遠志湯有效成分對APP/PS1小鼠氧化損傷的保護作用機制研究*

董海影，叢歡，王俊蘋，弓箭，柏青楊

（齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

遠志湯有效成分對APP/PS1小鼠氧化損傷的保護作用機制研究*

董海影，叢歡，王俊蘋，弓箭，柏青楊

（齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的通過觀察遠志湯有效成分即β-細辛醚+遠志皂苷（TEN）對APP/PS1雙轉基因小鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/糖原合成激酶3β（GSK-3β）信號通路的調控，探討遠志湯防治阿爾茨海默病（AD）的作用機制。方法將3月齡APP/PS1雙轉基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組（0.33 mg/kg·d）、β-細辛醚+TEN低、中和高劑量組[18.5、37.0和74.0 mg/（kg·d）]，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對照組，采用Morris水迷宮法和新物體識別實驗檢測小鼠的學習記憶能力，采用分光光度法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性，以及丙二醛（MDA）含量。采用Western blot檢測GSK-3β、Akt，以及兩者磷酸化蛋白表達。結果β-細辛醚協同TEN可增強APP/PS1雙轉基因小鼠的學習記憶功能，同時還能升高SOD、CAT和GSH-PX的活性，降低MDA含量，誘導Akt的蛋白表達，抑制GSK-3β的表達。結論遠志湯有效成分即β-細辛醚+TEN可通過調控PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，對APP/PS1雙轉基因小鼠氧化應激損傷發揮保護作用。

β-細辛醚；遠志皂苷；APP/PS1雙轉基因小鼠；PI3K/Akt/GSK-3β信號通路

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是由多方、多種和多層次因子共同引發而成，其中“自由基損傷”這一因素在AD發病機制的關鍵環節中起著至關重要的作用，在AD疾病發生的早期即已出現氧化應激，先于老年斑形成，以及神經元纖維纏結的出現[1-2]。AD的致病因素錯綜復雜，是多種神經遞質和病理代謝產物相互協同促發而成，導致其靶向治療藥物開發困難。目前經由美國FDA批準，臨床上廣泛使用的，治療AD的藥物僅有幾個，但幾乎均為膽堿酯酶抑制劑，其遠期療效并不理想，也使臨床治療存在諸多困難[3]。因此，研究我國具有知識產權的抗AD創新藥物和新方法是當前一項十分緊迫的研究任務。

臨床上運用中醫的“整體觀念”與“辨證論治”防治AD，有效地緩解了疾病的進程，改善了患者的生活狀態，有效地減輕了家庭和社會的負擔[4]。中藥復方多方位、多靶點和整體調控的優勢，與AD多種致病因素互為因果的特點相互契合。其中石菖蒲-遠志藥是治療AD方劑的基本結構，用藥頻率為34%[5]。

本論文就是在上述研究基礎上，依托選自《政和圣濟總錄》的遠志湯（由遠志和石菖蒲按照1∶1配伍而成），觀察石菖蒲的有效成分β-細辛醚（β-asarone）與遠志的有效成分遠志皂苷（Tenuigenin，TEN）協同作用于APP/PS1雙轉基因小鼠，分析β-細辛醚+TEN對APP/PS1雙轉基因小鼠磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinase B，AKt）/糖原合成激酶 3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）通路的影響，從而進一步探討遠志湯對氧化應激損傷的保護作用和治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

β-細辛醚由天津一方科技有限公司提供（CAS：00011017-T9K），TEN由南京景竹生物科技有限公司提供（CAS：JZ20160327A），經HPLC測定，純度均≥98%，鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrochloride tablets，DHT）由衛材（中國）藥業有限公司提供（CAS：C14200012042），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）均由南京建成生物工程研究提供（CAS：20150422、20150423、20150423和20150417），Akt和GSK-3β一抗均由美國Cell Signaling Technology公司提供（CAS：9315S、27C10）。

1.2 動物

APP/PS1雙轉基因小鼠（南京生物醫藥研究院，編號D000268），3月齡，50只，雄性；C57BL/6J小鼠，3月齡，10只，雄性。飼養于齊齊哈爾醫學院實驗動物中心SPF級飼養室。

1.3 分組和給藥

將3月齡APP/PS1雙轉基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組[0.33 mg/（kg·d）]和藥物低、中和高劑量組 [18.5、37.0和 74.0 mg/（kg·d），均由β-細辛醚和TEN按照1∶1配制而成]，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對照組，空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水（normal saline，NS）灌胃，1次/d，連續灌胃90 d。

