川芎嗪通過下調JNK磷酸化抑制PM2.5誘導的血管平滑肌細胞增殖

萬 強，楊玉萍，楊 雪，陳洪濤，萬蟬俊，徐 驲

（江西中醫藥大學附屬醫院1.心血管病科，2.肺病科，江西南昌 330006）

·論 著·

川芎嗪通過下調JNK磷酸化抑制PM2.5誘導的血管平滑肌細胞增殖

萬 強1，楊玉萍2，楊 雪1，陳洪濤1，萬蟬俊1，徐 驲1

（江西中醫藥大學附屬醫院1.心血管病科，2.肺病科，江西南昌 330006）

目的探討川芎嗪（TMP）對PM2.5誘導的大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）增殖的影響及作用機制。方法以PM2.520，200和400 mg·L-1染毒培養VSMC 24 h，MTT法檢測VSMC存活，ELISA法檢測細胞黏附分子1（VCAM-1）含量，放射免疫分析（RIA）法和硝酸還原酶法分別檢測內皮素1（ET-1）和一氧化氮（NO）含量，Western蛋白印跡法檢測VSMC中成纖維細胞生長因子受體1（FGFR-1）蛋白表達。分別加入TMP 20，200和2000 mg·L-1及JNK抑制劑SP600125 10 μmol·L-1檢測TMP對PM2.5的干預作用及機制。結果與正常對照組比較，PM2.5200和400 mg·L-1處理組A570nm顯著升高，VCAM-1和ET-1分泌增加，NO分泌降低，p-JNK及FGFR-1蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；PM2.520 mg·L-1處理組上述指標無顯著變化。與PM2.5200 mg·L-1處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 200和2000 mg·L-1預處理組A570nm顯著降低，VCAM-1及ET-1分泌降低，NO分泌增加，p-JNK和FGFR-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；PM2.5200 mg·L-1+TMP 20 mg·L-1預處理組無顯著變化。與PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1預處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1+SP600125 10 μmol·L-1抑制劑組可進一步增強TMP對上述指標的影響（P＜0.05，P＜0.01）。結論TMP可能通過下調JNK磷酸化，并調節VSMC內FGFR-1蛋白表達及VCAM-1，ET-1和NO含量，抑制PM2.5誘導的VSMC增殖。

PM2.5；川芎嗪；c-Jun氨基端激酶；血管平滑肌細胞

研究表明，空氣動力學直徑＜2.5 μm的懸浮細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）可負載鉛、鎘和砷等重金屬有毒有害物質及硫化鹽、甲醛等化學物質，可誘發呼吸系統和心血管系統疾病（cardiovascular disease，CVD）的發生，空氣污染已納入我國CVD危險因素范疇［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD重要病理基礎，長期吸入PM2.5可通過促炎、誘導氧化應激損傷、增加血管內皮細胞損傷等導致AS的發生［2］，但其機制尚未完全明確。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是血管壁的重要成分，可調節血管的收縮及舒張功能，其異常增殖導致的血管腔狹窄和痙攣是促進AS發生的重要病理基礎［3］。c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶超家族成員之一，可被多種因素激活，與CVD有密切聯系，且對于細胞的增殖、分化和凋亡等起關鍵調控作用。JNK磷酸化的激活，可通過增加成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor-1，FGFR-1）蛋白表達、減少氣體信號傳遞分子一氧化氮（nitric oxide，NO）含量、誘導VSMC增殖及促進炎癥因子浸潤等而致AS形成［4］。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中分離提純得到的一種生物堿，臨床上廣泛用于治療CVD。研究表明，TMP可通過調節脂質代謝、減輕氧化應激損傷、減少血管內皮細胞凋亡和抗炎等途徑發揮抗AS作用［5-7］，但TMP抗AS作用機制未完全闡明。本研究觀察PM2.5對大鼠VSMC增殖的影響，用TMP和JNK信號通路阻滯劑SP600125干預，探討TMP對PM2.5影響VSMC增殖的干預作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

5周齡雄性SD大鼠，體質量90～110 g，購自南昌大學醫學部實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（贛）2010-0002。

鹽酸TMP注射液（哈爾濱三聯藥業有限公司，批號2016020198）；四甲偶氮唑藍（methyl thiazolyltetrazolium，MTT）和二甲亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）（美國Sigma公司）；DMEM培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國 Gibco公司）；兔抗小鼠FGFR-1單抗、兔抗小鼠JNK單抗、兔抗小鼠p-JNK單抗、兔抗小鼠β肌動蛋白單抗和HRP標記山羊抗兔IgG二抗（美國Cell Signal Technology公司）；JNK抑制劑SP600125（美國Tocris Bioscience公司）；β肌動蛋白免疫組化試劑盒（美國Santa Cruz公司）；細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）試劑盒（美國eBioscience公司）；內皮素1（endothelin-1，ET-1）放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術研究所）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

