不同大氣環境中白皮松針葉重金屬積累及抗性特征研究

俎麗紅，王 鑫，王潤璽，午紅蕊，黃亞萍，石福臣

不同大氣環境中白皮松針葉重金屬積累及抗性特征研究

俎麗紅，王 鑫，王潤璽，午紅蕊，黃亞萍，石福臣*

（南開大學生命科學學院，天津 300071）

為了解白皮松（Pinus bungeana Zucc.）針葉在不同大氣環境中對重金屬的積累狀況和抗性特征，分別測定了城區、郊區和山區的白皮松當年生、二年生和三年生針葉中Cu、Mn、Zn和Cd的含量，比較了3種年齡針葉中超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量。結果表明：在不同采樣點，白皮松針葉中的Cu、Mn、Zn和Cd的含量表現為城區>郊區>山區；在不同年齡間，Cu、Mn和Cd的含量在山區表現為三年生＞二年生＞當年生，而在城區、郊區和山區Zn的含量則隨著針葉年齡的增加而降低。采樣點對針葉中Cu、Zn和Cd的含量影響較大，而針葉年齡對Mn的影響較大。針葉中重金屬含量的增加促進了MDA、可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的積累。隨著針葉年齡的增加，白皮松針葉SOD活性呈現下降趨勢，并在山區最低；山區當年生白皮松針葉SOD活性顯著低于郊區和城區。相關性分析表明，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸與4種重金屬呈顯著或極顯著正相關。綜上表明，白皮松三年生針葉對于大氣重金屬污染具有監測價值；針葉中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸對重金屬造成的氧化脅迫具有指示作用；白皮松積累可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸可能是其抵御重金屬脅迫的一種適應機制。

白皮松；重金屬；針葉年齡；抗性指標

近年來，隨著工業化和城市化的快速發展，大氣污染問題備受矚目。大氣顆粒物（PM10和PM2.5）比表面積大、成分復雜，能吸附大量重金屬，如Zn、Cu、Cd等，不僅污染環境，還可通過多種途徑進入人體，給人類健康造成不利影響[1-2]。大氣顆粒物的重金屬污染已成為當前大氣污染的研究熱點之一[3]。植物能通過氣孔吸收大氣重金屬，并將其積累于體內，使形態結構和生理生化特征發生改變[4]。重金屬脅迫能導致超氧陰離子和過氧化氫等大量活性氧自由基（ROS）的產生，造成脂質過氧化和細胞代謝異常[5]。由于植物可以直接反應空氣污染狀況，在環境監測方面，常作為常規氣象觀測技術的補充而廣泛應用于大氣污染的防治與監測[6-7]。植物葉片通過干濕沉降或對顆粒物的攔截吸附重金屬，進而將重金屬吸收到葉片[8]。因此植物葉片中積累的重金屬量，以及葉片本身的抗性生理指標，不僅能真實反映該地區空氣污染狀況，也可以反映空氣污染對生物的影響[9-11]。與闊葉樹木相比，常綠針葉植物在空氣污染發生嚴重的秋冬季節仍保持生長，且針葉表面有發達的氣孔線，可以從環境中大量吸收污染物，因而更能反映大氣環境的變化過程[12]。

目前國內外對常綠植物與大氣環境的相關研究多集中在針葉的滯塵能力及對污染的監測方面，對于滲透調節物質的報道不多。事實上植物在污染的大氣環境下，體內可以積累可溶性蛋白和游離脯氨酸等滲透調節物質以抵抗環境脅迫[13]。

本研究以白皮松（Pinus bungeana）為材料，測定了白皮松在城區、郊區、山區不同大氣環境中各年齡針葉中Cu、Mn、Zn、Cd重金屬的含量，為揭示白皮松在不同大氣環境中重金屬的積累狀況，明確不同年齡針葉對重金屬污染物的累積效應和抗性生理特征，進而為闡明植物與空氣污染的生態關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料選擇各地常用的園林綠化植物——白皮松。白皮松屬于松科（Pinaceae）常綠喬木，針葉3針一束，是我國特有樹種[14]。因為白皮松在華北地區栽培廣泛，其針葉易區分年齡，所以是本研究比較理想的材料。

