原料乳中菌落總數檢測技術綜述

文/房啟波 于春艷

原料乳中菌落總數檢測技術綜述

文/房啟波1于春艷2

（黑龍江搖籃乳業股份有限公司）

原料乳中菌落總數的控制對后續產品質量的保證至關重要，近年來隨著微生物檢測技術的快速發展，菌落總數的測定不僅僅限于傳統微生物法，目前可以采用快速檢驗的方法也有很多，綜述了平板菌落計數法、美藍（亞甲藍）試驗、菌落總數測試片檢測、自動化儀器分析等原料乳中菌落總數的檢測方法。

原料乳；菌落總數；檢測方法

牛乳是改善營養、增強體質的優質食品。牛乳富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質和水六大成分，成分均衡，是營養價值非常高的食品，因此常喝牛乳對身體非常有益。

牛乳本身所含有的極其豐富的營養物質，也是微生物最好的培養基，因此原料乳極易受到微生物的破壞，從原料乳擠出到運輸、加工，每一個環節都不可避免地受到微生物的污染。原料乳一旦受到微生物的污染，將會對產品質量產生巨大的影響。原料乳中微生物數量過多會導致原料乳殺菌不徹底，成品殘留菌量超標，產品容易變質，保質期不能保證，也給消費者的健康帶來一定的隱患，因此監測好原料乳的微生物指標至關重要。

原料乳中微生物檢測最直接的方法是測定菌落總數，GB 19301-2010《食品安全國家標準 生乳》微生物限量中，對原料乳的菌落總數提出了限量要求。

1 菌落總數測定的意義

菌落總數是用于判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，是原料乳重要的微生物控制指標之一，其在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣，反映食品在生產過程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出恰當的衛生學評價。

近年來，隨著科學技術的不斷進步，微生物檢測技術也迅猛發展，傳統的菌落總數檢測方法雖然精確度高，但繁瑣、費時，其最大的弊端是不能實現實時監測，48 h之后才能得到原料乳菌落總數的檢測結果，無法根據原料乳的質量來指導生產。為了更好地控制原料乳的菌落總數，各企業和質檢機構在傳統檢測方法的基礎上，也引入了一些可實時監控的快速檢測新技術、新儀器，通過新技術、新材料的應用，杜絕了不合格原料乳的投入使用，對生產更具指導意義。

2 檢測方法綜述

2.1 平板菌落計數法

2.1.1 定義

食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。

2.1.2 設備和材料

恒溫培養箱、冰箱、恒溫水浴鍋、天平、均質器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器、無菌錐形瓶、無菌培養皿、pH計、放大鏡或菌落計數器。

2.1.3 培養基和試劑

平板計數瓊脂培養基，無菌生理鹽水。

2.1.4 檢驗方法

無菌移取25 mL樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。無菌移取1∶10 樣品勻液1 mL于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，混合均勻制成1∶100的樣品勻液。按照上述步驟，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計，選擇2～3 個適宜稀釋度的樣品勻液，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿中，及時將15～20 mL樣品勻液冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后將平板翻轉，（36±1）℃培養（48±2）h。菌落計數時可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（Colony-Forming units，CFU）表示，再乘以相應稀釋倍數，作為每mL樣品中菌落總數結果。

平板菌落計數法速度慢，但重復性、平行性很好，是經典的計數法。

2.2 美藍（亞甲藍）試驗

美藍試驗又稱美藍還原褪色試驗，是用于測定原料乳菌落總數的一種定性試驗：將1 mL亞甲基藍溶液加入到20 mL原料乳中，混勻后放入38～40 ℃恒溫箱中，經過20 min、2 h和5.5 h，觀察3 次褪色情況，根據褪色時間可以間接推斷出原料乳菌落總數的大致范圍，并將原料乳分為4 個等級。分級情況見表1。

美藍是一種氧化還原作用指示劑，在厭氧環境中其將被還原為無色。如果原料乳中有細菌生長繁殖，必將造成其中溶解氧含量的減少，原料乳樣品中的氧化還原電勢降低，通過美藍顏色變化的速度，可以鑒定該原料乳的質量。

美藍試驗優點是操作簡便，不需要特殊設備，但不能作為定量檢查方法。

2.3 菌落總數測試片

菌落總數測試片可以檢測原料乳中的菌落總數，快速、簡便，目前廣泛應用于各企業和檢測機構。其原理是：測試片為預先制備好的培養基系統，測試片上的培養基含有冷水可溶性凝膠和指示劑，菌落總數測試片中含有的指示染劑可使菌落顯示紅色，在接種樣品并經過一定時間的培養后，根據計數測試片所在區域的紅色菌落的數量來判定樣品的菌落總數。

和傳統方法相比較，該測試片操作簡便、迅速，減少了實驗室制備培養基等大量準備工作，檢測時只需要把稀釋液垂直滴加在測試片的中央處，重新水化的培養基便可作為微生物生長的支持物，經過培養后，便可像常規平皿計數一樣直接在膜系統上對菌落進行計數。實踐證明，測試片方法的檢測結果與平板計數法檢測結果比較差異性小，方法準確度高。