1.4 Morris水迷宮檢測

給藥結束后進行Morris水迷宮行為測試。水迷宮為一直徑150 cm，高60 cm的不銹鋼圓形水池，水池側壁上配備一長桿，上懸掛紅外攝像頭。水迷宮內設置一座底面為6 cm×10 cm，高為40 cm的有機玻璃平臺。以水迷宮中心點為原點，在迷宮的側壁上標明東、南、西、北4個方向的入水點。標明入水點后，將平臺放在迷宮西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮內注入水，水溫控制在（22±1）℃，加入奶粉后，迷宮中上位水線高于安全平臺1 cm，訓練期環境保持安靜與參照物不變。訓練期間任選東、南、西、北4個方向的入水點，將小鼠面向迷宮壁放入池中，訓練間隔為60 s。

1.4.1 定位航行實驗 為期5 d，4次/d，選擇迷宮側壁的東向為入水點，攝像頭記錄小鼠的游泳軌跡圖與逃避潛伏期，即小鼠找到水下平臺的時間，設定逃避潛伏期的時限為2 min。

1.4.2 空間探索實驗 定位航行實驗結束后將水下平臺撤除，在同一入水點將小鼠面向池壁放入水中，讓小鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺，記錄在2 min內跨過原平臺位置的次數。

1.4.3 新物體識別實驗 檢測箱為60 cm×40 cm×80 cm，由黑色聚酯塑料材質構成的封閉箱，箱左右內側壁鑲嵌LED燈條，頂部懸掛攝像頭觀察動物的活動情況及探索過程。實驗檢測過程分為適應期、熟悉期和測試期3個階段。①適應期：為期3 d，每天將小鼠依次放入檢測箱內，熟悉環境10 min；②熟悉期：第4天，將2個完全相同的正方體紅色積木塊放入檢測箱內對稱的位置處，兩個積木距離箱側壁與箱后壁的距離均為10 cm，將小鼠放入熟悉5 min；③測試期：間隔30 min后，將一個紅色積木替換為大小相近的綠色圓柱形積木，將小鼠放入檢測箱內，記錄5 min內小鼠對新穎物體即綠色圓柱形積木（T novel，TN）和紅色正方體即熟悉物體（T familiar，TF）的探索時間，以小鼠鼻尖距被識別物體的距離不超過2 cm或用鼻子接觸到被識別物體為探究行為。應用認知指數（recognition index，RI）來評價動物的學習記憶能力，計算公式為RI=TN/（TN+TF）×100%。

1.5 SOD、CAT和GSH-PX活力檢測以及MDA含量測定

Morris水迷宮檢測與新物體識別實驗結束后，小鼠禁食12 h。于第2天，快速斷頭取腦，借助組織鉗沿著枕骨大孔，向左右分開顱骨，取出大腦，在冰盤上分離皮層和海馬組織，勻漿，離心，獲取上清液，用酶標法檢測SOD，硫代巴比妥酸法檢測MDA，分光光度法檢測CAT，比色法檢測GSH。

1.6 Western blot檢測AKt、GSK-3β以及磷酸化蛋白水平

冰盤上分離海馬組織，剪碎置于EP管中，加入組織裂解液，研磨裂解30 min，離心取上清，測定蛋白含量。檢查和組裝玻璃板，灌注分離膠液，制備膠板，取蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸變性，電泳分離，轉至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂牛奶封閉，加入一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗孵育，顯影成像。掃描膜后應用Image J2x分析軟件分析條帶灰度，通過半定量比較分析Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白的表達水平。

1.7 統計學方法

采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎上，再行SNK-q或LSD-t進行兩兩比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 β-細辛醚+TEN對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 Morris水迷宮檢測結果 第5天定位航行實驗檢測發現，與空白對照組相比，模型組在第3象限停留時間（residence time in the third quadrant，RTQ）、跨越隱匿平臺的次數、逃逸潛伏期及入水朝向角度差異有統計學意義（P＜0.05），模型組小鼠RTQ和跨越隱匿平臺的次數減少，逃逸潛伏期延長，入水朝向角度增加；與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組和藥物各劑量組的RTQ、跨越隱匿平臺的次數、逃逸潛伏期及入水朝向角度差異有統計學意義（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊組和藥物各劑量組的RTQ和跨越隱匿平臺的次數增加，逃逸潛伏期縮短，入水朝向角度減小。見表1和圖1。

表1 β-細辛醚+TEN對各組小鼠空間學習記憶能力的影響 （n =10，±s）

表1 β-細辛醚+TEN對各組小鼠空間學習記憶能力的影響 （n =10，±s）

注：1）與空白對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 RTQ/s 跨越隱匿平臺的次數 入水朝向角度/（°） 逃避潛伏期（第5天）/s空白對照組 33.16±5.77 5.82±1.19 40.50±26.39 8.17±11.49模型組 14.61±4.851） 1.20±0.691） 67.52±34.961） 66.56±20.071）鹽酸多奈哌齊組 29.08±8.302） 4.93±1.382） 45.25±27.452） 25.22±2.342）藥物低劑量組 23.53±7.44 3.48±0.892） 47.73±20.162） 32.56±10.042）藥物中劑量組 27.65±6.012） 4.62±0.932） 44.20±17.332） 22.14±8.302）藥物高劑量組 30.85±7.932） 5.16±1.522） 42.09±15.752） 14.07±6.102）F值 39.91 80.924 8.095 57.224 P值 0.000 0.000 0.002 0.000