1.2 采樣地點

通過分析天津市環境空氣質量GIS發布平臺的數據發現，城區和郊區的大氣污染程度明顯高于山區。以空氣中 PM2.5為例，城區（591～618 μg·m-3）和郊區濃度（304 μg·m-3）均高于我國空氣質量標準（GB 3095—2012）規定的濃度限值（75 μg·m-3），而山區低于該標準限值[15]。因此，本研究選取城區、郊區、山區3個大氣污染程度不同的地點作為采樣點（圖1）。

圖1 樣點分布圖Figure 1 The location of sample sites

1.3 樣品的收集與處理

在城區、郊區和山區各選取樹高、胸徑、生長狀況一致的白皮松5株，每株樹間隔10 m。在樹高約2 m處按東、西、南、北四個方位采集當年生（C）、二年生（C+1）和三年生（C+2）針葉及林冠下表層土壤（0～5 cm）。之后針葉按年齡混合均勻，表層土壤按樣點混合均勻，并將其小心裝入自封袋帶回實驗室[16]。

采集的植物樣品隨機取一部分先用自來水清洗，再用去離子水沖洗3次，最后用超純水沖洗3次，以清除針葉表面的灰塵，一部分不清洗。清洗完畢的植物鮮樣一部分用于測定抗性指標，另一部分和未清洗鮮樣在105℃下殺青30 min，80℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩。土壤樣品自然風干，過篩[17]。用分析天平分別稱取0.500 0 g針葉和土壤干樣，放置聚四氟乙烯管中，按一定比例加入優級純濃硝酸和濃鹽酸，用微波消解儀進行消解[18]。消解后的溶液定容至25 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，用火焰原子吸收分光光度計（SP-3520AA，上海光譜）測定 Cu、Mn、Zn和 Cd的含量。針葉中超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；游離脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[19]。

1.4 數據分析

數據為3次實驗的平均值±標準誤。采用Excel 2013軟件整理數據并繪制圖表，SPSS 22.0統計分析軟件對數據進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA）、單因素方差分析（One-way ANOVA），并用最小顯著差法（LSD）對數據進行多重比較，P<0.05。以未清洗與清洗針葉中重金屬含量的差值作為大氣重金屬含量的相對值[20]。采用Pearson相關系數分析針葉重金屬含量和抗性指標的相關性。

2 結果與分析

2.1 白皮松針葉中Cu、Mn、Zn和Cd的含量

白皮松針葉中重金屬積累情況如表1所示，可以看出，在城區、郊區和山區，相同年齡針葉中重金屬含量存在差異。當年生針葉中Cu、Mn、Zn和Cd的含量表現為城區>郊區>山區；二年生針葉中，郊區和城區的Cu、Mn、Zn和Cd的含量均顯著高于山區；三年生針葉中Cu、Mn、Zn和Cd的含量表現為城區>郊區>山區。由表1可知，在相同樣點，不同年齡針葉對重金屬的積累情況也存在差異。在城區，隨著針葉年齡的增加，三年生針葉中Cu、Mn和Cd的含量分別比當年生針葉提高了18%、14%和73%；在郊區，二年生和三年生針葉中Cu、Mn和Cd的含量均顯著高于當年生針葉；在山區，二年生和三年生針葉中Mn的含量分別是當年生針葉的2.2倍和3.3倍，三年生針葉中Cu和Cd的含量顯著高于當年生針葉；而在三個樣點，Zn的含量隨著針葉年齡的增加逐漸降低。

采樣點、針葉年齡與白皮松針葉中重金屬含量的方差分析結果如表2所示，可以看出采樣點和針葉年齡對針葉中重金屬的積累情況均有顯著影響。針葉中Cu、Zn和Cd的含量均受到采樣點和針葉年齡的顯著影響，采樣點比針葉年齡影響更大，對針葉中的Mn而言，針葉年齡對其影響比采樣點影響更大。

