六溴環十二烷對斑馬魚的甲狀腺激素干擾效應研究

劉小燕 ，劉 珊 ，張麗娟 ，韓 倩 ，陳棉彪 ，黃楚珊 ，魏東洋 ，胡國成 *

六溴環十二烷對斑馬魚的甲狀腺激素干擾效應研究

劉小燕1，2，3，劉 珊1，張麗娟2，3，韓 倩4，陳棉彪2，3，黃楚珊2，3，魏東洋2，3，胡國成2，3*

（1.長安大學旱區地下水文與生態效應教育部重點實驗室，西安 710064；2.環境保護部華南環境科學研究所，廣州 510535；3.國家環境保護環境污染健康風險評價重點實驗室，廣州 510535；4.深圳市環境科學研究院，廣東 深圳 518001）

作為添加型阻燃劑，六溴環十二烷（HBCDs）廣泛存在于環境介質及生物體內。為研究HBCDs飼料長期暴露對斑馬魚的甲狀腺激素干擾效應，設計HBCDs飼料暴露劑量為0、10、100、400 ng·g-1，對斑馬魚成魚進行為期56 d的長期暴露，以其肝臟組織中三碘甲腺原氨酸（T3）、四碘甲腺原氨酸（T4）、游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和游離四碘甲腺原氨酸（FT4）含量及T3/T4比值作為生物標志物，評價HBCDs飼料長期暴露對斑馬魚肝臟組織甲狀腺功能的影響。結果表明，HBCDs對斑馬魚體內T3和T4具有明顯抑制作用（P<0.05），隨著HBCDs暴露濃度的增加，T3和T4的含量水平呈現下降趨勢；在中濃度組（100 ng·g-1）和高濃度組（400 ng·g-1），HBCDs對FT3和FT4具有顯著性抑制作用（P<0.05）；隨著HBCDs暴露濃度增加，T3/T4的比值呈現升高的趨勢，表明HBCDs可誘導T4轉化為T3。研究表明，HBCDs對魚類具有甲狀腺激素干擾效應，從而影響魚類的生長發育。

六溴環十二烷；斑馬魚；甲狀腺激素；干擾效應

目前，六溴環十二烷（HBCDs）廣泛應用于建筑材料、塑料橡膠產品以及電子設備中[1]。工業品HBCDs主要含有3種手性異構體：α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD，其比例分別為10%～13%、1%～12%和75%～89%，其中γ-HBCD是工業品中最主要的異構體[2]。研究資料顯示，HBCDs是除多溴聯苯醚（PBDEs）和四溴雙酚A（TBBPA）之外的全球第三大溴代阻燃劑。至2010年，HBCDs的全球年產量已達到28 000 t，其中約64%的產量集中于中國山東省、江蘇省等HBCDs的生產地區[3-5]。隨著HBCDs生產量和使用量的增加，HBCDs在不同環境介質（水、土壤、沉積物及空氣等）和生物體內（銀鷗、鯽魚、田螺、斑馬貽貝和歐鯉等）均有不同程度的檢出[6-13]，且在水生物體內可隨著食物鏈富集放大。He等[6]研究發現珠江流域水體中HBCDs的平均濃度為0.04 ng·L-1；Xian等[14]首次研究了中國環境中HBCDs的含量，發現長江流域魚體中HBCDs的含量范圍為12～330 ng·g-1，高于意大利高山湖泊斑馬貽貝和歐鯉體內HBCDs的平均濃度（分別為72.4、31 ng·g-1）[15]，而低于歐洲工業區魚類體內 HBCDs含量水平（9.1～1113 ng·g-1）[13]。