2.1.2 新物體識別實驗檢測結果 模型組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組小鼠RI降低（q=6.222）；鹽酸多奈哌齊和藥物各劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊組、藥物各劑量組APP/PS1雙轉基因小鼠的RI升高（q=4.834、4.287、4.775和5.587）。見圖2。

圖1 各組小鼠定位航線實驗軌跡圖

2.2 各組小鼠SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量的比較

模型組小鼠腦皮層與海馬SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量的影響與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組SOD、CAT和GSHPX活性降低，MDA含量增高；鹽酸多奈哌齊和藥物各劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊組和藥物各劑量組SOD、CAT和GSHPX活性升高，同時MDA含量降低，且大體上呈現劑量依賴效應（見表2）。

2.3 β-細辛醚+TEN對PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響

圖2 β-細辛醚+TEN 對各組小鼠認知指數的影響 （n =10，±s）

表2 各組小鼠SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量的比較 （n =10，±s）

表2 各組小鼠SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量的比較 （n =10，±s）

注：1）與空白對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 GSH-PX/（u/mg） MDA/（nmol/mg） SOD/（u/mg） CAT/（u/mg）空白對照組 609.69±45.59 7.75±1.36 33.59±3.08 30.89±2.81模型組 314.61±54.311） 15.17±4.771） 17.30±2.151） 13.12±1.081）鹽酸多奈哌齊組 411.26±30.172） 10.12±2.66 23.19±4.482） 21.78±3.752）藥物低劑量組 528.72±30.452） 8.00±1.942） 29.47±3.222） 25.17±2.492）藥物中劑量組 579.82±38.752） 7.47±0.992） 30.77±2.93 2） 28.03±3.292）藥物高劑量組 411.26±30.172） 10.12±2.66 23.19±4.482） 21.78±3.752）F值 68.734 17.440 75.477 96.048 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

Western blot檢測結果表明，與空白對照組比較，模型組即APP/PS1雙轉基因小鼠的p-Akt和p-GSK-3β的蛋白表達水平差異有統計學意義（P＜0.05），模型組降低（q=13.330和12.806）；而鹽酸多奈哌齊和藥物各劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊組和藥物各劑量組p-Akt和p-GSK-3β的蛋白表達增加（q=16.278、11.023、12.433和 17.945；q=18.224、14.119、15.433和19.373），且大體上呈現劑量依賴效應（見圖3）。

圖3 β-細辛醚+TEN對各組小鼠Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響 （n =10，±s）

3 討論

AD是一種以進行性認知功能減退為特征的中樞神經系統退行性疾病。在65歲的老年人群當中發病率約10%，而在85歲以上的老年人群當中發病率可高達47%[6]。中國已經進入了老齡化社會，AD發病率出現了逐年增高的趨勢，給社會和家庭增加了沉重的負擔。

國內外醫療工作者對AD的研究已逾百年，提出了諸多假說，研發了多種藥物，但迄今為止，發表機制尚不十分清楚，療效顯著的藥物尚不十分明晰[7]。氧化應激學說的提出，為攻克AD探索出了一條新途徑，氧化應激發生于AD疾病進展的早期，早于老年斑和神經元纖維纏結的出現[8]。

對抗活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的抗氧化防御體系包括酶系統，如SOD、GSH-PX和CAT，這些酶代表著機體的第一道抗氧化防御體系。其中SOD是體內天然存在的氧自由基清除劑，其活性的高低可以作為機體清除氧自由基能力的指標，而GSH-PX是機體內重要的抗氧化劑，能夠清除自由基，發揮抗氧化作用，而MDA是體內的脂質代謝產物，是脂質過氧化的主要降解產物，其含量的高低可以作為機體細胞受自由基攻擊程度的指標[9]。

PI3K的下游直接作用靶點為蛋白激酶Akt，PI3K/Akt信號途徑下游調節氧化應激的靶基因是GSK-3β[10]。研究發現雌二醇可通過激活AD腦神經細胞中PI3K，進而誘導Akt發揮其神經保護作用[11]。通過美國FDA認證，已經應用于AD臨床治療的乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物和N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）阻滯劑類藥物，均可以通過調控GSK-3絲氨酸9位磷酸化水平來抑制其活性，進而發揮拮抗AD的藥理活性[12]。國內研究亦有報道[13]，PI3K/Akt/GSK-3β通路與學習記憶功能密切相關。雖然實驗研究結果與流行病學的大數據表明，抗氧化治療能保護神經元，拮抗AD樣癥狀，可是臨床上將抗氧化劑維生素等用于治療AD的療效卻差強人意，表明如果想要在抗氧化這一方向上攻克AD，需要尋找更加有效的抗氧化途徑與策略，即需要激活內源性神經元的抗氧化防御系統等。

