磺胺類抗生素對青海弧菌Q67的濃度比依賴性拮抗作用

丁婷婷，張 瑾，2*，董欣琪，洪桂云，鮑立寧

磺胺類抗生素對青海弧菌Q67的濃度比依賴性拮抗作用

丁婷婷1，張 瑾1，2*，董欣琪1，洪桂云1，鮑立寧1

（1.安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601；2.清華大學新興有機污染物控制北京市重點實驗室，北京 100084）

為系統考察磺胺類抗生素藥物（SAs）污染物長期暴露下的生物毒性效應，以5種磺胺類抗生素（SAs）：磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲惡唑（SMX）和磺胺二甲嘧啶（SM2）為研究對象，應用直接均分射線法（Equ-Ray）設計10個二元抗生素混合物體系（每個二元混合物體系設計5條具有不同濃度比的射線），應用優化的長期微板毒性分析法（L-MTA）系統測試這些抗生素在16 h對發光菌青海弧菌（Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67,Q67）的發光抑制毒性，并應用濃度加和模型（CA）分析混合物毒性相互作用。結果表明：5種SAs及其混合物射線對Q67在16 h呈現明顯的毒性，但不同的抗生素毒性大小不同，以半數效應濃度的負對數（pEC50）為毒性大小指標，5 種 SAs的毒性大小順序為：SMX（pEC50=3.95）>SCP（pEC50=3.65）>SPY（pEC50=3.41）>SD（pEC50=3.36）>SM2（pEC50=3.21）；10個SAs的二元混合物體系中7個呈現出加和作用，3個呈現出拮抗作用；3個混合物體系拮抗作用隨組分濃度比的變化呈現不同的變化規律：混合物體系SCP-SPY和SCP-SMX中的射線拮抗作用均隨SCP濃度比逐漸減小，即從R1到R2逐漸明顯，從R2到R5幾乎不變，而SCP-SM2體系，拮抗作用隨組分SCP的濃度比逐漸減小，即從R1到R2逐漸明顯，從R2到R5，逐漸變得不明顯，R5在較高濃度區甚至出現了協同作用。

磺胺類抗生素；混合物；青海弧菌；濃度比依賴性；拮抗作用

磺胺類抗生素藥物（SAs）是應用最早的一類人工合成抗菌藥，主要作為飼料添加劑或治療動物疾病廣泛應用于畜牧和水產養殖業中[1]。SAs藥物的大量生產和應用已導致該藥物進入大氣、水體以及土壤等環境中[2]。據報道，在我國畜禽養殖場糞便中普遍存在磺胺類抗生素的殘留，殘留的抗生素隨動物糞便施肥進入土壤后，有的被植物吸收積累，有的對土壤中的生物產生毒害效應，甚至破壞植物根際周圍的微生態平衡[3-4]。在我國河流及湖泊等天然水環境中，約158種藥物和個人護理產品（Pharmaceuticals and personal care products，PPCPs）被調查出來，其中報道次數較多的20種PPCPs中，磺胺類抗生素被報道次數最多[5]。薛保銘等[6]發現4種磺胺類抗生素和甲氧芐氨嘧啶（TMP）在欽州灣近海及匯海河流均有不同程度存在，其中磺胺類抗生素在欽州灣的海水養殖區均呈現出較高的濃度水平。Li等[7]研究發現白洋淀湖泊中普遍存在喹諾酮類、大環內脂類和磺胺類抗生素，其中磺胺類物質濃度最高（0.9～1563 ng·L-1），同時也發現殘留的抗生素對微生物和水生生物均產生了很強的生態毒性。此外，太湖、武漢城市湖泊等不同湖泊水體中都檢出磺胺類抗生素[8-9]。

然而，進入環境中的抗生素又以各種形式和濃度共存于環境中，形成復雜的各種混合污染物，進而對環境生物產生聯合毒性效應[10-11]。混合污染物所產生的累積毒性與相互作用（協同與拮抗作用）具有更大的潛在風險。因此，系統考察磺胺類抗生素及其混合污染物對暴露生物的毒性具有更重要的現實環境意義。越來越多的研究表明，污染物的毒性是隨暴露時間的延長而逐漸發生發展的[12]。然而，目前大多數的研究只考慮用短時間暴露的急性毒性來評價污染物的毒性效應，很少考慮到長時間暴露條件下，污染物對生物體的干擾，因而不能準確地評定化合物毒性的真實情況。要想深入了解SAs污染物的毒性作用機制，正確評價其生態風險，長期暴露也是一個重要的考慮因素。