MiniVol型便攜式PM2.5采樣器和ST16R型低溫高速離心機（美國Airmetrics公司）；MK3型酶標儀和3111型恒溫細胞培養箱（美國Thermo公司）；石英纖維濾膜（美國Whatman公司）；IX71型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；165-1801型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 VSMC原代培養和鑒定

以1 mL戊巴比妥鈉（1.0 g·L-1）ip麻醉SD大鼠，無菌條件下完整分離主動脈，剝離血管內、外膜后剪成1 mm×1 mm碎片，加入含20%FBS的DMEM培養基在含5%CO2的37℃恒溫培養箱內，以組織貼塊法培養VSMC，待細胞80%～90%融合后進行傳代，相差顯微鏡觀察細胞形態，β肌動蛋白免疫組化染色鑒定。細胞胞漿呈細顆粒狀棕黃色沉淀，均勻分布，判定為VSMC細胞。取4～8代對數生長期的VSMC進行實驗。

1.3 PM2.5的采集和制備

參照南昌市環保局發布的空氣質量預報，選擇2016年1～3月空氣質量等級為重度污染及以上的天氣，PM2.5采樣器置于交通主干道旁距離地面約50 m高的采樣點，以5 L·min-1流量進行24 h連續采樣，共3 d。將載有采樣顆粒物的石英纖維濾膜剪成1 cm×3 cm大小浸于去離子水，超聲振蕩30 min×3次洗脫采樣顆粒物，用6層無菌紗布過濾振蕩液，4℃以4472×g離心20 min分離提取物，真空冷凍并干燥成干粉。加滅菌PBS緩沖液配制質量濃度為20，200和400 mg·L-1的PM2.5混懸液。

1.4 VSMC分組和處理

VSMC按照處理分為正常對照組、PM2.520，200和400 mg·L-1處理組（作用24 h）［8］、TMP 20，200和2000 mg·L-1預處理組（TMP預處理1 h［9］后，加 PM2.520，200和 400 mg·L-1染毒 24 h）、PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1+SP600125 10 μmol·L-1抑制劑組（TMP 2000 mg·L-1預處理VSMC 1 h+JNK 抑制劑 SP600125 10 μmol·L-1處理30 min［10］+PM2.5200 mg·L-1作用VSMC 24 h）。

1.5 MTT法檢測VSMC存活

VSMC以每孔1×104接種于96孔板，每組設6個復孔，24 h后棄原培養基，加入PM2.5混懸液。PM2.5染毒后加入20 μL MTT 5 g·L-1，37℃，5%CO2恒溫培養箱培養4 h，棄上清后加DMSO 150 μL低速振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm波長處各孔吸光度（A570nm）。

1.6 VSMC中VCAM-1，ET-1和NO含量的測定

VSMC以1×108接種于培養皿。酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞培養液上清VCAM-1含量；收集VSMC并以PBS為勻漿介質破碎細胞取上清，放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）法檢測ET-1含量；硝酸還原酶法檢測NO含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.7 Western蛋白印跡法檢測VSMC中p-JNK和FGFR-1蛋白表達

提取VSMC總蛋白，定量后煮沸5 min進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉印至PVDF膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST沖洗；加一抗（1∶1000稀釋）于4℃過夜，TBST沖洗；加二抗（1∶2000稀釋）37℃孵育1 h，化學發光試劑曝光。Quantity One軟件采集p-JNK，FGFR-1及β肌動蛋白條帶積分吸光度值，以p-JNK和FGFR-1與β肌動蛋白積分吸光度比值表示蛋白表達水平。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 PM2.5對VSMC存活的影響

MTT結果顯示（圖1），與正常對照組比較，PM2.5200和400 mg·L-1處理組A570nm顯著升高（P＜0.01），PM2.520 mg·L-1處理組A570nm無明顯變化。提示PM2.5200和400 mg·L-1可顯著誘導VSMC增殖。

Fig.1 Effect of PM2.5on survival of vascular smooth muscle cells（VSMCs）of rats by MTT.VSMCs were treated with PM2.5for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control（0）group.

2.2 PM2.5對VSMC分泌VCAM-1，ET-1和NO的影響

結果顯示，與正常對照組比較，PM2.5200和400 mg·L-1處理組VCAM-1和ET-1分泌增加（P＜0.01），NO分泌減少（P＜0.01）；PM2.520 mg·L-1處理組無顯著變化。提示PM2.5200和400 mg·L-1可誘導VSMC中VCAM-1和ET-1分泌增加，NO分泌減少（表1）。

Tab.1 Effect of PM2.5on vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1），endothelin-1（ET-1）and nitric oxide（NO）levels of VSMCs in rats

2.3 PM2.5對VSMC中p-JNK和FGFR-1蛋白表達水平的影響

Western蛋白印跡結果（圖2）顯示，與正常對照組比較，PM2.5200和400 mg·L-1處理組p-JNK和FGFR-1蛋白水平顯著增加（P＜0.01），PM2.520 mg·L-1處理組無顯著變化。因為PM2.5200 mg·L-1對VSMC增殖及VCAM-1，ET-1和NO分泌的影響最顯著，后期TMP干預實驗中PM2.5劑量均選為200 mg·L-1。

Fig.2 Effect of PM2.5on protein levels of p-JNK and fibroblast growth factor receptor-1（FGFR-1）of VSMCs in rats by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control（0）group.