中醫學認為“痰濁阻滯腦髓”是發病機制復雜AD形成過程中的關鍵環節。如元代醫學家危達齋在其所著的《世醫得效方》中就曾指出“痰迷心包，健忘失事”。《政和圣濟總錄》就這一癥候收錄了民間驗方—由遠志和石菖蒲配伍而成的遠志湯[14]。《神農本草經》將具有祛痰開竅功效的遠志和開竅豁痰效能的石菖蒲歸為醒神益智的神藥。遠志和石菖蒲的主要藥理活性成分分別為TEN和β-細辛醚。

本文主要采用Morris水迷宮和新物體識別實驗檢測遠志湯有效成分，即TEN和β-細辛醚對各組小鼠的學習和記憶能力的影響。模型組小鼠表現出反應遲鈍類似AD患者的行為學癥狀，RTQ與跨越隱匿平臺的次數減少，逃逸潛伏期延長，入水朝向角度增大，認知指數亦降低。而TEN和β-細辛醚能增加模型組小鼠的RTQ與跨越隱匿平臺的次數，縮短逃逸潛伏期，縮小入水朝向角度，提升認知指數，能改善APP/PS1小鼠的學習和空間記憶能力。說明經過β-細辛醚與TEN的協同治療，APP/PS1雙轉基因小鼠的AD樣癥狀得到改善。

本文以APP/PS1轉基因小鼠為依托，研究遠志湯有效成分，即β-細辛醚+TEN抗AD氧化應激作用及對PI3K/Akt/GSK-3β通路信號分子的影響，進而探討復方遠志湯治療AD的作用機制。實驗結果顯示，β-細辛醚+TEN在抑制APP/PS1雙轉基因小鼠SOD、CAT和GSH-PX活性降低與MDA含量升高的同時，還能升高APP/PS1雙轉基因小鼠Akt與GSK-3β磷酸化蛋白表達水平，可見β-細辛醚+TEN能干預體內的氧化應激反應，通過調節體內抗氧化防御體系來發揮抗AD作用。

本研究為闡明遠志湯抑制Aβ誘導的神經元氧化應激的分子調控機制提供實驗依據和理論支持，同時為提出防治AD的新策略和尋找具有新作用靶點的中藥復方提供新思路。

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（張蕾 編輯）

Study on protective effect of effective components of Polygala Decoction on oxidative damage in APP/PS1 double transgenic mice*

Hai-ying Dong, Huan Cong, Jun-ping Wang, Jian Gong, Qing-yang Bai
(Pathological Diagnosis Center, Qiqihar Medical University, Qiqihaer, Heilongjiang 161006, China)

ObjectiveTo observe the regulative effect of β-asarone and Tenuigenin on the PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway in APP/PS1 double transgenic mice, to explore the mechanism of Polygala Decoction in prevention and treatment of Alzheimer’s disease.MethodsThree-month-old APP/PS1 double transgenic mice were divided into model group, Donepezil hydrochloride group (0.33 mg/kg·d), high-dose β-asarone and Tenuigenin group, medium-does β-asarone and Tenuigenin group and low-dose β-asarone and Tenuigenin group (18.5, 37.0 and 74.0 mg/kg·d). C57BL/6 mice of the same age were selected as the control group. Morris water maze test and new object recongnition task were used to measure the spatial learning and memory ability. Spectrophotometer was used to detect the activity of SOD, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-PX) and the content of MDA.Western blot was performed to evaluate the expressions of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), p-GSK-3β, Akt and p-Akt.Resultsβ-asarone and Tenuigenin significantly ameliorated the cognitive defect of APP/PS1 double transgenic mice, increased the activity of SOD, CAT and GSH-PX, while decreased the content of MDA, suppressed the activation of GSK-3β and enhanced the activation of Akt.Conclusionsβ-asarone and Tenuigenin can inhibit the oxidative stress of brain tissue, and exhibit positive therapeutic effect on Alzheimer’s disease by regulating the activity of the PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway.

β-asarone; Tenuigenin; APP/PS1 double transgenic mouse; PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway

R749.1；R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.28.002

1005-8982（2017）28-0006-06

2017-02-11

國家自然科學基金青年項目（No：81403131）

柏青楊，E-mail：b1bqy7@sohu.com