目前，關于HBCDs毒性研究的資料相對較少。HBCDs對大鼠的口服最小致死劑量大于20 g·kg-1，吸入最小致死劑量大于200 mg·L-1；HBCDs對兔子的經皮膚接觸暴露的最小致死劑量大于20 g·kg-1[15]。2008年，歐洲聯盟委員會對HBCDs的全面評估顯示：HBCDs可能會造成生殖毒性和慢性毒性。工業品HBCDs在等于或低于溶解度的條件下不會導致急性毒性，但該類化合物具有較高的生物濃縮系數。這表明HBCDs的急性毒性并不顯著，但其慢性毒性及亞致死毒性效應不容忽視[16]。研究資料表明HBCDs具有生殖發育、神經毒性及內分泌干擾等毒性[15-19]。由于HBCDs與多溴聯苯醚（PBDEs）結構相似，由此推測，HBCDs具有較為顯著的甲狀腺激素干擾效應[20]。目前，HBCDs的甲狀腺毒性效應研究主要集中于大鼠及魚類的血清，如Van-Der-Ven等[21]研究發現HBCDs會使大鼠腦垂體和甲狀腺重量增加，促甲狀腺激素水平增加，但此現象只出現在雌鼠體內，其影響機制還需進一步研究。HBCDs對魚類組織中甲狀腺激素水平的研究卻鮮有報道，因此研究HBCDs對魚類甲狀腺激素水平的影響具有重要意義。本研究以斑馬魚為受試生物，研究了不同劑量HBCDs飼料暴露對斑馬魚甲狀腺激素水平的影響，選取T3、T4、FT3、FT4以及T3/T4的比值為甲狀腺激素的水平指標，進一步揭示HBCDs的甲狀腺激素干擾效應，為篩選和甄別環境內分泌干擾物提供基礎資料，為生態環境安全及人體健康風險評估提供理論支撐和技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

全自動熒光及化學發光酶標儀（Synergy HT，寶特儀器有限公司）；勻漿機（FS-2，德國IKA公司）；-80℃超低溫冰箱（Revco Value Series，賽默飛世爾科技公司）；低溫冷凍離心機（Sorvall Stratos，賽默飛世爾科技公司）；超高效液相色譜/三重四極桿串聯質譜（Agilent 1260 LC/AB SCIEX 4000trap MS，美國安捷倫科技有限公司（液相色譜）/SCIEX）。

六溴環十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD），純度97%（百靈威公司）；丙酮、正己烷、甲醇（HPLC級，CNW）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；斑馬魚成魚專用飼料（250～450 Microns，Zeigler，USA）購自上海海圣生物實驗設備有限公司；PBS緩沖液、魚三碘甲狀腺原氨酸（T3）、魚游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、魚四碘甲狀腺原氨酸（T4）、魚游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）酶聯免疫檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

斑馬魚成魚，體長3.10～3.60 cm，體重0.55～0.80 g，購自廣州芳村花鳥魚蟲市場。實驗前將斑馬魚在實驗室條件下馴養至少14 d以上，實驗魚應無明顯的疾病和肉眼可見的畸形。實驗用水為曝氣24 h的自來水，空調控制水溫為25℃左右。隨機選取健康活潑的斑馬魚用于暴露實驗，放入50 L的玻璃魚缸中。實驗中包括3個暴露組和1個對照組，每個濃度組設置3個平行，每個養殖缸中放養斑馬魚65尾。每日9：30和16∶30投喂自制餌料（含不同濃度HBCD）2次，投飼量為體重2%。實驗過程中每日換1次水，并盡量清除食物殘渣及排泄物，換水前后測水溫及溶解氧含量，每周清洗魚缸1次。整個實驗期間，用外掛式過濾器持續微量曝氣，光暗比為14 h∶10 h，溶解氧、溫度、pH值等水質參數符合斑馬魚生長需要，水溫為25℃左右，pH 值為 7.34±0.18，電導率為 182.08±2.46 μS·cm-1，溶解氧為 7.65±0.94 mg·L-1，每日觀察斑馬魚有無行為異常、疾病或死亡情況。