在絕大多數的水生生態系統中，細菌尤其是弧菌類是食物鏈中最重要的一個環節，在生態系統的物質循環和能量流動中發揮著重要的作用[13]。對生態系統中細菌的任何外源性干擾都可能對生態系統產生有益或有害的影響。因此，在生態毒理學的研究中，細菌如發光菌費氏弧菌（Vibrio fisher，V.fisheri）和青海弧菌（Vibrio qinghaiensis sp.-Q67，Q67）常作為化學污染物水體毒性的一個重要指示生物[14]。發光菌毒性測試中應用最廣泛的是V.fisheri，但在進行環境樣品生物毒性測試時需要人為加入一定量的NaCl（2%～3%），在淡水體系樣品的檢測中存在一定的局限性[15]。青海弧菌Q67是一種淡水發光菌，克服了V.fisheri的這一缺點，且能夠在很寬的pH值范圍內（6.5～11）生長良好，對毒物的反應敏感。

本文以5種磺胺類抗生素磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲惡唑（SMX）和磺胺二甲嘧啶（SM2）為研究目標，以青海弧菌Q67為指示生物。采用直接均分射線法（Equ-Ray）設計二元混合物，采用長期微板毒性分析法（L-MTA）系統測定磺胺類抗生素及其混合物在長期暴露條件下對Q67的毒性效應，并應用經典加和參考模型分析混合物的毒性相互作用，研究結果將為科學、客觀地評價磺胺類抗生素的環境風險提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：5種磺胺類抗生素：磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲惡唑（SMX）和磺胺二甲嘧啶（SM2）均購自上海原葉生物科技有限公司，其基本理化性質見表1。采用milli-Q水配制抗生素儲備液，保存在棕色瓶中，并置于4℃冰箱中保存，備用。

主要實驗儀器：Synergy 2 Multi-Mode微板光度計（美國BioTek伯騰儀器有限公司）、超凈工作臺（三發儀器有限公司）、FA1004型五位電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）、YX280A手提式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）、SC-242型透明門立式冷藏柜（青島海爾電冰柜有限公司）、BS-2E數顯振蕩培養箱（上海梅香儀器有限公司）、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）和 Dragon-lab單道可調移液器（10～100 μL，大龍興創實驗儀器有限公司）。

表1 5種磺胺類抗生素的基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of five sulfonamide antibiotics

1.2 混合物實驗設計

采用直接均分射線法（Equ-Ray）[16]設計磺胺類抗生素的二元混合物體系，共10組。每組抗生素混合物體系均安排5條具有不同組分濃度配比的射線，共50條混合物射線，其組分構成以及濃度配比見表2。

1.3 菌種的培養、長期微板毒性分析法

青海弧菌 Q67（Vibrioqinghaisensesp.-Q67，Q67）購自北京濱松科技公司，其培養配制參照文獻[12，17]。

預實驗表明，磺胺類抗生素對Q67在12 h內幾乎沒有毒性，只有在12 h后才逐漸出現毒性，在16 h出現明顯的毒性效應，16 h后毒性開始減弱。因此，本研究只需測定5種抗生素對發光菌在暴露時間為16 h的濃度-效應數據，分析方法采用長期微板毒性分析方法（L-MTA）[18]，但在參考文獻的基礎上有所改進，即調整了菌種的初始培養時間：將事先已培養至對數生長期（即相對發光單位值RLU≥9×106）的Q67，轉入等體積的濃縮培養基，并置于22℃培養箱，培養時間縮短為0.5 h（以使其在微孔板中在培養16 h后仍處于對數生長期），加入事先已加入毒物的96孔微板中，在暴露16 h時取出測定微孔板中各孔的發光強度，余下過程同參考文獻[18]。毒物對Q67在不同暴露時間的發光抑制毒性表達為發光抑制率（E）[19]，計算公式如下：

表2 直接均分射線法設計的10組二元混合物體系的組分構成及其濃度比Table 2 The components and their concentration ratios of ten groups of binary mixture systems designed by direct equal partition ray method

式中：I0為24個空白對照孔的RLU的平均值；I為不同濃度處理組3個平行濃度孔的RLU的平均值。

1.4 濃度-效應數據擬合

對于濃度-效應曲線（CRC）為S型的污染物，其在不同暴露時間下的所有濃度-響應數據都需要在APTox軟件程序[20]上進行非線性擬合，同時計算出與CRC模型相對應95%可信度的觀測效應置信區間。化學計量學默認的優化原則是1個優化模型使用的樣本數至少應是該模型參數的5倍，考慮到L-MTA法測定12個數據點的事實，所獲得的濃度-毒性效應數據，主要選擇2個參數的CRC模型，例如Logit（2）和Weibull（3）兩參數函數進行非線性模擬，其中E表示效應（0≤E≤1），c表示單個化合物或者混合物濃度，α和β都是參數。

由于毒性實驗的固有誤差，評估化合物或混合物毒性時必須考察置信區間的范圍，特別是觀測值的置信區間（OCI）。本論文中，OCI是基于實測毒性效應，在顯著性水平為0.05情況下，化合物實驗濃度的可信范圍，即化合物產生某一效應x%時的95%OCI，并且本文是在整個濃度-效應區域內建立整條觀測CRC 的 OCI曲線[21]。

