調控泌乳性能研究（QN2011102）資助完成。

郭文嬌（1987-），女，陜西省西安市人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳學。

陳宏，教授，研究方向：生物技術與家畜育種。