發酵對半夏毒性和刺激性的影響

孫佳彬，覃藝，張紅玲，范潤勇，黃勤挽*,2

·炮制制劑·

發酵對半夏毒性和刺激性的影響

孫佳彬1，覃藝1，張紅玲1，范潤勇1，黃勤挽*1,2

目的：比較發酵前后半夏的毒性和刺激性變化，為臨床用藥的安全性提供依據。方法：采用單次給藥毒性實驗法、家兔眼結膜刺激性實驗方法和高效液相色譜法，測定半夏發酵前后的最大給藥量（MLD）、刺激性和草酸鈣針晶的含量。結果：半夏MLD為45.47 g?kg-1?d-1，相當于臨床人用量的252.61倍，發酵后的半夏MLD為39.42 g?kg-1?d-1，相當于臨床人用量的218.96倍；發酵后的半夏較半夏對家兔眼結膜的刺激性明顯減弱，草酸鈣針晶含量相對的減少。結論：臨床規定項下的半夏及半夏曲用量不會導致中毒死亡，發酵可以緩和半夏的刺激性。

半夏；發酵；刺激性；草酸鈣針晶

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit的干燥塊莖，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結的功效[1]。半夏生品有毒，對口腔、喉頭和消化道黏膜有強烈的刺激性，可導致失音、嘔吐、水瀉等副作用，嚴重的喉頭水腫可致呼吸困難、窒息等癥狀，嚴重者甚至引起死亡[2]。目前對半夏的毒性成分研究存在爭議，認為主要的毒性成分為草酸鈣針晶、蛋白類和生物堿類。其中草酸鈣針晶為半夏的主要刺激性成分，蛋白類中的凝集素蛋白為主要的至炎性成分，生物堿類即是抑制相關腫瘤細胞增殖的有效成分，又是能夠產生急性毒性的有毒成分[3-6]。半夏炮制后可以緩和半夏的毒性，目前對半夏發酵制曲后可以緩和半夏毒性的研究未見報道，所以本課題擬采用單次給藥毒性實驗方法、家兔眼結膜刺激性實驗方法和高效液相色譜法對半夏發酵前后的毒性變化進行研究，為半夏發酵制曲可以緩和毒性提供理論支撐，為半夏臨床安全用藥提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 實驗藥物

半夏購買于成都市荷花池藥材市場，由成都中醫藥大學中藥鑒定教研室成都中醫藥大學中藥標本中心盧先明教授鑒定為正品天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit的干燥塊莖；半夏曲：取半夏適量粉碎成細粉，加水適量，制成軟硬適宜的小塊或顆粒，發酵產生白色霉菌時，取出，干燥，即得。

1.2 動物

昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼有，SPF級動物，由成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2015-30

1.3 試劑

生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司，批號：T16090101-2）；草酸對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號160821），鹽酸（四川西隴化工有限公司，批號：140320）；磷酸（成都市科龍化工試劑廠，批號：2016050401）

1.4 儀器

DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）； L550臺式低速離心機（長沙儀器有限公司）；HWS型恒溫恒濕培養箱（北京中興偉業儀器有限公司）；BS200S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技有限公司）；UPH-I-10T優普超純水器（成都超純科技有限公司）；HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；Agilent 1200高效液相色譜儀：儀器包括G1322A(四元泵)，G1329A/B（自動控溫自動進樣器），G1316A(柱溫箱)，G1315B/D(二極管陣列檢測器)，Agilent Chemstation工作站；Agilent Zorbax SB-Aq C18（4.6*250mm，5μm，美國Agilent公司）

2 方法與結果

2.1 半夏發酵前后單次給藥毒性實驗[7]

2.1.1 藥液的制備 取半夏和半夏曲粉末適量，分別加純水溶解，直到混懸液濃稠至恰好能通過灌胃針為止，即為藥液的最大濃度。

2.1.2 半夏發酵前后最大給藥量（MLD）的測定 根據預實驗結果小鼠大劑量灌胃（藥液濃縮至較大濃度或以能通過灌胃針的最大濃度）半夏及半夏曲混懸液，均不會出現動物死亡的情況，無法測出半數致死量（LD50）和最大耐受量（MTD），故對其進行1日內最大給藥量（MLD）測定。將小鼠按體重，性別隨機分為3組，每組20只。分別為空白組，半夏組和半夏曲組。實驗前禁食不禁水12 h，按40 ml?kg-1給藥劑量分別給予相應的藥液。因混懸液濃稠且濃度較低，所以對藥物組動物給藥兩次，空白組給予等體積的水，時間間隔10 h。給藥后密切觀察記錄各組小鼠反應，第二次給藥后2 h后恢復進食，常規飼養14 d，從給藥后第1 d起每天觀察小鼠兩次，記錄異常情況。分別于給藥后1，7，14 d稱量各組小鼠體重，實驗結束后頸椎脫臼處死小鼠進行解剖檢查，觀察其臟器變化。

