丙酮酸激酶M2蛋白表達與各期胃癌臨床病理特征及預后的相關性分析

陳光俠 何曉華 吳倩倩 高立永 吳傳楠 陳卓

·論著·

丙酮酸激酶M2蛋白表達與各期胃癌臨床病理特征及預后的相關性分析

陳光俠 何曉華 吳倩倩 高立永 吳傳楠 陳卓

目的觀察丙酮酸激酶M2(PKM2)蛋白在胃癌組織表達及其與胃癌臨床病理特征及預后的相關性。方法淺表性胃炎病人20例(對照組)，早期胃癌組32例，進展期胃癌組40例。應用免疫組化技術檢測PKM2蛋白在上述組織中表達情況，并統計分析其表達強度與臨床病理特征和預后的關系。結果對照組和早期胃癌組中PKM2陽性表達率分別為5%(1/20)和61.8%(21/34)，差異有統計學意義(P<0.05)。進展期胃癌組織中PKM2蛋白表達水平與TNM分期、病理分級相關，差異有統計學意義(P<0.05)。早期胃癌PKM2表達強度越高，預后越差(P<0.05)；TNM分期是進展期胃癌預后的獨立影響因素(P<0.05)。結論PKM2蛋白在胃癌組織中表達升高，促進胃癌的發生發展，并影響病人預后。PKM2蛋白表達與進展期胃癌TNM分期、病理分級相關。

胃癌； 丙酮酸脫氫酶2； 臨床病理特征； 預后

有研究表明，丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)的高表達可促進肝癌的轉移，并可作為預后不良的指標，但對非小細胞肺癌的預后評估卻毫無價值[1-2]。PKM2可通過調控轉錄水平Bcl-xL表達從而促進胃癌細胞生長[3]。我們應用免疫組化技術檢測20例淺表性胃炎，32例早期胃癌及40例不同分期的進展期胃癌PKM2蛋白的表達，并分析其表達與胃癌臨床病理特征及預后的關系。

對象與方法

一、對象

2006年1月～2013年12月，我院行胃癌切除的胃癌組織標本40例(進展期胃癌組)，行早期胃癌外科切除的早期胃癌標本32例(早期胃癌組)，內鏡下活檢淺表性胃炎組織標本20例(對照組)，術前均未行放療、化療及免疫治療。共92例，其中男性45例，女性47例。年齡21～80歲，平均年齡55.39歲。胃癌的診斷標準及臨床分期參照文獻[4]，早期胃癌診斷標準參照文獻[5]。

二、方法

20例淺表性胃炎、32例早期胃癌及40例進展期胃癌組織蠟塊連續切片，采用免疫組化SP法，按照烤片、水化、抗原修復、封閉，1∶1000比例稀釋PKM2一抗，過夜后加入二抗，DAB顯色、蘇木素襯染、酒精分化，脫水，透明、中性樹膠封片、顯微鏡觀察等步驟進行。兔抗人PKM2抗體均購自Abcam公司，SP檢測試劑盒及DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。PKM2以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，每張切片由2位資深病理專家讀片，于400倍視野下隨機選取5個不同視野，每個視野得分由陽性細胞比例或顯色強度決定。陽性細胞比例≤25%為0分，26～50%為1分，51～75%為2分，≥76%為3分；顯色強度未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

三、統計學處理

應用SPSS 22.0軟件對數據進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，PKM2表達強度與臨床病理因素之間的關系應用Chi-square test或確切概率法，與生存時間的關系采用Kaplan-Meier生存率曲線，運用COX回歸模型進行多因素比例風險分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.PKM2在對照組、早期胃癌組和進展期胃癌組中表達：均值分別為0.05、1.067、1.316，早期胃癌組及進展期胃癌組中PKM2表達水平與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。PKM2的表達水平在早期胃癌組即明顯升高，當腫瘤繼續發展至進展期，雖然其表達水平繼續升高，但在進展期胃癌組與早期胃癌組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

