黃秋葵對糖尿病小鼠的降血糖作用

馮冠英，宋曉雪，徐志立，欒澤柱，張明波 （遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

黃秋葵對糖尿病小鼠的降血糖作用

馮冠英，宋曉雪，徐志立，欒澤柱，張明波 （遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的：探究黃秋葵水提液對糖尿病小鼠的治療作用及作用機制．方法：用四氧嘧啶進行糖尿病小鼠造模；用黃秋葵水提物對糖尿病小鼠進行灌胃，考察糖尿病小鼠的血糖變化．利用分子對接方法，考察黃秋葵所含成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用．結果：黃秋葵水提液能夠降低糖尿病小鼠的血糖（P≤0．01），并呈一定劑量依賴性．黃秋葵中所含甾醇類成分可與α-葡萄糖苷酶穩定結合，其中有5個化合物與α-葡萄糖苷酶結合自由能在-9．9 kcal／mol以下．結論：黃秋葵水提液能夠有效降低糖尿病小鼠的血糖，其作用機制可能是其中所含的甾醇類成分抑制α-葡萄糖苷酶的活性．

黃秋葵；糖尿病；水提物；降糖作用

0 引言

黃秋葵（Hibiscus esculentus L．），又名秋葵，是錦葵科秋葵屬一年生草本植物．黃秋葵的種植起源于非洲，具有悠久的栽培歷史．20世紀90年代初，黃秋葵被引入我國，現在全國各地均有栽培．黃秋葵是一種具有較高經濟價值的蔬菜，其果實、莖、葉、花、種子都具有一定的開發利用價值．黃秋葵含有豐富的粘性糖蛋白、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質和黃酮類化合物，既可以作為高檔蔬菜，又可以開發成新型的保健食品．研究［1］表明黃秋葵果實具有豐富的營養和多種保健作用．楊毅等［2］通過小鼠負重力竭游泳實驗發現黃秋葵水提物具有良好的抗疲勞作用．據報道［3］，黃秋葵多糖對人體腫瘤細胞的增殖具有抑制作用．另有研究［4］表明黃秋葵總黃酮類成分在體外具有抗氧化作用．

世界衛生組織和國際糖尿病聯盟［5］預測，到2025年全球將有2．99～3．8億糖尿病患者．越來越多的流行病學資料表明，新增患者主要集中在中國、印度等發展中國家．糖尿病與冠心病、腫瘤已成為當前影響人類健康的三大非傳染性疾病．目前，糖尿病在治療上主要有注射胰島素、口服磺酰脲類和雙胍類降糖藥物等，但是這些藥物都不同程度地存在一定的副作用［6］．此外，糖尿病在醫療和生活質量方面的高昂代價亦使得人們越來越關注糖尿病的替代療法，利用植物中天然成分來改善及調節糖尿病患者的病情，已成為現階段研究的熱點問題之一．因此，從天然產物中尋找和開發高效低毒的治療糖尿病的藥物，具有重要意義．

張靈敏等［7］研究表明黃秋葵可以降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平．民間也有人發現食用黃秋葵果實具有一定的降糖作用，但也有人對此存疑．本研究通過糖尿病小鼠動物實驗，進一步明確黃秋葵的降糖作用；并利用分子對接方法，對黃秋葵降糖的活性成分和作用機制進行了初步研究，為黃秋葵作為保健食品的進一步開發和利用奠定了基礎．

1 材料和方法

1．1 材料和儀器 黃秋葵購自山東煙臺，經遼寧中醫藥大學藥學院翟延君教授鑒定為錦葵科秋葵屬植物黃秋葵．4周齡SPF級昆明種小鼠90只，雌雄各半，體質量（20±2）g；嚙齒動物基礎飼料（粉狀），購自遼寧省實驗動物資源中心，動物生產許可證：SCXK（遼）2015-0001；四氧嘧啶（Alloxan，美國 Sigma公司）；鹽酸二甲雙胍緩釋片（山東司邦得制藥有限公司）；血糖試紙及測試儀（三諾生物傳感股份有限公司）；電子天平；旋轉蒸發儀．

1．2 實驗方法

1．2．1 黃秋葵的制備 取新鮮黃秋葵果實，洗凈切成小塊狀，粉碎機粉碎得質量為189．97 g的黃秋葵勻漿．按照1∶5的料液比加入去離子水950 mL進行浸提，浸提15 h．將得到的浸提液分別稀釋和濃縮1倍，作為低濃度和高濃度樣品，原提取液作為中濃度樣品，冷藏備用．

