血府逐瘀膠囊對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌SIRT1-FoxO-自噬通路基因表達(dá)的影響

段錦龍，姚魁武，劉友明，張鈮雪 （中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053）

·論著·

血府逐瘀膠囊對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌SIRT1-FoxO-自噬通路基因表達(dá)的影響

段錦龍，姚魁武，劉友明，張鈮雪 （中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053）

目的：探討血府逐瘀膠囊對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌SIRT1-FoxO-自噬通路基因表達(dá)的影響．方法：將60只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（無菌蒸餾水 10 mL·kg-1灌胃）、模型組（無菌蒸餾水10 mL·kg-1灌胃）、血府逐瘀大劑量組（0．04 g·kg-1）、血府逐瘀中劑量組（0．02 g·kg-1）、血府逐瘀小劑量組（0．01 g·kg-1）、L-NAME 組（2 mg／只腹腔注射）．采用熒光定量 PCR技術(shù)檢測各組心肌組織 SIRT1、FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表達(dá)情況．結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組、血府逐瘀小劑量組、L-NAME組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；而與模型組、L-NAME 組相比，血府逐瘀大、中、小劑量組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）．與假手術(shù)組相比，模型組、L-NAME 組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4 表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO4表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀大劑量組缺血心肌細(xì)胞Fox3表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；與模型組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4 表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）．與 L-NAME 組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4 表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）．結(jié)論：血府逐瘀膠囊對(duì)冠脈結(jié)扎致大鼠心肌缺血有保護(hù)作用，其作用可能是通過促進(jìn)SIRT1基因表達(dá)，抑制FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表達(dá)而發(fā)揮作用．

缺血性心臟病；SIRT1；FoxO；血府逐瘀膠囊；自噬

0 引言

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）的發(fā)病率和死亡率在我國呈顯著上升趨勢，是引起死亡的主要疾病之一［1］．其在中醫(yī)屬于“胸痹”“心痛”范疇，主要病因?yàn)闅鉁觥⑿拿}痹阻［2］．血府逐瘀湯出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是治療胸痹心痛的經(jīng)典方劑．研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯膠囊可以降低血漿肌鈣蛋白T水平，促進(jìn)缺血區(qū)血管新生，抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用［3-6］．沉默信息調(diào)控子1（silent information regulator 1， SIRT1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，可通過去乙酰基作用來調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞衰老等多種生命活動(dòng)［7-9］．叉頭蛋白O（forkhead box O，F(xiàn)oxO）是一類重要自噬調(diào)控因子，其活性主要受SIRT1調(diào)節(jié)．SIRT1-FoxO-自噬通路對(duì)心血管疾病具有重要影響．L-NAME為信號(hào)通路的抑制劑．本研究旨在探討血府逐瘀膠囊對(duì)急性心肌缺血大鼠SIRT1-FoxO-自噬通路基因表達(dá)的影響．

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年清潔級(jí)雌性wistar大鼠，體質(zhì)量約200～220 g，由廣安門醫(yī)院動(dòng)物中心提供，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，燈光明／暗各12 h，自由攝食．動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0009，總共60只．

1．2 藥物與試劑 血府逐瘀膠囊（天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào) ZZ-2914-津衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1992）0748號(hào)）；L-NAME（美國 Sigma 公司，批號(hào)：lot 14HO135）．RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（加拿大Fermentas公司，批號(hào)：41651）；SYBR Green PCR Master Mix（美國 Applied Biosystems公司，批號(hào)：1309117）．

1．3 主要儀器 GeneAmp 5700熒光定量 PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；紫外線分光光度計(jì)（德國BACKMAN公司，DU640型）；電泳儀（北京六一儀器廠，CYY-Ⅲ-5 型）．

1．4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 成年清潔級(jí)wistar大鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只．假手術(shù)組：麻醉后開胸，冠狀動(dòng)脈只穿線不結(jié)扎，術(shù)后灌胃無菌蒸餾水，持續(xù)28 d；模型組：按心肌缺血造模方法進(jìn)行造模，術(shù)后灌胃無菌蒸餾水，持續(xù)28 d；血府逐瘀大劑量組：造膜方法同前，術(shù)后按4 g／L給予血府逐瘀膠囊灌胃，持續(xù)28 d；血府逐瘀中劑量組：造膜方法同前，術(shù)后按2 g／L給予血府逐瘀膠囊灌胃，持續(xù)28 d；血府逐瘀小劑量組：造膜方法同前，術(shù)后按1 g／L給予血府逐瘀膠囊灌胃，持續(xù)28 d；L-NAME組：造膜方法同前，造模前1 d即開始L-NAME連續(xù)腹腔注射給藥，1次／d．