2.4 自動化儀器分析

近年來，微生物的快速檢測和自動化研究進展迅速。與傳統方法相比，具有更快、更方便、更靈敏的特點。

其中，丹麥福斯公司生產的牛奶細菌總數測定儀BactoScan 8000S，采用流式細胞技術原理，直接對細菌DNA進行染色計數。即應用激光源照射經過DNA染色和流體技術處理的排成列通過的單個細菌，然后采集每個細菌阻斷激光束時產生的頻率信號，對該頻率信號進行自動計數，從而實現無需培養樣品、實時檢測、自動計數和直接得到細菌總數的結果。該儀器自動化程度高，易于操作，穩定性好，分析速度快，時效性優于傳統平板培養法，平均1 min即可得到檢測結果，適合企業大批量實時檢測。

此外，ATP熒光細菌檢測儀因其成本低廉、小巧便攜，應用也較為廣泛，其在測量時先對樣品進行前處理，利用試劑使細菌細胞的ATP發光，然后根據光敏傳感器對樣品光亮程度的測定，來換算細菌的數量。其原理是，ATP是包括細菌在內的所有生物細胞中的能量分子，只要測定出樣品中細菌細胞的ATP含量，即可用標定的方法換算出細菌數量。

表1 原料乳分級情況

除了上述兩種檢測方法外，還有智能化圖像識別系統、PCR技術、電導微生物技術等，均可很好地檢測出原料乳菌落總數含量，但檢測成本較高。

3 小結

本文介紹了幾種常用的測定原料乳菌落總數的檢測方法，工作中可以根據實際情況結合使用來控制原料乳的質量，指導生產。

隨著科學技術的不斷發展，今后將有更多先進的新技術和新方法涌現出來，這些檢測手段的應用，必將為原料乳質量控制工作提供有力的技術支持和保障，提高原料乳檢驗的效率和控制水平，提升產品品質和企業競爭力。

[1] 王惠霞，張麗. 乳類產品營養價值淺析[J]. 中國乳業，2002（12）：23-24.

[2] 張名愛，李潔慧，于翠芳，等. 原料乳中菌落總數檢測方法的比較研究[J]. 飼料工業，2013，34（5）：49-52.

[3] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局. GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定[S]. 北京：國家標準出版社，2016.

[4] 國家標準化管理委員會. GB 5409-85牛乳檢驗方法[S]. 北京：國家標準出版社，1985.

[5] 陳燕飛. 牛乳中細菌的檢查[J]. 中國農學通報，2008，24（2）：121-124.

[6] 洪梓申. 原料奶控制：源頭把關莫放松[J]. 食品安全導刊，2008（2）：36-37.

[7] 嵇志遠. 3M Petrifilm測試片法檢測水中菌落總數[J]. 中國給水排水，2010，26（14）：119-121.

[8] 趙化平，劉剛，趙秀忠. 原奶細菌總數快速檢測技術的新進展[J]. 中國乳制品工業協會第十三次年會論文集，2007：321-323.

[9] 田麗萍，吳志良，孟慶紅. 兩種原料乳細菌總數檢測方法的比較[J]. 乳業科學與技術，2011（2）：77-78.

[10] 張志潔，韓劍眾. 食品微生物快速檢測技術及其自動化研究進展[J]. 食品研究與開放，2003，24（2）：97-100.

2017-08-15）

百奧明中國無錫工廠開業典禮暨2017亞洲營養論壇在無錫舉行

【本刊訊】（記者 張俊妍 祝文琪）2017年10月30日，百奧明中國無錫工廠開業典禮在無錫隆重舉行。百奧明母公司Erber集團和百奧明公司創始人Erich Erber，奧地利駐上海總領事館商務處商務領事薛珊，奧地利駐上海總領事館商務處商務副領事孔麗莎，奧地利駐上海總領事館商務處高級市場專員胡宗延，Erber集團CEO、董事會主席Jan Vanbrabant，百奧明公司CEO Hannes Binder，百奧明亞太區CEO Marc Guinnement，百奧明中國總經理安綱以及各地企業、事業單位代表、媒體記者共500 余人參加開業典禮。此外，為了探索推動亞洲蛋白質經濟未來的因素，有效推動亞洲蛋白質經濟，百奧明公司于31日舉辦2017亞洲營養論壇，匯集全球行業知名專家，對家禽、生豬和奶牛生產等行業熱門話題和發展趨勢進行深入探討。

百奧明公司于1983年在奧地利成立，客戶遍布120 多個國家，擁有來自38 個國家的770 名員工，同約200 所院校及研究機構創建研究網絡，在全球共建有11 處生產場址。百奧明專注于以天然、高效益的方式促進動物健康，通過采用先進的專利技術，研發和生產飼料添加劑、預混料、提供技術服務，向畜禽、反芻與水產養殖業提供自然、可持續且可盈利的解決方案。尤其是三十多年來一直致力于霉菌毒素的研究，為降解各種霉菌毒素提供了有針對性的創新解決方案。

房啟波（1978-），男，工程師，主要從事乳品生產和質量管理工作。