磷脂酶D1在乳腺癌細胞中的表達及雷公藤甲素的干預作用

顧取良，鄶一賀，陳佳園，李江超，王麗京 （廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣東廣州510006）

磷脂酶D1在乳腺癌細胞中的表達及雷公藤甲素的干預作用

顧取良，鄶一賀，陳佳園，李江超，王麗京 （廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣東廣州510006）

目的：探討磷脂酶D1（PLD1）在不同乳腺癌細胞中的表達情況以及雷公藤甲素（TP）對人乳腺癌細胞PLD1表達的影響．方法：體外培養人乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細胞4T1，以人乳腺上皮細胞MCF10A為對照，采用半定量RT-PCR測定PLD1 mRNA表達水平，Western blot法測定PLD1蛋白表達水平，并分別測定不同濃度 TP對PLD1及細胞周期素D1（cyclin D1）mRNA和蛋白的表達水平的影響．結果：半定量RT-PCR和Western blot分析均顯示，PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-231和4T1中的表達顯著高于乳腺上皮細胞MCF10A，其中MDA-MB-231細胞PLD1蛋白表達水平約為MCF10A細胞的20倍．TP抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的同時下調PLD1和cyclin D1表達水平，并且呈一定濃度依賴性．結論：相比乳腺正常上皮細胞，PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌細胞中表達增高，TP抑制乳腺癌細胞增殖的作用機制與其抑制PLD1的表達有關．

磷脂酶D1；乳腺癌細胞；乳腺上皮細胞；雷公藤甲素

0 引言

磷脂酶D（phospholipase，PLD）是一類能夠催化磷脂酰膽堿水解的酶，哺乳類動物常見 PLD1和PLD2兩種亞型．PLD水解作用產物磷脂酸、二脂酰甘油及溶血磷脂酸等均可作為細胞內重要的第二信使，參與調控許多生理和生化過程信號通路如調節細胞生長、增殖、存活、遷移等［1］．PLD在腫瘤的發生、分化、凋亡及轉移等過程中扮演重要的角色［2-3］，已有文獻［4-6］表明，在多種腫瘤組織中均發現PLD1活性異常升高，如子宮內膜癌、胃癌、肝細胞癌等．乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌發病率呈逐年上升且年輕化趨勢，對乳腺癌的發生發展機制及其治療的研究是目前的熱點［7］．有關PLD1與乳腺癌發生發展及其表達水平是否與預后等相關的文獻報道尚不多見［8］．Oncomine癌癥數據庫不同來源的數據集關于PLD1 mRNA水平的變化與乳腺癌的關系結論并不一致，如TCGA數據分析結果顯示浸潤性乳腺小葉癌和乳腺浸潤性導管癌中PLD1 mRNA表達下降，而另一來源的數據分析則顯示浸潤性乳腺癌PLD1 mRNA表達相比正常組織顯著增高，提示PLD1表達變化在乳腺癌發生發展方面的具體作用仍未明確．

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從雷公藤屬植物中分離純化而得到的環氧二萜內酯類化合物，具有免疫抑制、抗炎、抗生育和抗腫瘤等多種生物活性，與傳統化療藥物相比，其抗腫瘤作用具有高效、廣譜的特點．TP抗腫瘤機制主要與誘導細胞周期停滯、抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡有關［9］，其具體分子機制尚未完全闡明．Kang等［10］報道，TP可通過調節NF-κB轉錄因子活性抑制乳腺癌細胞PLD1表達及活性．Li等［11］報道，TP抗乳腺癌細胞 MCF-7增殖作用與下調雌激素受體、下游MAPK信號通路蛋白表達及其磷酸化有關．

為了進一步研究PLD1與乳腺癌發生發展的關系，本研究首先以正常人乳腺上皮細胞MCF10A為對照，檢測比較人乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細胞4T1中PLD1 mRNA和蛋白的表達水平，并以MDA-MB-231細胞為作用對象研究TP對乳腺癌細胞增殖的抑制作用及其對PLD1及其相關通路下游基因表達水平的影響，為闡明TP抗乳腺癌作用機制及其應用提供實驗依據．

1 材料和方法

1．1 主要試劑 Dulbecco's modified eagle's medium（DMEM）培養基、青霉素和鏈霉素混合液、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品，胎牛血清為美國Hyclone公司產品，RNA提取試劑Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產品；RT-PCR試劑盒（RR014A）購自Takara公司；蛋白濃度測定試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit購自 Thermo Fisher公司；PLD1抗體（#3832）購自Cell Signaling Technology公司，cyclin D1抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，增強型化學發光（enhanced chemi-luminescence，ECL）試劑購自北京普利萊基因技術有限公司．TP購于北京金寶科技有限公司（純度≥98%），四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）購自Sigma公司．