1.3 實驗方法

1.3.1 飼料制備與測定

1.3.1.1 飼料制備

本研究暴露劑量的設計以反映實際環境中HBCDs的暴露水平為原則，根據Du等[22]和Law等[23]實驗中設置飼料濃度（5、50 ng·g-1）基本接近環境濃度的暴露劑量，本實驗設置兩個較為接近環境濃度的暴露劑量：低濃度組（10ng·g-1）和中濃度組（100ng·g-1）。同時綜合考慮HBCDs的毒性資料，設置高濃度組（400 ng·g-1），與低濃度組和中濃度組進行比較，觀察HBCDs對斑馬魚的甲狀腺激素干擾及氧化應激效應。首先，將HBCDs工業品溶于丙酮，配制1 g·L-1的HBCDs丙酮溶液，并根據需要稀釋至不同梯度。暴露實驗中所用飼料選取美國Zeigler公司生產的斑馬魚成魚專用飼料，將魚飼料置于圓底燒瓶中，然后加入不同濃度的HBCDs丙酮溶液，使飼料中HBCD的劑量分別為 10、100、400 ng·g-1，振蕩 1 h 使 HBCDs充分混勻于飼料中，混合物過夜風干，使溶劑蒸發。對照組飼料用未添加HBCDs的丙酮作同樣處理。將飼料置于棕色瓶中，并存放于4℃冰箱中保存，以免光解。為考察投喂飼料后水中HBCDs的含量水平，保證飼料在斑馬魚攝食前未釋放到水中，將制備好的3組飼料（10、100、400 ng·g-1）均取 1 g分別投入至 1 L 超純水中，黑暗中靜置1 h后測定超純水中HBCDs的含量水平。

1.3.1.2 飼料中HBCDs的測定

飼料配制完成后，經索氏抽提、旋轉蒸發、凝膠滲透色譜柱除脂肪以及氧化鋁硅膠柱凈化等前處理過程，利用超高效液相色譜質譜聯用（LC-MS/MS）測定飼料中HBCDs的含量。飼料靜置后的超純水樣品經過HLB柱富集萃取、濃縮凈化等過程后，同樣利用LC-MS/MS測定HBCDs的含量。每分析一批樣品同時分析質量保證/質量控制（QA/QC）樣品，包括方法空白、空白加標、基質加標和樣品平行樣。甲醇空白樣品用來檢查實驗過程中有無來自溶劑或玻璃器皿的干擾或污染，其中均沒有HBCDs檢出或低于檢測限。空白加標中 α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 的回收率分別為98%～118%、105%～116%、109～113%；基質加標中目標物 α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 的回收率分別為87%～96%、86%～94%、83%～93%。

檢測可知，對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組飼料中HBCDs的實際含量水平分別為5.23、15.03、98.29、388.30 ng·g-1，與設定的濃度劑量基本接近。對照組中檢出HBCDs可能與飼料成分的背景值有關。對照組飼料中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的含量分別為 0.80、0.64、3.78 ng·g-1。因為 α-HBCD為生物體內主要的異構體形式，且毒性較高，故本實驗對照組飼料中HBCDs對斑馬魚的影響基本可以忽略。飼料溶解實驗的監測結果表明：水中γ-HBCD未檢出，α-HBCD和β-HBCD有檢出，且濃度水平均較低（ND～0.023 ng·L-1和 ND～0.011 ng·L-1），基本可以忽略水體溶解的HBCDs對斑馬魚的影響。

1.3.2 斑馬魚樣品前處理

斑馬魚暴露56 d后，每缸魚中隨機選取6尾，解剖取肝臟，每3尾魚混合為一個樣品，準確稱取肝臟組織重量，按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，加入9倍體積預冷的PBS緩沖溶液，冰水浴條件下機械勻漿，制成10%的組織勻漿液，以2500 r·min-1，離心10 min，取上清液待測。

1.3.3 測定指標及方法

1.3.3.1 測定指標及原理

利用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測斑馬魚肝臟中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）的含量水平。其工作原理為向預先包被了甲狀腺激素單克隆抗體的酶標孔中加入甲狀腺激素，溫育；隨后加入生物素標記的抗甲狀腺激素抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶；然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中甲狀腺激素濃度呈正相關。