2.PKM2表達與臨床病理參數的關系：早期胃癌組織中PKM2表達陽性21例，陰性11例。PKM2表達與病人年齡、性別、病理分級無明顯相關，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。進展期胃癌組織中PKM2表達陽性28例，陰性12例。PKM2表達與TNM分期、病理分級相關，差異有統計學意義(P<0.05)，與年齡、性別無明顯相關，差異無統計學意義。見表2。

表1 早期胃癌中PKM2表達與臨床病理參數的關系(例)

注：統計方法為確切概率法

表2 進展期胃癌中PKM2表達與臨床病理參數的關系(例)

注：統計方法為Chi-square test

3.PKM2表達與病人預后的關系：所有病例隨訪時間48～94個月，平均72.9個月。20例淺表性胃炎組病人全部完成隨訪，無死亡，存活率100%。32例早期胃癌組病人全部隨訪完成，隨訪率100%，因病死亡3例，采用Kaplan-Meier法對PKM2表達進行累積生存時間分析；PKM2表達強度越高，預后越差(P<0.05)。見圖2A。40例進展期癌病人，失訪23例，失訪率57.5%，存活10例，死亡7例，死亡率17.5%，同樣采用Kaplan-Meier法對PKM2表達進行累積生存時間分析，PKM2表達與預后無明顯相關(P>0.05)。見圖2B。

(A)早期胃癌PKM2表達強度越高，預后越差(χ2=11.677，P=0.009)；(B)進展期胃癌PKM2表達強度與預后無關。圖2 不同分期胃癌PKM2表達強度與病人預后的關系

4.胃癌病人生存時間的多因素分析：運用COX回歸多因素模型分別對早期胃癌及進展期胃癌各因素進行分析，各變量賦值如下：年齡：<60歲賦值為0，≥60歲賦值為1；性別：女賦值為0，男賦值為1；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期賦值為0，Ⅲ/Ⅳ期賦值為1；病理類型：中高分化賦值為0，低分化/印戒細胞癌賦值為1；PKM2表達：無表達賦值為0，有表達賦值為1；T表示病人生存時間，單位為月；Y表示病人結局：死亡賦值為0，截尾賦值為1(早期胃癌組無TNM分期，病理類型：中高分化及瘤變賦值為0，低分化/印戒細胞癌賦值為1)。結果發現：早期胃癌COX回歸多因素模型分析，各協變量對病人生存時間的影響差異無統計學意義(P>0.05)。進展期胃癌COX回歸多因素模型(P<0.05)，此檢驗模型具有統計學意義，TNM分期是進展期胃癌預后的獨立影響因素(P<0.05)。在進展期胃癌中各協變量在均值時的生存曲線見圖3。

圖3 進展期胃癌中各協變量在均值時的生存曲線

討 論

全球范圍內，胃癌是第3位癌癥相關的死亡原因[6]。我國胃癌的發病率處于惡性腫瘤的第2位。腫瘤的增殖、浸潤、轉移等生物學行為是引起死亡的重要原因。腫瘤維持其惡性生物學行為需要充足的能量供給，糖代謝是腫瘤最主要的供能方式。根據“Warburg效應”，腫瘤細胞在缺氧或不缺氧條件下，都優先進行糖酵解[7]，PKM2是糖酵解的關鍵酶[8]。有研究表明，在食管鱗癌組織中，PKM2表達升高，且與病人預后不良有關。PKM2亦可促進胃癌細胞增殖，影響病人預后[9-10]。因此，靶向PKM2信號通路成為一種重要的抗腫瘤治療策略[11]。