1.5 混合物毒性相互作用分析

通常，混合物毒性相互作用的分析基于某一個標準加和參考模型如濃度加和（CA）基礎上進行的[22]，其計算公式如下：

式中：ci表示混合物產生總效應為x%時第i種組分的濃度；ECx，i為i組分單獨存在時產生等效應x%時的效應濃度。

如果由CA模型預測的混合物濃度-效應曲線（CRC）位于混合物實際觀測毒性的95%OCI內、95%OCI上限的上方或95%OCI下限的下方，則稱該混合物組分間分別是加和作用即沒有毒性相互作用、拮抗作用或協同作用[23-24]。

2 結果與討論

2.1 5種磺胺類抗生素對Q67的單一毒性

Logit函數能較好地擬合抗生素污染物的濃度-效應數據[25]，故本文采用Logit函數對數據進行擬合。將通過MTA法采集的5種抗生素對Q67的濃度-效應數據擬合到非線性函數Logit，其擬合結果及相關統計量見表3，其濃度-效應數據及擬合CRC繪于圖1。從表3可以看出，Logit函數可以很好地擬合5種抗生素的濃度-效應實驗數據（R>0.95，RMSE<0.024）。以半數效應濃度（EC50）的負對數pEC50為毒性大小指標[26-27]，5種抗生素對Q67的毒性差異不大，pEC50值在3.21～3.95之間，毒性最大的是SMX，最小的是SM2。5種抗生素的毒性順序為：SMX（pEC50=3.95）>SCP（pEC50=3.65）>SPY（pEC50=3.41）>SD（pEC50=3.36）>SM2（pEC50=3.21）。圖 1 是 5 種抗生素對發光菌的濃度-效應曲線（CRCs），從圖中可看出其對Q67的CRCs在實驗觀測的濃度范圍內呈現S型，但不平行，說明這5種抗生素對發光菌的毒性大小不同或參數β的大小不同（表3）。

2.2 磺胺類抗生素二元混合物對Q67的毒性

將10組抗生素的二元混合物體系對Q67的濃度-效應數據及擬合CRCs繪于圖2。可以看出，除了SD-SM2和SD-SMX兩個混合物體系的5條射線隨著濃度比有明顯的變化外，其余混合物體系的射線沒有完全分開甚至是重疊的，表明磺胺類抗生素的二元混合物體系的毒性沒有明顯差異，可能是由于這5種抗生素對Q67的毒性在3.21～3.95范圍內，差異不是非常明顯。由于其混合物毒性的復雜性，具體的原因尚需要進一步研究。

表3 5種磺胺類抗生素的Logit函數擬合結果及其統計量擬合參數Table 3 The fitted results by Logit function and its some statistics for the five sulfonamide antibiotics

圖1 5種磺胺類抗生素對Q67的濃度-效應曲線Figure 1 The CRCs of the five kinds of sulfonamide antibiotics on Q67

2.3 磺胺類抗生素二元混合物毒性作用

基于加和參考模型CA對磺胺類抗生素10組二元混合物體系的評估，結果顯示：10組混合物體系中有7條混合物射線呈現經典的加和作用，即CA線全部位于95%OCI的置信區間內，而3組混合物體系（SCP-SPY、SCP-SM2和SCP-SMX）呈現明顯的拮抗作用（圖3），即CA預測線位于95%OCI上限的上方。這可能是由于混合物中各組分的毒性比較接近，或作用于同一個作用位點，導致了相互之間競爭作用位點造成的[28-29]。

圖2 10組磺胺類二元混合物體系對Q67的濃度-效應曲線Figure 2 The concentration-effect curves of the ten group sulfa binary mixture system on Q67

圖3 3組具有毒性相互作用混合物體系對Q67的濃度-效應關系Figure 3 Ray sulfa mixture of three groups of toxic interaction of Q67 concentration-effect relationship

混合物毒性相互作用可能具有組分濃度比依賴性[29-30]。本研究中發現，具有拮抗作用的3組混合物體系的拮抗作用從R1到R2呈逐漸減弱或逐漸增強的趨勢。不同的混合物體系，拮抗作用隨組分濃度比（表2）的變化規律不同：混合體系SCP-SPY和SCP-SMX中的每條射線的拮抗作用從R1到R2逐漸明顯，R3、R4和R5拮抗作用程度接近，而SCP-SM2混合物體系中5條射線的拮抗作用從R1到R2增強，而后從R2至R5逐漸減弱，R5在較高濃度區甚至出現了協同作用。通過進一步分析發現，具有拮抗作用的3組混合物體系雖然具有共同的組分SCP，且其濃度比均從R1至R5逐漸減小，但3組混合物體系卻呈現拮抗作用隨組分濃度比（表2）的不同變化規律也不同。這可能是由于3組混合物體系中另一個組分造成的。在這3組混合物體系中，5條射線（R1至R5）的組分SPY、SM2和SMX的濃度比均是逐漸增大的，說明混和物的組分構成及其濃度配比可能是影響混合物體系的拮抗作用發生發展的重要因素，具體的原因尚需進一步研究。

