HPLC雙波長切換同時測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

向采芹，李希,，馮建安，黃嫣

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HPLC雙波長切換同時測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

向采芹1，李希1,2，馮建安2，黃嫣2

目的：建立以雙波長切換方式同時測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量的方法。方法：采用ShimpackVP-ODS C18柱（250 mm×4.6，5 μm）色譜柱，以乙腈(A)-磷酸（0.03%）(B)為流動相進行梯度洗脫：0-10 min，3%-10%(A)；10-20 min，10%-33%(A)；20-25 min，33%-50%(A)；25-30 min，50%-80%(A)；30-35 min，80%(A)；35-37 min，80%-3%(A)；檢測波長：前10 min為278 nm，10-15 min為210 nm,15 min后為278 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，流速為1 mL?min-1。結果：哈巴苷在0.011824-0.11824 mg?mL-1范圍內與哈巴俄苷在0.00416-0.0416 mg?mL-1范圍內線性關系良好。結論：該檢測方法穩定可行 ，可用于同時測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量。

HPLC雙波長切換；玄參藥材；哈巴苷；哈巴俄苷；含量測定

玄參是玄參科(Scrophulariace)玄參屬(Scrophularia)玄參（Scrophularia,ningpoensisHemsl）的干燥根。主要功效是清熱涼血，滋陰降火，補腎益氣[1]。《本草綱目》中提到“腎水受傷，真陰失守，孤陽無根，發為火病，法宜壯水以制火，故玄參與地黃同功。其消瘰疬亦是散火，劉守真言結核是火病”[2]。玄參含環烯醚萜、苯丙素、微量揮發油、植物甾醇、油酸、亞麻酸、糖類、左旋天冬酰胺及生物堿等多種化學成分。具有保護心血管系統，增強免疫力等藥理活性[3]。同時還具有解熱，鎮痛，抗炎，抗腫瘤的藥理作用[4]。本文對玄參的主要成分哈巴苷和哈巴俄苷進行波長轉換法同時測定，對15版藥典將兩個成分分開測定進行改進，使得測定方法更加高效簡便。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1260 高效液相色譜儀 ( 美國安捷倫科技有限公司)；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公司)；BT-125D 型電子天平 ( 賽多利斯科學儀器北京有限公司)；LK-1000A500搖擺式高速中藥粉碎機 ( 浙江溫嶺市創力藥材器械廠制造)。

1.2 藥品

玄參藥材（四川省中藥飲片有限責任公司），哈巴苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號H-021-150729），哈巴俄苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111730-201508）。

1.3 試劑

乙腈、磷酸為色譜純(美國 Fisher 公司)；甲醇為分析純，水為超純水 ( 實驗室自制) 。

2 試驗方法與結果

2.1 對照品的制備

取哈巴苷對照品，哈巴俄苷對照品適量，精密稱定，加入30%的甲醇制成每1 mL含哈巴苷60 μg，哈巴俄苷20 μg的混合對照品溶液。

2.2 玄參藥材溶液的制備

取玄參藥材粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，浸泡一小時，超聲處理（功率500 w，頻率40 KHZ）45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件的確定

本文經過文獻查閱[5-7]，經過實驗對比，最終確定的色譜條件為：AgiLent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器，采用Shim-packVP-ODS C18柱（250 mm×4.6，5 μm）色譜柱，以乙腈(A)-磷酸（0.03%）(B)為流動相進行梯度洗脫：0-10 min，3%-10%(A)；10-20 min，10%-33%(A)；20-25 min，33%-50%(A)；25-30 min，50%-80%(A)；30-35min，80%(A)；35-37 min，80%-3%(A)[1]；檢測波長：前10 min為278 nm，10-15 min為210 nm，15 min后為278 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，流速為1 mL?min-1。

2.4 系統適應性試驗

在上述色譜條件下，按藥典規定，理論塔板數按哈巴苷與哈巴俄苷峰計算不低于5 000，分離度均大于1.5，對稱因子分別為0.9和0.7，其對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 哈巴苷和哈巴俄苷混合對照(A)和玄參對照藥材(B)HPLC圖

2.5 線性關系的考察

分別精密吸取哈巴苷（0.05912 mg?mL-1）對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL及哈巴俄苷（0.0208 mg?mL-1）2、4、6、8、10、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄兩個對照品的含量與峰面積，以哈巴苷和哈巴俄苷的含量為橫坐標（X）（μg），以相應的峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程：哈巴苷：Y = 7002.1X + 1.0837，R2= 0.9999，哈巴俄苷Y = 19827X + 0.9007，R2= 0.9999，表明哈巴苷在0.011824-0.11824 mg?mL-1范圍內與哈巴俄苷在0.00416-0.0416 mg?mL-1范圍內線性關系良好。

2.6 精密度實驗

精密量取所配制的哈巴苷與哈巴俄苷混合對照品，按照“2.3”項下的色譜條件進行連續進樣6次，記錄峰面積，結果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為0.85%、1.01%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性實驗