1．5 造膜方法及給藥 參照Yin等［10］造膜方法，在大鼠左側(cè)第4、5肋間剪開皮膚，分離肌肉、肋骨和心包，采用0號(hào)手術(shù)線在左心耳下2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，閉合胸腔，逐層進(jìn)行縫合．參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［11］所示體表面積劑量換算法并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算給藥劑量，血府逐瘀大、中、小劑量組每升含血府逐瘀湯膠囊藥粉分別為4、2、1 g，按1 mL／100 g體重劑量灌胃；假手術(shù)組、模型組灌胃等體積無菌蒸餾水；L-NAME組按2 mg／只劑量腹腔注射給藥．

1．6 觀察指標(biāo)及檢測方法 熒光定量PCR技術(shù)檢測心肌細(xì)胞 SIRT1、FoxO1、FoxO3和 FoxO4基因mRNA表達(dá)：取缺血區(qū)心肌組織，加入Trizol抽提總RNA，分光光度法測定核酸的濃度，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，用GeneAmp 5700熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增．SIRT1基因引物上游序列：5'-TTTCAGAACCACCAAAGCG-3'，下游：5'-TCCCACAGGAAACAGAAACC-3'，長度：206 bp；FoxO1基因引物上游序列：5'-AACCAGCTCAAATGCTAGTACCATC-3'，下游：5'CAGAAGGTTCTCCATGTTTTTCTGGA-3'，長度：198 bp；FoxO3基因引物的上游序列：5'-TACACGGCTTGCTTACGG-3'，5'-GGGTTCAGAACGAAGGGACT-3'，長度：423 bp；FoxO4基因引物的上游序列：5'-TCATCAGCCAGGCCATTGAA-3'， 5'-TGCTGTGCAAAGACAGGTTGTG-3'，長度：423 bp；循環(huán)條件：95℃ 10 min，95℃ 25 s，然后55℃ 25 s，72℃ 50 s，72℃ 5 min，共 40 循環(huán)．

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測數(shù)據(jù)以表示，正態(tài)分布、方差齊性檢測后，采用t檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組、血府逐瘀小劑量組、L-NAME組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；而與模型組、L-NAME組相比，血府逐瘀大、中、小劑量組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05，表 1）．

2．2 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞FoxO家族基因表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組、L-NAME組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO4 表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀大劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO3表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）．與模型組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3、FoxO4表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）．與 L-NAME組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3、FoxO4 表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05，表 2）．

表1 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)的影響 （ ±s， n＝6）

表1 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)的影響 （ ±s， n＝6）

aP＜0．05 vs假手術(shù)組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs L-NAME 組．

組別 劑量（g·kg-1） SIRT1相對(duì)定量假手術(shù)組 - 1．00±0．03模型組 - 0．79±0．04a血府逐瘀大劑量組 4 0．97±0．04ce血府逐瘀中劑量組 2 0．95±0．03ce血府逐瘀小劑量組 1 0．88±0．03ace L-NAME 組 2 0．74±0．02a

表2 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞FoxO家族基因表達(dá)（±s，n＝6）

表2 血府逐瘀膠囊對(duì)大鼠缺血心肌細(xì)胞FoxO家族基因表達(dá)（±s，n＝6）

aP＜0．05 vs假手術(shù)組；cP＜0．05 vs模型組；eP＜0．05 vs L-NAME 組．

組別 劑量（g·kg-1） FoxO1相對(duì)定量 FoxO3相對(duì)定量 FoxO4相對(duì)定量假手術(shù)組 - 1．00±0．02 1．00±0．04 1．00±0．04模型組 - 1．11±0．04a 1．14±0．03a 1．10±0．03a血府逐瘀大劑量組 4 1．04±0．04ce 1．01±0．02ace 1．05±0．03ce血府逐瘀中劑量組 2 1．07±0．04ce 1．09±0．04ce 1．07±0．04ce血府逐瘀小劑量組 1 1．09±0．02ae 1．13±0．02ce 1．08±0．03a L-NAME 組 2 1．13±0．03a 1．19±0．04a 1．11±0．02a