3 結論

（1）Logit函數能很好地擬合5種磺胺類抗生素及其混合物對Q67的濃度-效應數據，5種抗生素對Q67的毒性差異不大，其毒性順序為：SMX（pEC50=3.95）>SCP（pEC50=3.65）>SPY（pEC50=3.41）>SD（pEC50=3.36）>SM2（pEC50=3.21）。

（2）依據加和參考模型CA，10組二元混合物體系中，7組混合物體系呈經典的加和作用，3組混合物體系SCP-SM2、SCP-SMX和SCP-SPY呈現出明顯的拮抗作用。

（3）具有拮抗作用的3組混合物體系均含有共同的組分SCP，但拮抗作用隨組分濃度配比變化而呈現出不同的變化規律：從R1至R5，3組混合體系中的SCP濃度比逐漸減小，SPY、SMX和SM2的濃度比逐漸增大，而SCP-SPY和SCP-SMX中的拮抗作用從R1到R2逐漸明顯，從R2到R5幾乎不變，而SCPSM2混合物體系中5條射線的拮抗作用從R1到R2逐漸明顯，從R2到R5，拮抗作用逐漸變得不明顯，R5在較高濃度區甚至出現了協同作用。

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Concentration-ratio-dependent antagonism of sulfonamide antibiotics towards Vibrio qinghaiensis sp.-Q67

DING Ting-ting1,ZHANG Jin1,2*,DONG Xin-qi1,HONG Gui-yun1,BAO Li-ning1
（1.Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province,College of Environment and Energy Engineering,Anhui Jianzhu University,Hefei 230601,China;2.Beijing Key Laboratory for Emerging Organic Contaminants Control,Tsinghua University,Beijing 100084,China）

To investigate the long-term toxicity of sulfonamide antibiotics（SAs）towards organisms,five SAs：sulfamethazine（SCP）,sulfamethoxazole（SD）,sulfasalazine（SPY）,sulfadiazine（SMX）,and sulfachloro pyridazine（SM2）were selected as research subjects.The direct equipartition ray method was used to design ten binary mixture systems,and five rays with different concentration ratios（pis）were arranged in each mixture system.The toxicities of the five SAs and their mixture systems towards the photobacterium Vibrio qinghaiensis sp.-Q67 were determined using the optimized long-term microplate toxicity analysis（L-MTA）method.Concentration addition was employed as the standard reference model to analyze the toxicity interaction within mixture systems.The results showed that the toxicities of the five SAs and their mixture rays displayed obvious differences after 16 h.Based on the negative logarithm of median effect concentration（pEC50）,the toxicity order of the five SAs was as follows：SMX（pEC50=3.95）>SCP（pEC50=3.65）>SPY（pEC50=3.41）>SD（pEC50=3.36）>SM2（pEC50=3.21）.Seven out of the ten mixture systems displayed additive action and the other three,SCP-SPY,SCP-SMX,and SCP-SM2,showed different antagonism.Antagonism of SCP-SPY and SCP-SMX gradually strengthened with the decrease of component SCP′s pis from R1 to R2,and then was mostly stable from R2 to R5.The antagonism of the SCP-SM2 mixture system strengthened with the decrease of SCP’s pis from R1 to R2,then declined gradually from R2 to R5,and synergism appeared in the relatively high concentration region of R5.

sulfonamide antibiotics;mixture;Vibrio qinghaiensis sp.-Q67;concentration-ratio dependency;antagonism

X171.5

A

1672-2043（2017）11-2199-08

10.11654/jaes.2017-0722

丁婷婷，張 瑾，董欣琪，等.磺胺類抗生素對青海弧菌Q67的濃度比依賴性拮抗作用[J].農業環境科學學報,2017,36（11）：2199-2206.

DING Ting-ting,ZHANG Jin,DONG Xin-qi,et al.Concentration-ratio-dependent antagonism of sulfonamide antibiotics towards Vibrio qinghaiensis sp.-Q67[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）:2199-2206.

2017－05－17 錄用日期：2017－07－05

丁婷婷（1992—），女，安徽蕪湖人，碩士研究生，研究方向為毒理學。E-mail：1373639545@qq.com

*通信作者：張 瑾 E-mail：ginnzy@163.com

國家自然科學基金項目（21677001，21207002）；安徽省自然科學基金項目（1708085MB50）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（21677001，21207002）；Natural Science Foundation of Anhui Province，China（1708085MB50）