2.2 白皮松針葉中重金屬元素的來源分析

2.2.1 采樣點表層土壤中重金屬含量

各個采樣點表層土壤重金屬含量如表3所示，可以看出城區、郊區和山區表層土壤中Cu、Mn、Zn和Cd含量存在差異。土壤中Cu的含量城區和郊區分別是山區的4.5倍和1.9倍，Mn的含量城區和郊區分別是山區的2.1倍和1.6倍，Zn和Cd的含量城區、郊區和山區也存在顯著差異。城區可能存在嚴重的重金屬污染，即隨著城區、郊區、山區環境變化土壤重金屬含量逐漸降低。

2.2.2 針葉與大氣、土壤重金屬含量的回歸分析

植物主要通過土壤吸收和大氣沉降兩個途徑吸收環境中的金屬元素，將大氣重金屬含量的相對污染值取未清洗與清洗針葉中重金屬含量的差值，二者之間重金屬含量的線性回歸可以用來研究大氣重金屬含量對針葉重金屬積累的影響[20]。從圖2可以看出，針葉與大氣中Cu、Mn和Cd含量存在極顯著相關性，說明大氣中的重金屬對針葉中重金屬的積累產生顯著影響。針葉與表層土壤中Cu、Mn和Cd存在顯著正相關關系，與Zn存在極顯著正相關關系，說明針葉中重金屬含量不僅與大氣重金屬的含量有關，也可能與土壤重金屬含量有關。

表 1 白皮松針葉中 Cu、Mn、Zn 和 Cd 的含量（mg·kg-1）Table 1 The contents of Cu,Mn,Zn and Cd in P.bungeana needles（mg·kg-1）

表2 采樣點、針葉年齡和二者交互對針葉中重金屬含量的方差分析Table 2 ANOVA results for sampling sites（SS），needles ages（NA）and sampling sites×needle ages（SS×NA）for heavy metals contents

表3 不同采樣點表層土壤重金屬含量（mg·kg-1）Table 3 Heavy metal contents in top soil of different sites（mg·kg-1）

2.3 白皮松針葉中抗性指標的分析

2.3.1 白皮松針葉中SOD活性

針葉中SOD活性如圖3所示，可以看出，相同年齡針葉中SOD活性總體趨勢表現為城區>郊區>山區。當年生針葉中SOD活性表現為城區>郊區>山區，郊區和城區分別比山區提高了17%和19%，而城區和郊區二者間差異不顯著；二年生針葉中SOD活性，城區顯著高于山區和郊區；三年生針葉中SOD活性表現為城區>郊區>山區，城區比山區提高了14%。由圖3也可以得知，在相同采樣點，不同年齡針葉中SOD活性也存在差異。在城區，隨著針葉年齡的增加，二年生和三年生針葉SOD活性分別比當年生針葉降低了14%和32%；在郊區，3種年齡針葉中SOD活性存在顯著差異，二年生和三年生針葉分別比當年生針葉下降了22%和38%；在山區，隨著針葉年齡的增加，SOD活性逐漸降低。

2.3.2 白皮松針葉中MDA含量

白皮松針葉中MDA的含量如圖4所示，可以看出相同年齡針葉，不同采樣點MDA含量總體表現為城區>郊區>山區。當年生針葉中MDA含量表現為城區>郊區>山區，郊區和城區分別比山區增加了57%和145%；二年生針葉中MDA含量，郊區和城區分別是山區的1.2倍和1.3倍；三年生針葉中MDA含量城區顯著高于山區，城區和郊區間差異不顯著。從圖4還可以看出，相同采樣點，不同年齡針葉中MDA含量也存在差異。在城區，針葉中MDA含量隨著年齡的增加而增加，二年生和三年生均顯著高于當年生；在郊區，二年生針葉和三年生針葉中MDA含量分別是當年生針葉的2.3倍和2.4倍；在山區，隨著針葉年齡的增加，針葉中MDA含量逐漸增多。