1．2．2 糖尿病動物模型的建立及分組 試驗分空白對照組、模型對照組、陽性對照組、高濃度組、中濃度和低濃度組共6組．購回的小鼠，適應性喂養3 d后，隨機分成兩組，一組為空白對照組（n＝6），另一組為糖尿病造模組．糖尿病造模組小鼠于禁食12 h后腹腔注射四氧嘧啶致糖尿病，四氧嘧啶造模用量分別170 mg／kg，60 mg／kg，因血糖值未完全升高，4 d 后按用量 80 mg／kg，160 mg／kg 繼續給藥，空白對照組注射等體積生理鹽水．72 h后稱重、斷尾采血，測空腹血糖值．以血糖值＞10 mmol／L作為造模成功標準，除去空白對照組（n＝6）及血糖值未達標小鼠，成模率為59．3%．按照血糖值均衡原則將造模成功小鼠分成5組，每組10只．

1．2．3 黃秋葵的降糖作用 隨機分組后次日開始每天用相應藥物進行灌胃，分為黃秋葵高、中、低三個濃度組，陽性對照藥為二甲雙胍，空白對照組則用等體積生理鹽水灌胃，灌胃量為 0．1 mL／10 g，共 15 d．灌胃結束后，禁食12 h，斷尾取血測其血糖值，每日觀察記錄小鼠進食、飲水、尿量及皮毛、活動等情況．

1．2．4 活性成分的虛擬篩選 根據文獻［8］報道，收集黃秋葵中已知化學成分61個，建立化合物數據集．從蛋白質結構數據庫下載得到α-葡萄糖苷酶的晶體結構（3TOP．PDB）［9］．利用 Autodock Tool軟件完成對蛋白晶體結構的處理，去掉結晶水，加上極性氫原子，并給所有原子加電荷．對于數據集中的化合物作類似的處理，保存成pdbqt格式．根據晶體結構中原有配體的位置，確定活性位點的中心位置為（-30．97 ?，36．36 ?，25．01 ?），網格盒子（Grid Box）大小設置為20 ?×20 ?×20 ?．分子對接用 Autodock Vina［10］軟件實現，其余參數均采用缺省值．

1．3 統計學處理 采用SPSS19．0統計學軟件對數據進行分析，實驗數據均用±s表示，多組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（least significant difference， LSD），P＜0．05 表示差異具有統計學意義．

2 結果

2．1 黃秋葵對糖尿病小鼠血糖及體質量的影響 模型組小鼠的血糖均達到了10．74 mmol／L以上，顯著高于空白對照組，差異具有統計學意義（P≤0．01），且小鼠精神萎靡，活動明顯減少，皮毛干燥粗糙而稀疏，具有多飲、多尿的癥狀．模型組小鼠的平均體質量明顯低于空白對照組小鼠的體質量，差異具有統計學意義（P≤0．01），說明糖尿病小鼠模型造模成功．在灌胃15 d后，給藥組小鼠的血糖較模型對照組至少低 3 mmol／L，差異具有統計學意義（P≤0．05），說明黃秋葵水提物能夠在一定程度上降低糖尿病小鼠的血糖，降糖效果和陽性藥物二甲雙胍具有一定可比性．其中，高劑量組灌胃前后降糖作用最顯著（P≤0．01），說明黃秋葵降糖存在一定的量效關系．灌胃15 d后小鼠體質量均有所增加，但空白對照組、給藥組與模型對照組相比體質量顯著增加，差異具有統計學意義（P≤0．01，表1），說明黃秋葵可以改善小鼠的糖尿病癥狀．

表1 糖尿病小鼠的空腹血糖值變化

2．2 黃秋葵對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 分子對接計算結果表明，所考察的黃秋葵中包含61種化合物與α-葡萄糖苷酶的結合自由能均處于-10．2和-7．1 kcal／mol之間，說明這些成分對于 α-葡萄糖苷酶具有不同程度的抑制作用．從化合物的種類來看，結合能較低的以甾醇類化合物為主．我們給出了5個代表性甾醇類化合物的結合自由能及抑制常數（表2）．這些物質的結合自由能比較接近，最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮（-10．2 kcal／mol） 與最高的 β-谷甾醇（-9．9 kcal／mol）僅差了-0．3 kcal／mol．我們也給出了這五個活性物質與葡萄糖苷酶的結合構象（圖1）．從中可以看出，α-葡萄糖苷酶的活性位點具有較強的疏水性（圖中灰色區域）．這五個甾醇類化合物與α-葡萄糖苷酶的結合構象十分類似，即均將疏水的一端插入空腔的內部，而含有親水的羰基或羥基的暴露在外面．對結合能最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮與α-葡萄糖苷酶的結合模式作了進一步分析（圖2）．可以看出，豆甾-4-烯-3，6-二酮利用自身的疏水性與在α-葡萄糖苷酶的活性位點的一些疏水性殘基，包括PHE1559，PHE1560、TYR1251、TRP1355、TRP1369 等形成疏水相互作用．值得指出的是，豆甾-4-烯-3，6-二酮中6位的羥基作為氫鍵受體與ARG1460上的胍基形成氫鍵相互作用，而其余四個化合物與α-葡萄糖苷酶之間則不存在這種強相互作用．這也許是豆甾-4-烯-3，6-二酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用稍強的原因．