我們通過免疫組化發現，PKM2的表達水平在對照組僅有1例呈陽性表達，早期胃癌組即明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義。說明在早期胃癌，腫瘤就開始依靠著高水平的糖酵解提供生長代謝的能量來源，而當胃癌繼續發展至進展期，其表達水平繼續升高，但與早期胃癌組比較，差異無統計學意義，說明糖酵解的供能方式貫穿在整個胃癌的進展過程中。行Kaplan-Meier法進行累積生存分析發現，在早期胃癌組織中，PKM2表達強度越高，預后越差。進展期胃癌預后差，5年生存率低，失訪率高。通過COX回歸多因素模型分析，在進展期胃癌組織中，TNM分期的相對危險度是8.925，是預后的獨立影響因素。TNM分期能夠較好的反映腫瘤進展的程度，TNM分期越高，病人預后越差。Angelov等[12]回顧性研究統計分析155例胃癌病人預后與臨床病理參數(包括年齡，性別，血型，腫瘤分化程度，腫瘤位置，手術類型和輔助治療)之間的關系，結果發現，TNM分期是影響病人預后的唯一因素。在進展期胃癌組織中，PKM2表達與TNM分期和病理分級有相關性，但在進一步的COX多因素模型分析中，卻無統計學意義，可能與各協變量之間相互作用及病例樣本量較少有關。

PKM2在胃癌的發生和發展中起到重要作用，阻斷其信號通路，有可能成為腫瘤治療的靶點。有研究表明，二甲雙胍可通過抑制HIF1α/PKM2信號通路，從而抑制腫瘤糖代謝，進一步抑制腫瘤惡性生物學行為[13]。對內鏡下活組織檢查或術后組織切片免疫組化檢測，PKM2可作為判斷早期胃癌病人預后的有用指標。

[1] Liu WR，Tian MX，Yang LX，et al.PKM2 promotes metastasis by recruiting myeloid-derived suppressor cells and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget，2015，6(2)：846-861.

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[3] Kwon OH，Kang TW，Kim JH，et al.Pyruvate kinase M2 promotes the growth of gastric cancer cells via regulation of Bcl-xL expression at transcriptional level[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，423(1)：38-44.

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[10] Kwon OH，Kang TW，Kim JH，et al.Pyruvate kinase M2 promotes the growth of gastric cancer cells via regulation of Bcl-xL expression at transcriptional level[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，423(1)：38-44.

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AcorrelationanalysisoftheexpressionofpyruvatekinaseM2andthepathologyandprognosisingastriccancer

CHENGuangxia，HEXiaohua，WUQianqian，etal.
(DepartmentofGastroenterology，DepartmentofPathology，FirstPeople'sHospitalofXuzhou，Xuzhou221000，China)

ObjectiveTo observe the expression of pyruvate kinase(PK)M2 in gastric cancer(GC)and analyze its relation with the clinicopathological features and prognosis and of GC.MethodsTwenty cases with superficial gastritis were made as control group，32 cases with early gastric carcinoma and 40 cases with advanced GC were made as experiment groups.Immunohistochemistry were used to detect the protein expression of PKM2 in GC tissues from the three groups.And the correlation between the expression level of PKM2 and clinicopathological characteristics and prognosis was analyzed.ResultsThe expression of PKM2 in the control group and early GC group was 5.0%(1/20)and 61.8%(21/34)，respectively，the difference was significant(P<0.05).The expression level of PKM2 was associated with TNM stage(P<0.05)and pathological grade(P<0.01)in the advanced GC group.The higher expression of PKM2 in early GC suggested its poorer prognosis(χ2=11.677，P=0.009).And TNM staging was an independent factor affecting the prognosis of advanced GC(P<0.05).ConclusionThe expression of PKM2 in GC tissue promotes the occurrence，development of GC and impacts on its prognosis.It is associated with TNM stage and pathological grade in advanced GC.

gastric cancer； pyruvate kinase M2； clinicopathological features； prognosis

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.11.019

國家自然科學基金青年項目(81602101)；江蘇省333工程科研項目資助(BRA2016277)；江蘇大學醫學臨床科技發展基金(JLY20160145)；江蘇省衛生廳科技計劃基金(Q201413)；徐州市科技計劃項目(社會發展- KC14SH007)，徐州市衛計委青年后備人才資助(2014002)

221002 江蘇省徐州市第一人民醫院消化科(陳光俠、何曉華、吳倩倩、吳傳楠、陳卓)；病理科(高立永)

何曉華，Email：hexiaohua00@126.com

2017-04-12)

楊澤平)