1.3.3.2 測定方法

正式測定前，要進行預實驗。首先挑選2～3例樣品10%的組織勻漿液，稀釋成不同濃度（5%、2%、1%、0.5%、0.25%）進行預實驗，再選取甲狀腺激素含量接近標準曲線中間濃度的組織勻漿液（保證實驗測定結果在標準曲線范圍內，減小測定誤差），并將所有樣品稀釋至此濃度，進行正式實驗。具體操作過程參照ELISA試劑盒說明書進行。T3、T4、FT3和FT4的標準曲線如圖1所示。

1.3.4 數據處理

實驗結果以10%肝臟組織勻漿液中T3、T4、FT3和FT4的含量表示，每一暴露濃度組均設6個平行，表示為平均數±標準誤差（Mean±SD）。采用SPSS17.0統計軟件進行分析，利用單因素方差分析（ANOVA）比較不同濃度組的差異，并用最小極差法（LSD）多重比較法判斷差異顯著性，顯著性水平為0.05。當P<0.05時，判定存在顯著性差異，圖中用*表示；當P<0.01時，判定差異性極顯著，圖中用**表示。

圖1 魚類組織中甲狀腺激素測定的標準曲線Figure 1 Standard curves of thyroid hormones in fish tissues

2 結果與分析

2.1 HBCDs對斑馬魚肝臟中T3和T4的含量的影響

不同HBCDs飼料暴露濃度對斑馬魚肝臟中T3和T4含量的影響如圖2所示。斑馬魚暴露實驗結束后（56 d），隨著暴露濃度的增加，斑馬魚肝臟組織中T3和T4的含量逐漸降低，呈現較明顯的劑量-效應關系。與對照組相比，低濃度暴露組肝臟中T3和T4的含量顯著降低（P<0.05），中、高濃度暴露組肝臟中T3和T4的含量均極顯著降低（P<0.01）；HBCDs對高濃度暴露組肝臟中T3和T4的最高抑制率分別達到52.08%和60.15%。

圖3表示HBCDs對斑馬魚肝臟中T3/T4比值的影響。從圖中可以看出，長期暴露情況下，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚肝臟組織中T3/T4比值呈現升高的趨勢。經56 d暴露后，低濃度暴露組斑馬魚肝臟中T3/T4比值與對照組無統計學意義（P>0.05），而中濃度暴露組和高濃度暴露組中T3/T4比值顯著高于對照組（P<0.05）。

圖2 HBCDs對肝臟中T3和T4含量的影響（暴露時間56 d）Figure 2 Effects of exposure to HBCDs on T3 and T4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

圖3 HBCDs對斑馬魚肝臟中T3/T4比值的影響（暴露時間56 d）Figure 3 Effects of exposure to HBCDs on the ratio of T3 to T4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

2.2 HBCDs對斑馬魚肝臟中FT3和FT4的含量的影響

圖4表示不同HBCDs暴露濃度對斑馬魚肝臟組織中FT3和FT4含量的影響。從圖4中可以看出，與對照組相比，低濃度暴露組斑馬魚肝臟中FT3的含量水平略有增加，但差異不明顯（P>0.05）；中濃度暴露組FT3含量極顯著低于對照組（P<0.01），抑制率為25.2%；高濃度暴露組FT3含量顯著低于對照組（P<0.05）。從劑量效應來看，斑馬魚肝臟組織中FT3的含量水平呈現先升高后降低的趨勢，而后隨著暴露濃度的升高逐漸趨于與對照組水平相當。從圖中可以看出，低濃度暴露組肝臟組織中FT4含量與對照組相比無明顯差異（P>0.05），中濃度暴露組和高濃度暴露組中FT4含量水平均極顯著低于對照組（P<0.01）。上述結果表明：中濃度暴露組和高濃度暴露組中，HBCDs對斑馬魚肝臟中FT3和FT4均產生明顯的抑制作用，其中最高抑制率達到66.7%。