3 討論

缺血性心臟病在中醫(yī)屬“胸痹”“心痛”等范疇．血府逐瘀湯出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是中醫(yī)胸痹心痛的代表方劑，本方由桃紅四物湯（桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地、白芍）合四逆散（柴胡、枳實(shí)、甘草、芍藥）加桔梗、牛膝而成，方中以桃紅四物湯活血化瘀而養(yǎng)新血；四逆散疏理肝氣，使氣行則血行；加桔梗引藥上行達(dá)于胸中（血府）；牛膝引瘀血下行而通利血脈．本方具有活血化瘀、行氣止痛的功效，在缺血性心臟病治療中應(yīng)用廣泛且療效顯著．

自噬是細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞器在溶酶體的作用下被吞噬降解的過程．生理情況下，自噬是細(xì)胞本身代謝和某些細(xì)胞器更新的必要過程．而在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理情況下，常出現(xiàn)自噬活動(dòng)的過度激活［12-13］．FoxO是自噬調(diào)控的關(guān)鍵因子，其中起顯著作用的有FoxO1、FoxO3、FoxO4．SIRT1通過調(diào)節(jié) FoxO乙酰化水平調(diào)控細(xì)胞的自噬活性，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程［14］．因此，SIRT1-FoxO-自噬通路對(duì)心血管疾病具有重要影響．Sciarretta等［15］研究發(fā)現(xiàn)，缺血／營養(yǎng)剝奪可通過激活 SIRT1-FoxO-自噬通路，調(diào)控細(xì)胞自噬以保護(hù)心功能，而在缺血后再灌注過程中，自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)會(huì)明顯增加，引起過度自噬，造成心肌細(xì)胞死亡．Hariharan等［16］研究表明，在介導(dǎo)饑餓條件下，SIRT1誘導(dǎo)的FoxO1去乙酰化可能在心肌細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用．

在心肌缺血階段，自噬增加可以降解無功能的細(xì)胞器和胞質(zhì)蛋白，為細(xì)胞提供氨基酸和脂肪酸，以維持心肌ATP水平和修復(fù)缺血性損傷所必需的蛋白質(zhì)，從而抑制細(xì)胞的壞死和凋亡，發(fā)揮其保護(hù)作用［17-19］．研究［20］表明，當(dāng)機(jī)體在能量缺乏和代謝障礙時(shí)，心肌組織中自噬現(xiàn)象增加可以保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的生存．Yan等［21］對(duì)豬的慢性心肌缺血模型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡率的下降與自噬現(xiàn)象增加有關(guān)．Loos等［22］培養(yǎng)H9c-2細(xì)胞進(jìn)行缺血性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示輕度缺血時(shí)自噬現(xiàn)象增加，而自噬增加可以保護(hù)線粒體膜電位以及細(xì)胞膜的完整性，從而延緩細(xì)胞不可逆損傷的發(fā)生時(shí)間．然而，當(dāng)中重度缺血時(shí)細(xì)胞凋亡和壞死增加，而自噬未見增加．綜合現(xiàn)有研究成果，在心肌缺血期自噬主要起保護(hù)作用［23-24］．

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、血府逐瘀小劑量組、L-NAME組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；而與模型組、L-NAME 組相比，血府逐瘀大、中、小劑量組缺血心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）．與假手術(shù)組相比，模型組、L-NAME組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO4表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；血府逐瘀大劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO3表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）．與模型組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3、FoxO4表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）．與L-NAME 組相比，血府逐瘀大、中劑量組缺血心肌細(xì)胞 FoxO1、FoxO3、FoxO4 表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；血府逐瘀小劑量組缺血心肌細(xì)胞FoxO1、FoxO3表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）．而高儀［25］研究發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧損傷后，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬過度增強(qiáng)，細(xì)胞受損．上調(diào)FoxO4后，心肌細(xì)胞內(nèi)過度自噬進(jìn)一步增強(qiáng)，細(xì)胞受損情況加重；下調(diào)FoxO4后，心肌細(xì)胞內(nèi)過度自噬被抑制，細(xì)胞受損情況也得到改善，說明FoxO4參與心肌細(xì)胞的自噬過程，并可以促進(jìn)細(xì)胞自噬．本研究結(jié)果提示血府逐瘀膠囊能夠促進(jìn)SIRT1基因表達(dá)，并能抑制通路下游基因 FoxO1、FoxO3、FoxO4的表達(dá)．