半夏組較空白組第一次給藥后15 min內比較煩躁，隨后的2 h內出現活動減少、困倦、扎堆的現象，4 h內全部恢復正常活動；第二次給藥后1 h內比較安靜，2 h內逐漸恢復正常，恢復正常飲食后飲食量較少，給藥1 d后飲食恢復正常。半夏曲組較空白組第一次給藥后15 min內活動較少，喜歡扎堆，2 h內恢復正常；第二次給藥后15 min內較安靜，1 h內逐漸恢復正常，恢復正常飲食后飲食減少，給藥1 d后飲食恢復正常。14 d后解剖檢查各組小鼠均無明顯臟病變。各組小鼠第1，7，14 d體重變化與空白組比較均無顯著性差異，結果見表1。

表1 半夏和半夏曲組MLD實驗小鼠體重變化（±s，n=20）

表1 半夏和半夏曲組MLD實驗小鼠體重變化（±s，n=20）

組別給藥劑量/(g?kg-1)最大給藥量/(g?kg-1?d-1)相當于50 kg人日用量的倍數給藥1 d后體重/g給藥7 d后體重/g給藥14 d后體重/g空白組------23.15±2.75 30.70±3.73 32.01±3.94半夏組22.7345.47252.61 23.15±1.79 29.62±3.22 31.44±3.22半夏曲組19.7139.42218.96 23.19±1.77 29.44±3.17 31.32±3.08

2.2 半夏發酵前后對家兔眼結膜刺激性的比較

2.2.1 樣品制備 分別稱取半夏和半夏曲粉末（200目）各1 g，用生理鹽水配制成質量分數20 %的混懸液；取過200目篩的藥用淀粉以生理鹽水配置成質量分數20 %的混懸液。上述各樣品溶液調節PH值，使其呈中性。

2.2.2 半夏發酵前后對家兔眼結膜刺激性的測定[6]隨機取體重約1.5 kg的家兔10只，分為2組，每組5只，分別為半夏組和半夏曲組。分別滴加半夏、半夏曲各樣品混懸液2滴到家兔左眼中，兔右眼同樣滴加質量分數20%的淀粉混懸液2滴作為對照，然后用手輕輕閉合家兔上下眼瞼，避免藥液溢出家兔眼睛，緊接著輕輕揉家兔的眼睛，使藥液與整個眼結膜充分接觸，左右眼均揉3 min后，立即用30～40 mL生理鹽水沖洗家兔眼睛，直到眼中無藥物殘留，并且沒有任何異物，隨后觀察0.5～2 h內家兔左右眼的情況，每0.5 h觀察一次，并拍照記錄家兔左右眼的刺激反應情況，按照家兔眼結膜評分標準[8]從血管充血情況，是否水腫和有無分泌物情況三個方面進行評分，評分結果見表2。由表2可知半夏對家兔眼結膜表現為輕度刺激，發酵后的半夏曲可以緩和半夏的刺激性毒性對家兔眼結膜無刺激性作用。

表2 家兔眼結膜評分結果（n=5）

2.3 半夏發酵前后草酸鈣含量的測定[9]

2.3.1色譜條件及系統適應性實驗 Agilent Zorbax SB-Aq C18（4.6*250 mm，5 μm）色譜柱，流動相0.5%磷酸水，流速0.5 mL?min-1，柱溫28 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL，在此色譜條件下對照品峰與樣品峰分離度大于1.5，理論塔板數大于2000，見圖1，圖2。