2.3.3 白皮松針葉中滲透調節物質含量

針葉中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量分別如圖 5（a）、（b）和（c）所示，可以看出在 3 個采樣點，相同年齡針葉中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量均存在差異。當年生針葉中，可溶性蛋白和可溶性糖含量表現為城區>郊區>山區，而山區和郊區差異不顯著；游離脯氨酸含量郊區和城區分別是山區的2.2倍和4.2倍。二年生針葉中，可溶性蛋白含量城區和郊區分別是山區的2.9倍和1.7倍；可溶性糖含量城區顯著高于山區和郊區；游離脯氨酸含量城區和郊區顯著高于山區。三年生針葉中，可溶性蛋白含量城區最高（4.27 mg·g-1FW），分別是山區和郊區的3.9倍和1.8倍；可溶性糖含量城區分別是山區和郊區的11.1倍和8.0倍；游離脯氨酸含量郊區和城區顯著高于山區。從圖5還可得知，在相同采樣點，不同年齡針葉中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量也存在差異。無論在城區、郊區還是山區，隨著針葉年齡的增加，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量表現為三年生>二年生>當年生。在城區，可溶性蛋白含量三年生是當年生的3.2倍；可溶性糖含量三年生比當年生增加了47%；游離脯氨酸含量在3種年齡間存在顯著差異。在郊區，可溶性蛋白含量三年生和二年生分別是當年生的3.5倍和2.3倍；可溶性糖含量三年生和二年生分別比當年生提高29%和22%。

圖2 針葉中重金屬含量與大氣或表層土壤重金屬含量的回歸分析Figure 2 Regression analysis between the contents of heavy metals in needles and atmosphere or topsoil

圖3 白皮松針葉中SOD活性Figure 3 The superoxide dismutase activity in P.bungeana needles

圖4 白皮松針葉中MDA的含量Figure 4 The malondialdehyde content in P.bungeana needles

2.4 白皮松針葉中Cu、Mn、Zn和Cd與抗性指標間的相關性分析

針葉中重金屬含量和抗性指標的Pearson相關性分析如表4所示。當年生針葉中，SOD與Cu、Zn和Cd存在顯著正相關關系；MDA含量與Cu、Mn、Zn和Cd存在極顯著正相關關系；可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量均與針葉中四種重金屬呈顯著正相關關系。二年生針葉中，SOD與Mn、Zn和Cd存在顯著正相關關系，MDA含量與Cu和Zn呈極顯著相關，與Mn和Cd存在顯著相關關系；可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸與Cu、Mn、Zn和Cd存在顯著或極顯著正相關關系。三年生針葉中，SOD與Mn、Zn和Cd呈極顯著正相關，與Cu呈顯著正相關關系；可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量均與四種重金屬含量存在顯著或極顯著正相關關系。

圖5 白皮松針葉中滲透調節物質含量Figure 5 The osmoregulation substance contents in P.bungeana needles

3 討論

3.1 白皮松針葉對重金屬的積累能力

植物通過葉片上的氣孔吸收大氣污染物，并將其積累或降解，從而起到凈化大氣的作用[20]。有研究表明，植物葉片對重金屬的累積量與大氣中重金屬的含量密切相關[21]。在本研究中的3個采樣點，白皮松針葉中Cu、Mn、Zn和Cd的含量表現為城區>郊區>山區，說明城區重金屬污染比山區和郊區嚴重。有研究表明，大氣污染環境下，針葉年齡對重金屬的積累有影響，老葉比新葉能積累更多重金屬，老葉比新葉更具有監測價值[22-23]。在城區，三年生針葉中Cu、Mn和Cd的含量高于當年生和二年生針葉，山區和郊區也存在相似的現象，說明重金屬在針葉中的積累是不均衡的。重金屬的積累量隨著針葉年齡以及與環境接觸時間的增加而增加的現象，進一步說明白皮松老葉比新葉更具有監測價值。然而，在城區、郊區和山區，隨著針葉年齡的增加，針葉中Zn含量逐漸下降，可能在植物衰老的葉片中Zn能運輸轉移至幼嫩的葉子中，這種轉移可以提高必需元素的利用率[24-25]。