綜上所述，血府逐瘀膠囊對(duì)冠脈結(jié)扎致大鼠心肌缺血具有保護(hù)作用，可能是通過促進(jìn)SIRT1基因表達(dá)，抑制FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表達(dá)而發(fā)揮作用，為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．但本研究也存在不足之處，僅對(duì)SIRT1-FoxO-自噬通路基因表達(dá)進(jìn)行檢測，缺少對(duì)于心肌自噬指標(biāo)的觀察，故無法確證血府逐瘀膠囊是抑制自噬還是促進(jìn)自噬，希望在今后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步深入的研究．

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Effect of Xuefu Zhuyu capsule on the expression ofSIRT1-FoxO-autophagic pathway gene in myocardium of rats with myocardial ischemia

DUAN Jin-Long， YAO Kui-Wu， LIU You-Ming， ZHANG Ni-Xue Guang'anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

AIM： To investigate the effect of Xuefu Zhuyu capsule on the expression of SIRT1-FoxO-autophagic pathway gene in myocardium of rats with myocardial ischemia．METHODS：A total of 60 rats were randomly divided into sham operation group（gastric infusion with 10 mL·kg-1distilled water）， model group（10 mL·kg-1distilled water）， high dose group of Xuefu Zhuyu capsule （0．04 g·kg-1）， middle dose group of Xuefu Zhuyu capsule （0．02 g·kg-1）， low dose group of Xuefu Zhuyu capsule（0．01 g·kg-1）， L-NAME group （2 mg each， intraperitoneal injection）．The expression of SIRT1， FoxO1， FoxO3 and FoxO4 genes in the ischemic myocyte were detected by fluorescence quantitative PCR．RESULTS： The expression levels of SIRT1 in the ischemic myocyte in the model group，low dose group of Xuefu Zhuyu capsule and L-NAME group were significantly lower than those of the sham operation group （P＜0．05）．The expression levels of SIRT1 in the ischemic myocyte in the high dose group，middle dose group，low dose group of Xuefu Zhuyu capsule were significantly higher than those of the model group and the L-NAME group （P＜0．05）．The expression levels of FoxO1，F(xiàn)oxO3 and FoxO4 in ischemic myocyte of the model group and L-NAME group，F(xiàn)oxO1 and FoxO4 in the low dose group of Xuefu Zhuyu capsule，and FoxO3 in the high dose group of Xuefu Zhuyu capsule were significantly higher than those of the sham operation group （P＜0．05）．The expression levels of FoxO1， FoxO3 and FoxO4 in ischemic myocyte of the high and middle groups of Xuefu Zhuyu capsule，F(xiàn)oxO3 in the low dose group of Xuefu Zhuyu capsule were significantly lower than those of the model group （P＜0．05）．The expression levels of FoxO1， FoxO3 and FoxO4 in ischemic myocyte of the high and middle groups of Xuefu Zhuyu capsule， FoxO1， FoxO3 in the low dose group of Xuefu Zhuyu capsule were significantly lower than those of the L-NAME group， with statistically significant difference （P＜0．05）．CONCLUSION： Xuefu Zhuyu capsule has a protective effect on myocardial ischemia induced by coronary artery ligation，and it plays an important role in promoting the expression levels of SIRT1 gene and inhibiting the expression levels of FoxO1，F(xiàn)oxO3 and FoxO4 gene．

ischemic heart disease； SIRT1； FoxO； Xuefu Zhuyu capsules；autophagy

R285

A

2095-6894（2017）11-18-04

2017-06-05；接受日期：2017-06-20

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473466）

段錦龍．博士．研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治．

Tel：010-88001241 E-mail：524133606＠ qq．com

姚魁武．博士，主任醫(yī)師，碩導(dǎo)．研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治．Tel：010-88001241 E-mail：yaokuiwu＠ 126．com