圖1 草酸對照品HPLC圖

圖2 半夏發酵前后樣品HPLC圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取草酸對照品適量，置10 mL容量瓶中，加純水溶解定容至刻度，精密移取2 mL置10 mL容量中加純水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm有機系微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 分別精密稱取半夏和半夏曲藥材粉末（40目）各0.1 g,置玻璃容器中，加入3 mL蒸餾水混勻，振蕩5 min，然后置60 ℃水浴加熱并攪拌10 min,，3 000 r/min離心5 min，殘渣以熱純水洗滌2次,每次2 mL，混勻離心，取藥材殘渣，加0.2 mLHCl(1：1)溶液, 3 mL純水混勻,置70 ℃水浴,，加熱并攪拌10 min，離心，條件同上，分離沉淀與上清液,沉淀用0.1 mol?L-1的HCl同上法處理2次，每次2 mL，離心，合并上清液，置10 mL量瓶，純水定容至刻度，即得供試品溶液。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.2”項下的對照品溶液1，2，4，6，10，15，20 μl，按上述色譜條件，進樣分析，測定峰面積。以進樣質量對峰面積進行線性回歸，以進樣質量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，草酸的的標準曲線為：A=898.82C-24.926（γ=0.9995），表明草酸質量在0.188～3.760 μg線性良好。

2.3.5 精密度實驗 精密吸取“2.3.2”項下的對照品溶液10 μl按上述色譜條件，連續進樣6次，記錄草酸對照品的峰面積并計算RSD值，其峰面積的RSD為0.10 %，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性實驗 取同一批半夏樣品，按“2.3.3”項下的供試品溶液制備方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣10 μl，測定草酸峰面積,計算并折算成樣品中草酸鈣含量，其草酸鈣含量的RSD為1.79%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩定性實驗 精密稱取取半夏粉末0.1 g，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，12，24 h等6個時間點吸取供試品溶液10 μL進樣，測定草酸峰面積，其峰面積的RSD為1.12%，表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.3.8 回收率實驗 精密稱取已知含量的半夏藥材粉末6份，每份0.05 g，每份精密加入草酸對照品適量，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進樣10μl，測定草酸峰面積,計算并折算成樣品中草酸鈣含量，計算回收率結果見表3。半夏供試品溶液中草酸鈣的回收率在97.01 %～101.69 %范圍內，平均回收率為98.40 %，RSD＜3 %，表明測定陳皮中橙皮苷含量的方法準確度良好。

表3 半夏中草酸鈣加樣回收實驗

2.3.9 樣品含量測定 精密稱取半夏發酵前后樣品，按“2.3.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進樣10 μl，測定草酸峰面積,計算并折算成樣品中草酸鈣含量，結果見表4。由表4可知，半夏發酵后藥材中草酸鈣含量降低，表明發酵可以緩和半夏的刺激性毒性。

表4 半夏發酵前后樣品中草酸鈣含量測定結果（n=3）

3 結論與討論

對實驗結果分析急毒實驗中半夏M L D為45.47 g?kg-1?d-1，相當于臨床人用量的252.61倍，發酵后的半夏MLD為39.42 g?kg-1?d-1，相當于臨床人用量的218.96倍，說明半夏發酵前后在正常的臨床用藥范圍內都是低毒，安全的；家兔眼結膜刺激實驗中，半夏可引起家兔眼結膜紅腫并伴有分泌物排出，說明半夏有刺激性，發酵后的半夏較半夏對家兔眼結膜的刺激性明顯減弱；草酸鈣含量測定實驗中發酵后的半夏草酸鈣針晶含量相對的減少，說明發酵可以降低半夏中的刺激性成分，緩和半夏的刺激性。

半夏刺激性成分的研究比較多，最早認為半夏的刺激性成分是尿黑酸（homengenstic acid）[10]，也有專家提出是草酸鈣[11]，現代認為具有特殊晶型（細長堅韌，末端尖銳）的草酸鈣針晶是半夏的主要刺激性成分[12]。半夏中的草酸鈣針晶是由草酸鈣和蛋白組成的特殊晶體，正是其特殊的晶型和特殊組成才使得其具有刺激性，半夏中的凝集素蛋白可以增強針晶引起的刺激性[13,14]。

對于草酸鈣含量測定的方法目前多用滴定法和HPLC，都是將不溶的草酸鈣轉化為草酸的方法間接測定草酸鈣的含量，本實驗選擇了操作簡單，結果更準確的HPLC，先用水將可溶性的草酸鹽去除，再通過強酸制弱酸的原理將草酸鈣轉化為草酸(CaC2O4+2HCl=CaCl2+H2C2O4)，按照生成1 moL草酸需要mol草酸鈣的量，將測得的樣品中草酸轉化成草酸鈣的含量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)[S].北京∶中國科技出版社,2015.