表4 白皮松針葉中重金屬含量與抗性指標之間的相關性分析Table 4 Correlation coefficients between heavy metals and resistance indexes in P.bungeana needles

相關研究表明，植物體內的重金屬含量可以反映土壤和大氣的污染水平[26]，本研究發現針葉中重金屬含量不僅與大氣重金屬含量相關，也與土壤重金屬含量呈正相關，說明針葉中的重金屬不僅來源于大氣，而且體內也積累了來自于土壤的重金屬。陳培飛等[27]的研究表明，PM2.5中Cu和Zn的含量分別達0.13、1.08 μg·m-3，說明針葉表層吸附的大氣沉降物含有大量的重金屬元素。

3.2 白皮松針葉重金屬對其抗性生理特性及滲透調節物質的影響

在正常情況下，細胞內自由基的產生和清除處于動態平衡狀態。當植物受到重金屬脅迫時，會造成植物體自由基的過量積累，造成氧化脅迫[28]。為了保護自身免受傷害，植物進化出了有效的抗氧化系統以清除活性氧自由基[29]。SOD在活性氧清除系統中作為第一道防線，可以催化超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫。在本研究中，在城區中當年生針葉中SOD活性顯著高于山區和郊區，在二年生和三年生針葉中也可以看到相似的現象，這可能因為城區針葉中重金屬元素含量較高，脅迫較嚴重，SOD活性提高，進一步促進酶庫中酶被激活或者是編碼SOD的基因表達增加[30-31]。無論在城區、郊區還是山區，隨著針葉年齡的增加，SOD活性逐漸下降，可能是植物體內滲透調節物質一定程度上緩解了脅迫，使植物適應了環境；或者可能是隨著針葉年齡中重金屬的積累增加，過量的過氧化氫抑制了酶的活性[30，32]。

MDA是不飽和脂肪酸過氧化的最終產物，其含量可以反映細胞膜脂類過氧化程度，因而MDA含量常被作為鑒別逆境傷害程度的指標之一[33-34]。有研究表明，重金屬會使植物MDA含量升高，體內MDA含量越高，植物受脅迫越嚴重[35]。在本研究中，無論在城區、郊區還是山區，同年齡針葉中MDA含量表現為城區>郊區>山區，說明城區白皮松受脅迫嚴重，與針葉中重金屬含量結果一致。在城區，隨著針葉年齡增加MDA含量逐漸增加，相同的積累模式可以在山區和郊區中觀察到。從表4可知，針葉中MDA含量與重金屬含量存在正相關關系，MDA含量的增加可能是由于植物體內重金屬積累引起的。

植物在受到重金屬等逆境脅迫時，會迅速積累脯氨酸，可溶性蛋白、可溶性糖以及有機酸等一系列滲透調節物質，從而增強植物的抵抗能力[36]。蛋白質合成是植物抵抗重金屬脅迫的機制之一，可溶性蛋白含量是植物生理狀態的重要指標[37]。相關研究表明，重金屬脅迫下，植物體內可溶性蛋白含量增加[4]。在本研究中，相同年齡針葉中可溶性蛋白含量表現為城區>郊區>山區，針葉中可溶性蛋白含量的增加可能是細胞補償與金屬結合而失活的蛋白的機制，也可能是應激蛋白增加的結果[38-39]。可溶性糖是構成植物體生物大分子的碳架和主要能量來源，可以有效地提高細胞滲透壓，降低水勢[40-41]。有研究表明，可溶性糖能通過保護膜結構和滲透調節來緩解脅迫[37]。在本研究中，可溶性糖含量城區顯著高于山區和郊區。游離脯氨酸與植物體氧自由基的清除有密切關系，能抑制大氣重金屬污染導致的膜脂過氧化[42]。有研究表明，在大氣污染環境下，植物體積累游離脯氨酸是一種普遍的現象[43-44]，并發現在污染區，歐洲赤松（P.sylvestris）在重金屬脅迫下，體內脯氨酸積累量增加[45]。在本研究中，針葉中游離脯氨酸含量表現為城區>郊區>山區，與前人研究結果一致。長期生長在污染嚴重地區的白皮松未見形態學上的受害病癥，說明這些有機小分子滲透調節物質避免了生物大分子物質受到損害，起到維持細胞正常生理功能的作用。在本研究中，相關性分析表明，針葉中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸與Cu、Mn、Zn和Cd呈顯著或極顯著正相關關系，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸可能作為指示重金屬脅迫的常用指標。