3 討論

甲狀腺激素對魚類生長發育、生殖繁育及能量代謝等生理過程具有重要的調節與控制作用，魚類甲狀腺受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調節，通過下丘腦合成腎上腺釋放激素，刺激垂體產生和釋放促甲狀腺激素，促進甲狀腺合成大量T4和少量T3。由于T4能夠同血液中的運載蛋白結合，運輸至肝臟、腦、腎臟等外周組織中，在脫碘酶的作用下，脫碘轉化形成生物活性更強的三碘甲腺原氨酸（T3）；一般結合型的激素不具有生物活性，只有游離的激素才能進入細胞，且結合型和游離型激素之間保持動態平衡[24]。研究表明，溴代阻燃劑（PBDEs、HBCDs等）內分泌干擾物均能影響生物體內甲狀腺激素水平及轉化過程[25]。

圖4 HBCDs對肝臟中FT3和FT4含量的影響（暴露時間56 d）Figure 4 Effects of exposure to HBCDs on FT3 and FT4 of liver in zebrafish（exposure for 56 days）

本研究中，與對照組相比，長期暴露下低濃度HBCDs飼料暴露對斑馬魚肝臟中的T3和T4產生抑制作用，中、高濃度水平HBCDs對斑馬魚肝臟中的甲狀腺激素T3和T4產生明顯的干擾作用；低濃度組斑馬魚肝臟中T3/T4比值與對照組無明顯差異，而中、高濃度組呈現顯著升高趨勢。這表明，長期暴露下HBCDs可誘導甲狀腺激素T4向T3轉化。隨著暴露濃度的增加，斑馬魚肝臟組織中游離甲狀腺激素FT3和FT4的含量均呈現稍有升高后降低的趨勢，其中FT3在中濃度暴露組達到最低值，FT4在高濃度暴露組中達到最低值。Palace等[26]在研究HBCDs對虹鱒甲狀腺代謝的影響中，發現HBCDs可以減少虹鱒對碘的吸收，加快甲狀腺激素的轉化效率，從而增加暴露組中甲狀腺激素T4的轉化速率，促進甲狀腺激素T3的合成，影響機體的代謝平衡，與本文研究結果基本一致。劉園園等[27]研究發現，HBCDs暴露42 d后，大鼠血清中TT4、TT3、FT4、FT3濃度隨著暴露劑量增大呈現先升高后下降的趨勢，其中低劑量組的FT3濃度顯著性升高，高劑量組的FT4濃度顯著性下降，與本研究甲狀腺激素變化趨勢基本一致。冀秀玲等[28]研究HBCDs發育期暴露對甲狀腺激素內穩態的影響，發現新生大鼠暴露于HBCDs 21 d后血清中TT4、FT4下降而TT3、FT3和TSH升高的趨勢，且低劑量暴露組也會對腦發育期新生大鼠產生甲狀腺激素干擾，T4和FT4的含量變化與本研究相似，其余指標呈現不同的變化趨勢。這可能與受試生物不同相關。Palace等[29]研究了HBCDs異構體對虹鱒血清中FT3和FT4的影響，發現暴露于HBCD的3種異構體56 d后，虹鱒血清中FT4含量降低，FT3含量上升，與本文中FT3的變化趨勢相反。這可能由于物種及檢測組織不同所導致。在陳海剛等[30]的實驗中，發現HBCDs短期暴露，使低、中暴露組紅鰭笛鯛幼魚肝臟中T3和T4的含量顯著上升，而高濃度暴露組隨時間推移呈現先升高后降低的趨勢；肝組織中T3/T4比值低于對照組，呈現明顯的劑量-效應關系。這一研究結果與本研究的結果不一致，可能與暴露時間、魚種類不同有關。

本研究結果表明，攝入飼料暴露HBCDs對魚類甲狀腺激素產生干擾效應，影響甲狀腺激素的內穩態水平。本研究中部分研究結果與文獻報道結果不一致，可能與暴露時間、受試物種、檢測組織、代謝轉化等因素有關。

4 結論

（1）飼料長期暴露HBCDs對斑馬魚肝臟中的T3和T4具有顯著性影響，隨著暴露濃度的增加，T3和T4具有明顯抑制作用；中、高濃度組暴露HBCDs對斑馬魚肝臟中T3/T4比值具有顯著影響。