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得6份供試品溶液，按照“2.3”項下的色譜條件進行6次實驗，記錄峰面積，結果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為1.23%、1.58%，結果表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得1份供試品溶液，分別在2、4、8、10、12、24 h按照“2.3”項下的色譜條件進行實驗，記錄峰面積，結果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為0.96%、1.23%，結果表明供試品在24h內穩定。

2.9 樣品測定

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得玄參藥材供試品溶液，按照“2.3”項下的色譜條件進行實驗，測得的玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量分別為0.1888 μg、0.5046 μg，哈巴苷與哈巴俄苷的總量經計算為0.68%＞0.45%，符合藥典規定。

2.10 耐用性實驗

取同一批樣品，按藥材供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，使用不同品牌色譜柱（分別為Shim-pack VP-ODS柱（250×4.6 mm，5 μm）;AgiLent ZORBAX SB C18（4.6×150 mm，5 μm），進行耐用性試驗，結果哈巴苷的含量分別為0.1865、0.1874 μg，哈巴俄苷的含量分別為0.4899、0.5012 μg。結果表明此方法可行。

3 討論

在制備玄參藥材供試品溶液之前考察玄參藥材粉末的粒度，最終確定藥材粉末能通過2號篩的進行試驗。在玄參藥材供試品溶液制備過程中考察藥材的浸泡時間、超聲提取時間以及提取方式，最終確定的為浸泡1 h，超聲45 min。選擇色譜條件時，考察前15 min均以210 nm的波長進行測定，結果發現，在藥材高效液相色譜圖中出現較多雜峰，分離度不夠，因此在前10min選擇278 nm以排除較多的雜峰，在10-15 min內采用210 nm較好的分離出目標峰，同時選用不同的分離柱考察此方法的耐用性，結果表明此方法穩定可行。本文主要通過HPLC波長切換的方法更加快速簡便高效的同時測定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，解決藥典中兩種成分需進行兩次試驗的繁瑣，同時采用波長切換的方法除去供試樣品中目標峰前后不必要的雜峰，使目標峰達到很好的分離效果，且保持峰面積穩定。可以用于玄參藥材的含量測定方法，對其含玄參的復方制劑提供了更加穩定可行且簡便的方法，因此，在實際操作中具有重大意義。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京∶ 中國醫藥科技出版社,2015.

[2] 李時珍.《本草綱目》∶中國言實出版社,2012年版.

[3] 許福泉,許旭東,陳士林. 玄參化學成分及藥理活性研究進展[J].中國現代中藥,2013,(09)∶752-759.

[4] 白宇.玄參的藥味藥理學初步研究[D].黑龍江中醫藥大學,2014.

[5] 梁晨,徐思思,聶詩明. HPLC法測定不同產地微波真空干燥玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的含量[J]. 數理醫藥學雜志,2012,(06)∶688-690.

[6] 曹崗,叢曉東,蔡皓,等. HPLC-DAD法同時測定玄參炮制前后8個有效成分的含量[J]. 中國天然藥物,2012,(03)∶213-217.

[7] 張雪梅,王瑞,安睿,等. HPLC同時測定玄參中5種成分的含量[J]. 中國中藥雜志,2011,(06)∶709-711.

Simultaneous detection of the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen by Dual-wave switching HPLC

/XIANG Cai-qin1, LI Xi1,2, FENG Jian-an2, HUANG Yan2//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Institute of TCM, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To establish Dual-wave switching HPLC method to detect the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen.Method:The analysis was carried on a Shim-packVP-ODS C18(250×4.6 mm，5μm) column. The mobile was acetonitrile(A) and 0.3% Phosphoric Acid (B) which was in gradient elution at fl ow rate of 1mL?min-1as following∶ 0～10min, 3%～10% (A);10～20 min, 10%～33% (A); 20～25 min, 33%～50% (A); 25～30 min, 50%～80% (A); 30～35 min, 80% (A); 35～37min, 80%～83% (A).The wave length was set at 278 nm during 0～10 min；210 nm during 10 ～15 min；278 nm after 15 min. Column temperature was 30℃, and sample volume was 10 μL.Result:The response of harpagide in the range of 0.011824-0.11824 mg?mL-1and the response of harpagoside in the range of 0.00416-0.0416 mg?mL-1had a good linear relationship with concentration.Conclusion:The detection method is stable and feasible, which can be used for simultaneous determination the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen.

Dual-wave switching HPLC; Xuanshen; harpagide; harpagoside; content determination

R 282.6

A

1674-926X(2017)06-003-03

1. 成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 6111372；2. 四川省中醫藥科學院中醫研究所，四川 成都 610031

向采芹(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：中藥新劑型，新技術，新工藝的研究Email∶742426178@qq.com

李希(1969-)，女，碩士，教授，研究方向：中藥新劑型，新技術，新工藝的研究Email∶1836820767@qq.com

2017-07-21

（責任編輯：胡慧玲）