表2 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數

圖1 甾醇類化合物與α-葡萄糖苷酶的對接構象

圖2 豆甾-4-烯-3，6-二酮與α-葡萄糖苷酶作用模式分析

3 討論

化學物質誘導糖尿病動物模型是應用化學物質損傷胰腺β細胞，從而引發動物的糖尿病．目前常用藥物有鏈脲菌素和四氧嘧啶［11］．由于四氧嘧啶能夠快速成模，在小鼠糖尿病模型中比較常用，故本研究采用四氧嘧啶造模．對于糖尿病小鼠模型，經過15 d的灌胃后，通過測定小鼠的空腹血糖值發現，給藥組小鼠血糖較模型組均有所降低（P≤0．05），據此推斷黃秋葵有一定的降糖作用．此結果與張靈敏等［7］的研究結果基本一致．利用分子對接方法，以α-葡萄糖苷酶為靶標，我們對黃秋葵中所含的化學成分進行了篩選．結果表明黃秋葵中甾醇類成分對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用．這說明抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低小鼠的糖吸收，是黃秋葵發揮降糖作用的可能機制之一．Sabitha等［12］曾研究了黃秋葵種皮和種子粉末對抗糖尿病和抗高血脂的生理活性，其中活性物質主要是由半乳聚糖、阿拉伯聚糖、果膠類多糖及少量糖蛋白組成的混合物．果膠類多糖為可溶性纖維，能夠降低血糖，提高胰島素敏感性［13-14］．有研究［15］表明，多糖在恢復胰島β細胞功能的同時，對于改善糖代謝，抑制肝糖輸出起著極為重要的作用，并能修復受損的胰島組織與肝組織細胞．由此推測，黃秋葵的降糖作用應該是多組分多靶點協同作用的結果．

4 結語

本研究以小鼠糖尿病模型為研究對象，結果表明黃秋葵水提物可以降低糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠多飲、多食、多尿等癥狀．分子對接結果表明，黃秋葵中的甾醇類成分可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，是黃秋葵降糖作用的可能機制之一．我們的研究結果證實，黃秋葵具有一定的降糖作用，值得進一步開發．

［1］薛志忠，劉思雨，楊雅華．秋葵的應用價值與開發利用研究進展［J］．保鮮與加工，2013，13（2）：58-60．

［2］楊 毅，金祖漢，毛培江，等．黃秋葵提取物抗疲勞的實驗研究［J］．中國現代應用藥學，2012，29（12）：1091-1094．

［3］任丹丹，陳 谷．黃秋葵多糖組分對人體腫瘤細胞增殖的抑制作用［J］．食品科學，2010，31（21）：353-356．

［4］劉愛敬，廖爭爭，郭 琳，等．大孔樹脂純化黃秋葵黃酮及其體外抗氧化活性研究［J］．食品工業科技，2015，36（16）：284-288．

［5］劉國良．糖尿病診斷治療的最新進展［J］．中國實用內科雜志，2000，20（1）：29-32．

［6］謝立凱，齊晨蕊，孫亞東．糖尿病治療藥物的研究進展［J］．中國實用醫藥，2015（21）：279-280．

［7］張靈敏．黃秋葵水提物對Ⅱ型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響［J］．食品工業科技，2015，37（3）：355-363．

［8］郭明明．黃秋葵乙酸乙酯部位和正丁醇部位化學成分研究［D］．鄭州：鄭州大學，2012．

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［13］孫元琳，湯 堅．果膠類多糖的研究進展［J］．食品與機械，2004，20（6）： 60-63．

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［15］金 暉．南瓜多糖的功能性質及其降糖作用機制研究［D］．杭州：中國計量學院，2013．

The hypoglycemic action of oksa on diabetic mice

FENG Guan-Ying， SONG Xiao-Xue， XU Zhi-Li， LUAN Ze-Zhu，ZHANG Ming-Bo
Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

AIM： To investigate the effect of water extract of oksa on diabetes mellitus（DM） model mice and the underlying mechanism．METHODS： The diabetic mice model was established by feeding alloxan；The diabetic mice was fed with water extract of oksa once a day；Then the variations in the blood glucose of the model mice was measured daily．The inhibitors of α-glucosidase contained in oksa was screened with molecular docking method．RESULTS： Water extract of oksa can reduce the concentration of blood glucose of model mice （P≤0．01） in a dose-dependant way．Sterol ingredients contained in oksa can stabilize with α-glucocidase， among which there are five compounds with binding free energies lower than-9．9 kcal／mol．CONCLUSION：Oksa may play a role in reducing the blood glucose of model mice in which α-glucocidase activity was inhibited by its sterol ingredients．

oksa； diabetes； water extract； hypoglycemic action

R285．5

A

2095-6894（2017）11-44-04

2017-05-30；接受日期：2017-06-18

遼寧省大學生創新項目（201510162000020）

馮冠英．研究方向：保健食品．

E-mail：fengguanying＠ 126．com

張明波．博士，副教授．研究方向：藥物虛擬篩選和中藥藥效物質基礎．E-mail：mbzhang＠ 126．com