1．2 細胞培養 人乳腺癌細胞 MCF7、MDA-MB-231、小鼠乳腺癌細胞 4T1及人乳腺上皮細胞MCF10A為廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所實驗室保存．MCF10A細胞及其專用培養基購自廣州賽哲生物科技有限公司，其余細胞采用DMEM培養基（含10%胎牛血清），添加100 U／mL青霉素和鏈霉素混合液，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養．

1．3 半定量RT-PCR檢測 采用Trizol試劑分別提取對數生長期的乳腺癌細胞 MCF7、MDA-MB-231、4T1和乳腺上皮細胞MCF10A的總RNA，經紫外分光光度法檢測純度并定量后，按RT-PCR試劑盒說明書操作，取1 μg RNA逆轉錄得cDNA后再進行PCR擴增，以GAPDH作為內參．引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1．

表1 PCR引物序列

擴增條件：預變性 94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，30 個循環；延伸 72℃ 8 min；4℃保存．擴增產物在含有溴化乙錠的1．5%瓊脂糖凝膠中進行電泳后，Syngene凝膠成像系統拍攝并采用Image J軟件分析條帶亮度以計算mRNA相對表達水平．

1．4 Western blot檢測 按常規方法分別提取各組細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白質濃度．各取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜．室溫封閉 1 h后，與 PLD1、cyclin D1多克隆抗體或β-actin單克隆抗體分別孵育，4℃過夜；經TBST漂洗后再分別加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h．然后用ECL試劑顯影，ImageQuant LAS4000成像系統拍攝并采用Image J軟件進行主帶灰度分析以計算相對蛋白表達水平．

1．5 TP對MDA-MB-231細胞增殖活力和PLD1及cyclin D1 表達的影響 不同濃度 TP（0、10、25、50、100、250、500 nM）作用于 MDA-MB-231 細胞 24 h、48 h后，采用MTT法檢測細胞增殖活力．不同濃度TP（0、20、100 nM）作用于MDA-MB-231 細胞24 h 后，按前述方法分別檢測不同作用濃度下細胞內PLD1和cyclin D1 mRNA和蛋白的表達水平．

1．6 統計學處理 采用GraphPad Prism 5統計學軟對數據進行分析，實驗數據以均數±標準差（mean±SEM）表示，采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異有統計學意義．

2 結果

2．1 PLD1 mRNA在乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達 半定量RT-PCR擴增條帶電泳相對亮度定量分析顯示，與正常乳腺上皮細胞MCF10A細胞相比，PLD1 mRNA在乳腺癌細胞系MCF7細胞中的表達約為其2倍，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231和4T1細胞中的表達分別約為其8倍、7倍，差異具有統計學意義（??P＜0．01，圖 1）．

圖1 半定量RT-PCR檢測乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中PLD1 mRNA的表達

2．2 PLD1蛋白在乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達 Western blot檢測顯影條帶灰度值分析結果顯示，與乳腺上皮細胞MCF10A細胞相比，PLD1蛋白在乳腺癌細胞系MCF7細胞中的表達約為其2倍，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231和4T1細胞中的表達則高達20 倍，差異具有統計學意義（?P＜0．05，??P＜0．01，圖 2）．

圖2 Western blot法檢測乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中PLD1蛋白的表達

2．3 MTT法檢測TP對MDA-MB-231細胞增殖活力的影響 10～500 nM濃度范圍TP作用于MDAMB-231細胞24 h或48 h，MTT法檢測（圖3）表明，與0 nM TP相比，TP從25 nM濃度開始對細胞增殖活力的抑制作用有統計學意義（?P＜0．05 或??P＜0．01），并呈一定濃度和時間依賴趨勢；但當TP濃度達到100 nM以上時，其對MDA-MB-231細胞活力的抑制程度并不隨濃度進一步明顯增加，且作用48 h抑制程度與作用24 h抑制程度比較，差異無統計學意義．

圖3 MTT法檢測TP對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用

2．4 TP對MDA-MB-231細胞中PLD1和cyclin D1 mRNA及蛋白表達的影響 將不同劑量TP（0、20、100 nM）作用于MDA-MB-231細胞24 h后，用半定量RT-PCR法檢測發現PLD1和cyclin D1的mRNA表達均下調，且隨著TP濃度增加而呈劑量依賴趨勢，各濃度組的相應擴增條帶的電泳相對亮度比較，差異有統計學意義（?P＜0．05，??P＜0．01）；采用 Western blot法檢測蛋白表達情況，同樣發現PLD1和cyclin D1的蛋白表達下調且存在一定的劑量依賴性，各濃度組的相應顯影條帶的相對灰度值比較，差異具有統計學意義（?P＜0．05，??P＜0．01，圖 4）．