4 結論

（1）天津城區白皮松針葉中重金屬含量顯著高于山區和郊區，說明城區的重金屬污染較山區和郊區嚴重。

（2）相同樣點針葉中的 Cu、Mn、Cd 含量，三年生針葉中積累量顯著高于當年生，說明老葉比新葉更具有生物監測價值。

（3）相關性分析表明，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸與Cu、Mn、Zn和Cd存在極顯著正相關關系，表明白皮松在遭受重金屬脅迫時可能主要通過積累這三種滲透調節物質實現自我保護和對污染環境的生態適應。

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Study on resistance characteristics to heavy metal accumulation of Pinus bungeana Zucc.needles from different atmospheric environments

ZU Li-hong,WANG Xin,WANG Run-xi,WU Hong-rui,HUANG Ya-ping,SHI Fu-chen*
（College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin 300071,China）

The purpose of this study was to determine the contents of Cu,Mn,Zn,and Cd in current-year（C）,2-year old（C+1）,and 3-year old（C+2）needles of Pinus bungeana Zucc.from urban,suburban,and rural areas.Analysis also concerned resistance indices including superoxide dismutase（SOD）activity and the malondialdehyde（MDA）,soluble protein,soluble sugar,and free proline contents in needles.Results showed that the urban area had the highest accumulation of Cu,Mn,Zn,and Cd in needles of the same age from different sites.Accumulation of Cu,Mn,and Cd increased with age for needles from the rural area whereas that of Zn decreased with needle age for all three sites.Meanwhile,two-way analysis of variance（ANOVA）was used to evaluate the interactions between sampling site and plant species and showed that the sampling site played a greater role than needle age for Cu,Zn,and Cd,whereas for Mn,the effect of needle age was greater than that of the sampling site.MDA,soluble protein,soluble sugar,and free proline contents in the needles were elevated because of increasing heavy metal accumulation.SOD activity decreased with age and was the lowest in the rural area.Correlation analysis showed that the Cu,Mn,Zn,and Cd contents had a significant or extremely significant positive correlation with the soluble protein,soluble sugar,and free proline contents in the needles.In conclusion,the 3-year old needles of P.bungeana are considered suitable biomonitors for heavy met－al pollution in the environment.The soluble protein,soluble sugar,and free proline contents in the needles seem to be good indications for the oxidative stress caused by heavy metals and may be involved in an adaptation mechanism to external stress.

Pinus bungeana Zucc.;heavy metals;needle age;resistance index

X503.235

A

1672-2043（2017）11-2207-09

10.11654/jaes.2017-0332

俎麗紅，王 鑫，王潤璽,等.不同大氣環境中白皮松針葉重金屬積累及抗性特征研究[J].農業環境科學學報,2017,36（11）：2207-2215.

ZU Li-hong,WANG Xin,WANG Run-xi,et al.Study on resistance characteristics to heavy metal accumulation of Pinus bungeana Zucc.needles from different atmospheric environments[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）:2207-2215.

2017－03－10 錄用日期：2017-05-23

俎麗紅（1991—），女，碩士研究生，從事環境與資源植物學研究。E-mail：zulihong2015@163.com

*通信作者：石福臣 E-mail：fcshi@nankai.edu.cn

國家級大學生創新訓練計劃（201610055097）

Project supported：National Undergraduate Training Program for Innovation（201610055097）