（2）與對照組相比，低濃度暴露組HBCDs對斑馬魚肝臟中FT3和FT4的含量影響不明顯；而中、高濃度暴露組中HBCDs對斑馬魚肝臟中FT3和FT4的含量水平具有顯著影響，呈現明顯降低趨勢。

（3）通過飼料長期攝入HBCDs，對魚類甲狀腺激素（T3、T4、FT3、FT4）具有干擾效應，干擾甲狀腺的調節機制，可能影響脫碘酶的活性而誘導甲狀腺激素T4向T3轉化，從而影響魚類的生長發育。

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CHEN Hai-gang,SUN Li-wei,ZHANG Lin-bao,et al.Effects of short-term exposure to hexabromocyclododecane（HBCD）on T3 and T4 of liver and brain in juvenile crimson snapper（Lutjanus erythopterus）[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（7）：1257-1263.

Thyroid hormone-disrupting effects of hexabromocyclododecane in zebrafish（Danio rerio）

LIU Xiao-yan1,2,3,LIU Shan1,ZHANG Li-juan2,3,HAN Qian4,CHEN Mian-biao2,3,HUANG Chu-shan2,3,WEI Dong-yang2,3,HU Guo-cheng2,3*
（1.Key Laboratory of Subsurface Hydrology and Ecological Effects in Arid Region of Ministry of Education,Chang’an University,Xi’an 710064,China;2.South China Institutes of Environmental Sciences,Ministry of Environmental Protection,Guangzhou 510535,China;3.State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Pollution Health Risk Assessment,Guangzhou 510535,China;4.Shenzhen A－cademy of Environmental Sciences,Shenzhen 518001,China）

Hexabromocyclododecane（HBCD）is a brominated flame retardant,and has become a ubiquitous pollutant of the environment.To explore the thyroid hormone-disrupting effects of long-term dietary exposure to HBCD,adult zebrafish were exposed to different concentrations of the chemical（0,10,100 ng·g-1,and 400 ng·g-1）for 56 days to determine triiodothyronine（T3）,tetraiodothyronine（T4）,free triiodothyronine（FT3）,and free tetraiodothyronine（FT4）levels,and T3/T4 ratios in the liver tissues of zebrafish.The results showed that HBCD disrupted the action of the thyroid hormone in zebrafish.The levels of T3 and T4 in the liver tissues of the zebrafish decreased significantly with increasing concentrations of HBCD.Significant inhibitory effects on FT3 and FT4 were observed in the 100 ng·g-1and 400 ng·g-1exposure groups（P<0.01）.Moreover,the T3/T4 ratio in the liver tissues increased with increasing HBCD concentration.This result indicated that HBCD could transform T4 into T3.In summary,our findings showed that HBCD could affect thyroid function and homeostatic levels in zebrafish,and could further influence the growth and development of zebrafish.

hexabromocyclododecane;zebrafish;thyroid hormone;disruption

X503.225

A

1672-2043（2017）11-2192-07

10.11654/jaes.2017-0509

劉小燕，劉 珊，張麗娟,等.六溴環十二烷對斑馬魚的甲狀腺激素干擾效應研究[J].農業環境科學學報,2017,36（11）：2192-2198.

LIU Xiao-yan,LIU Shan,ZHANG Li-juan,et al.Thyroid hormone-disrupting effects of hexabromocyclododecane in zebrafish（Danio rerio）[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）:2192-2198.

2017－04－08 錄用日期：2017-07-13

劉小燕（1992—），女，山東聊城人，碩士研究生，研究方向為環境毒理學及水污染控制工程。E-mail：gengjiayanzi@163.com

*通信作者：胡國成 E-mail：huguocheng@scies.org

廣東省自然科學基金（2015A030313790，2015A030313863，2014A030310002）；環境保護部華南環境科學研究所中央級公益性科研院所基本科研業務專項資助項目

Project supported：The Natural Science Foundation of Guangdong Province,China（2015A030313790，2015A030313863，2014A030310002）；The Basic Research Foundation of National Commonwealth Research Institute