圖4 TP抑制MDA-MB-231細胞PLD1和cyclin D1 mRNA及蛋白表達

3 討論

哺乳類動物PLD1和PLD2兩種亞型在不同組織和細胞類型中表達水平及其在亞細胞分布和活性調節等方面均存在明顯差異．一般認為，PLD1在蛋白激酶C和一些小分子GTP酶等有絲分裂原信號的刺激下可被直接激活，PLD1活化后亦可通過其水解產物磷脂酸激活 PLD2［1］．根據目前研究［3，8］報道，結合從Oncomine集合數據庫提取的PLD1 mRNA水平的變化與乳腺癌的關系，PLD1參與乳腺癌的發生發展，但其在乳腺癌中的研究仍未獲得一致結論．

通常認為，雌激素受體陰性的MDA-MB-231細胞能在裸鼠中形成低分化癌，而4T1是6-硫鳥嘌呤抗性細胞株，能在BALB／c小鼠中自發產生高轉移腫瘤，其生長特性與人體晚期乳腺癌接近．本研究發現PLD1 mRNA及其蛋白在人正常乳腺上皮細胞MCF10A中幾乎不表達，在人乳腺癌細胞株MCF-7中表達增加，而在人乳腺癌細胞株MDA-MB-231以及小鼠乳腺癌細胞株4T1中PLD1蛋白表達水平則更是高達MCF10A的20倍，這一結果進一步證實，PLD1表達增加與腫瘤細胞惡性程度呈正相關．對乳腺癌的病理特征研究也發現，基底樣腫瘤的標志物細胞角蛋白5／17高表達的乳腺癌細胞中，其PLD1呈現出異常高表達，而且臨床預后相對較差［8］．三陰型乳腺癌即雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均陰性表達的乳腺癌，是乳腺癌各亞型中預后極差的一類．本研究中所檢測的三種乳腺癌細胞株中，MDA-MB-231屬于三陰型乳腺癌細胞株，其PLD1 mRNA及其蛋白的表達水平亦最高．

研究［1，12］表明，PLD1 表達和活性增加會增強腫瘤細胞耐藥性，而誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的一種重要途徑，PLD1提供促生存抗凋亡的機制之一是活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白．由此推測，針對PLD1的抗腫瘤藥物應該能減少耐藥性的形成．另外，MDA-MB-231細胞表達WNT7B（Wnt家族7B）癌基因．已知Wnt信號參與乳腺發育、與乳腺癌的發生發展密切相關，而PLD1可通過正反饋調節Wnt／βcatenin信號通路［13-15］．因此，以 PLD為靶點開發抗癌藥物具有廣泛的應用前景［16］．本研究表明TP不僅可以從轉錄水平下調MDA-MB-231細胞PLD1 mRNA，也能抑制 PLD1 蛋白表達，這與 Kang等［10］的研究結果一致．cyclin D1是Wnt／β-catenin信號通路下游的最常見靶基因之一，在維持細胞增殖中起重要作用．本研究還發現TP可以同時在mRNA水平和蛋白水平下調cyclin D1表達量，提示TP抑制腫瘤細胞增殖的作用機制與Wnt／β-catenin信號通路有關．如果PLD1對Wnt信號通路在乳腺癌細胞中的活性影響及作用機制能夠得以進一步闡明，將對以PLD1為靶點開發抗癌藥物具有重要的指導作用．

綜上所述，本研究結果表明PLD1在惡性程度高的乳腺癌細胞株中表達增高，提示其在乳腺癌發生發展中起重要作用．針對TP抗腫瘤作用機制的進一步研究，有望為治療PLD1高表達乳腺癌的藥物研發提供重要依據．

［1］ Nelson RK，Frohman MA．Physiological and pathophysiological roles for phospholipase D［J］．J Lipid Res，2015，56（12）：2229-2237．

［2］ Bruntz RC， Lindsley CW， Brown HA．Phospholipase D signaling pathways and phosphatidic acid as therapeutic targets in cancer［J］．Pharmacol Rev，2014，66（4）：1033-1079．

［3］ Gomez-Cambronero J．Phosphatidic acid， phospholipase D and tumorigenesis［J］．Adv Biol Regul，2014，54：197-206．

［4］ Shen Q， Stanton ML， Feng W， et al．Morphoproteomic analysis reveals an overexpressed and constitutively activated phospholipase D1-mTORC2 pathway in endometrial carcinoma［J］．Int J Clin Exp Pathol，2011，4（1）：13-21．