[2] 胡文斌,王瀚,張少飛,等.半夏的化學成分及其藥性、毒性研究進展[J].中國資源綜合利用,2016,(10)∶57-59.

[3] 吳皓,李偉.半夏刺激性成分的研究[J].中國中藥雜志,1999,24(12)∶726-730．

[4] 劉先瓊,吳皓,郁紅禮,等.半夏、掌葉半夏及禹白附凝集素蛋白的刺激性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(18)∶244.

[5] 陳芳,楊李,王曉昆,等.半夏生物堿對人肝癌細胞Bel-7402增殖的影響[J].中國藥房,2011,22(43)∶4048.

[6] 周倩,吳皓.半夏總生物堿抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(3、4)∶87.

[7] 陳奇.中藥藥理研究方法學(第2版)[S].北京∶人民衛生出版社,2006.

[8] 梁君,劉小鳴,張振凌,等．姜半夏產地加工炮制一體化方法及工藝研究[J]．中草藥,2015,46(9)∶1302-1306.

[9] 鐘凌云,吳皓.RP-HPLC測定天南星科藥用植物中草酸鈣針晶的含量[J].中成藥,2008,30(2)∶260-262

[10] Suzuki Masako. Irritating Substance of Pinellia ternata.Arzneim-Forsch,1969,19(8)∶1307

[11] KnhoMeguni,MaruyamaEtsuko,KgjitaTaketoshi,etal.Unpleasant Taste in Vegetable Foods.Acrid Component in PinelliaeTuber.KaseigakuKenkyu(Japan),1983,30(1)∶61

[12] 鐘凌云,吳皓,張科衛,等,半夏中草酸鈣針晶的刺激性作用研究,中國中藥雜志,2006, 31(20)∶1706

[13] 朱法根,郁紅禮,吳皓,等.半夏凝集素蛋白與半夏毒針晶毒性的相關性研究[J].中國中藥雜志,2012,7(37)∶1007-1011.

[14] 吳皓.半夏草酸鈣針晶的毒性和針晶結合蛋白的研究[A].中華中醫藥學會中藥炮制分會.中華中醫藥學會四大懷藥與地道藥材研究論壇暨中藥炮制分會第二屆第五次學術會與第三屆會員代表大會論文集[C].中華中醫藥學會中藥炮制分會∶,2007∶6.

Effect of fermentation on the toxicity and the irritation of Banxia

/SUN Jia-bin1, QIN Yi1, ZHANG Hong-ling1, FAN Runyong1,HUANG Qin-wan1,2// (1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. Key Laboratory TCM processing of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To compare the toxicity and the irritation of Banxia (before and after fermentation), so as to provide the basis for the safety of clinical medication.Method:The maximum dose (MLD) of Banxia (before and after fermentation)was investigated by the classical acute toxicity test. The irritation of Banxia(before and after fermentation) was investigated by stimulating test of eye conjunctiva in rabbits. HPLC method was used to detect the content of calcium oxalate crystals (before and after the fermentation) of Banxia .Result:The MLD of raw Banxia was 45.47 g?kg-1?d-1, which was equivalent to 252.61 times of the human clinical dosage. The MLD of the fermented Banxia was 39.42 g?kg-1?d-1, 218.96 times as much as the clinical dosage.After fermentation, the stimulation of Banxia on the conjunctiva of rabbit was significantly weakened, and the relative content of calcium oxalate crystal was decreased.Conclusion:The prescribed dosage of Banxia and the fermented Banxia under clinical conditions don’t lead to poisoning and death, and fermentation can alleviate the irritation of Banxia.

Banxia; fermentation ;irritation; calcium oxalate crystal

R 283.6

A

1674-926X(2017)06-008-04

國家中醫藥管理局2015年公益性行業科研專項經費項目（201507004-03）

1.成都中醫藥大學，四川 成都 611137；2.國家中醫藥管理局中藥炮制技術重點研究室，四川 成都 611137

孫佳彬（1992-），女（漢族），河北承德人，成都中醫藥大學藥學院在讀碩士研究生，學士學位，主要從事中藥炮制研究Tel∶13166506734 Email∶2270514478@qq.com.

黃勤挽，博士，副教授，研究方向：中藥炮制學，Tel∶028-61800231 Email∶36190587@qq.com.

2017-6-28

(責任編輯：傅舒)