［5］ Zhang J， Bian Z， Zhou J， et al．MicroRNA-638 inhibits cell proliferation by targeting phospholipase D1 in human gastric carcinoma［J］．Protein Cell，2015，6（9）：680-688．

［6］ Xiao J， Sun Q，Bei Y，et al．Therapeutic inhibition of phospholipase D1 suppresses hepatocellular carcinoma［J］．Clin Sci （Lond），2016，130（13）：1125-1136．

［7］ Siegel RL， Miller KD， Jemal A．Cancer statistics， 2016［J］．CA： A Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30．

［8］ Gozgit JM，Pentecost BT，Marconi SA，et al．PLD1 is overexpressed in an ER-negative MCF-7 cell line variant and a subset of phospho-Akt-negative breast carcinomas［J］．Br J Cancer，2007，97（6）：809-817．

［9］ Meng C，Zhu H， Song H，et al．Targets and molecular mechanisms of triptolide in cancer therapy［J］．Chin J Cancer Res，2014，26（5）：622-626．

［10］ Kang DW，Lee JY，Oh DH，et al．Triptolide-induced suppression of phospholipase D expression inhibits proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells［J］．Exp Mol Med，2009，41（9）：678-685．

［11］ Li H， Pan GF， Jiang ZZ， et al．Triptolide inhibits human breast cancer MCF-7 cell growth via downregulation of the ERα-mediated signaling pathway［J］．Acta Pharmacol Sin，2015，36（5）：606-613．

［12］ Liu Y， K?ch A， Ziegler U， et al．The role of phospholipase D in modulating the mTOR signaling pathway in polycystic kidney disease［J］．PLoS One，2013，8（8）：e73173．

［13］陳永霞，云 芬，施 琳，等．與乳腺癌的發生發展相關的靶基因研究簡介［J］．轉化醫學電子雜志，2017，4（5）：21-24．

［14］ Yeo EJ， Cassetta L， Qian BZ， et al．Myeloid WNT7b mediates the angiogenic switch and metastasis in breast cancer［J］．Cancer Res，2014，74（11）：2962-2973．

［15］ Kang DW，Lee SH，Yoon JW，et al．Phospholipase D1 drives a positive feedback loop to reinforce the Wnt／beta-catenin／TCF signaling axis［J］．Cancer Res，2010，70（10）：4233-4242．

［16］ Bruntz RC， Lindsley CW， Brown HA．Phospholipase D signaling pathways and phosphatidic acid as therapeutic targets in cancer［J］．Pharmacol Rev，2014，66（4）：1033-1079．

Expression of phospholipase D1 （PLD1）in breast cancer cells and the intervention of triptolide on PLD1

GU Qu-Liang， KUAI Yi-He， CHEN Jia-Yuan， LI Jiang-Chao，WANG Li-Jing
Vascular Biology Research Institute， School of Basic Sciences，Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China

AIM： To investigate the expression of phospholipase D1（PLD1） in different breast cancer cells and its role in the effects of traditional Chinese medicine triptolide（TP） on human breast cancer cells．METHODS： The expression levels of PLD1 mRNA and PLD1 protein in human breast epithelial cells and cancer cell lines were determined by RT-PCR and Western Blot．The effect of TP on cancer cell proliferation was examined by MTT assay in MDA-MB-231 cells．Meanwhile， PLD1 and cyclin D1 expression in triptolide-treated human breast cancer cells were also determined by RT-PCR and Western Blot．RESULTS：Expression levels of both PLD1 mRNA and protein were higher in breast cancer cells including MCF7，MDA-MB-231 and 4T1 than those of normal breast epithelial cell（MCF10A）， with expression level of PLD1 protein in MDA-MB-231 cell roughly 20 times that of MCF10A cells．Furthermore， expression of PLD1 and cyclin D1 reduced while MDA-MB-231 cell proliferation was inhibited by TP treatment．CONCLUSION： Higher expression of PLD1 in human MDA-MB-231 breast cancer cells is associated with its role in the development and progression of breast cancer．TP down-regulated PLD1 expression in the breast cancer cell line，which provides evidence for developing PLD1-targeted therapeutics for breast cancer with high expression of PLD1．

phospholipase D1； breast cancer cells； breast epithelial cells；triptolide

R737．9；R285

A

2095-6894（2017）11-27-04

2017-06-08；接受日期：2017-06-28

國家自然科學基金（31471290，81472336）

顧取良．博士，副教授．研究方向：腫瘤分子病理學．

E-mail：qlgu＠ gdpu．edu．cn

王麗京．博士，教授．研究方向：炎癥與腫瘤病理學．

E-mail：wanglijing＠ gdpu．edu．cn