2.4 TMP對PM2.5誘導VSMC增殖的干預作用

MTT結果（圖3）顯示，與正常對照組比，PM2.5200 mg·L-1處理組A570nm顯著升高（P＜0.01）；與PM2.5200 mg·L-1處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 200和2000 mg·L-1預處理組A570nm顯著降低（P＜0.01），PM2.5200 mg·L-1+TMP 20 mg·L-1預處理組無顯著變化，提示TMP 200和2000 mg·L-1可抑制PM2.5誘導的VSMC增殖；與PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1預處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1+SP600125 10 μmol·L-1組A570nm顯著降低（P＜0.05），提示JNK抑制劑SP600125進一步抑制PM2.5誘導的VSMC增殖。

2.5 TMP對PM2.5誘導VSMC分泌VCAM-1，ET-1和NO的干預作用

與正常對照組比，PM2.5200 mg·L-1處理組VCAM-1和ET-1含量升高，NO含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與PM2.5200 mg·L-1處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 200和2000 mg·L-1預處理組VCAM-1和ET-1含量顯著降低（P＜0.01），PM2.5200 mg·L-1+TMP 20 mg·L-1預處理組無顯著變化，提示TMP可減少PM2.5誘導VCAM-1和ET-1的分泌量，并增加NO的分泌量；與PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1預處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg · L-1+SP600125 10 μmol· L-1組VCAM-1（P＜0.01）和ET-1（P＜0.05）的分泌量進一步減少，并且NO的分泌進一步增加（P＜0.05）（表2）。

Fig.3 Effect of tetramethylpyrazine（TMP）or SP600125 on survival of PM2.5-induced VSMCs of rats by MTT.VSMCs were pre-treated with TMP 20，200 and 2000 mg·L-1for 1 h，or TMP 2000 mg·L-1for 1 h+SP600125 20 μmol·L-1for 30 min，and followed by PM2.5200 mg·L-1treatment for 24 h，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with PM2.5group.ΔP＜0.05，compared with PM2.5+TMP 2000 mg·L-1group.

Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine（TMP）or SP600125 on VCAM-1，ET-1 and NO levels in PM2.5-induced VSMCs of rats

2.6 TMP對PM2.5誘導VSMC表達p-JNK和FGFR-1的干預作用

Western蛋白印跡結果（圖4）顯示，與正常對照組比較，PM2.5200 mg·L-1處理組p-JNK和FGFR-1蛋白水平升高（P＜0.01）；與PM2.5200 mg·L-1處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 200和2000 mg·L-1預處理組p-JNK和FGFR-1蛋白水平降低（P＜0.01），PM2.5200 mg·L-1+TMP 20 mg·L-1預處理組無顯著變化，提示TMP 200和2000 mg·L-1可減少PM2.5誘導的p-JNK和FGFR-1蛋白表達；與PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1預處理組比較，PM2.5200 mg·L-1+TMP 2000 mg·L-1+SP600125 10 μmol·L-1組p-JNK（P＜0.05）和FGFR-1蛋白表達進一步減少（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of TMP and SP600125 on protein levels of p-JNK and FGFR-1 in PM2.5-induced VSMCs of rats by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semiquantitatine result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with PM2.5group；△△P＜0.01，compared with PM2.5+TMP 2000 mg·L-1group.

3 討論

本研究結果發現，PM2.5染毒可顯著誘導VSMC增殖，增加VSMC內FGFR-1蛋白表達，誘導VSMC VCAM-1和ET-1分泌增多及NO分泌減少，同時PM2.5可激活絲裂原活化蛋白激酶家族中的JNK，使其磷酸化水平升高。TMP可抑制PM2.5誘導的VSMC增殖，減少VSMC內FGFR-1蛋白表達，減少VSMC分泌VCAM-1和ET-1，并增加NO的分泌，同時TMP可抑制JNK，使其磷酸化水平降低。

VSMC作為構成血管壁組織結構的主要細胞成分，可維持血管張力的功能，其過度增殖是促進AS及多種血管疾病發生、發展的共同病理基礎。在正常血管中，VSMC表現為收縮表型，嵌入在細胞外基質組成的支架中，并呈現出極低的增殖率。當血管受到生長因子、趨化因子和損傷等因素刺激后，中膜VSMC表型將轉變為合成或（和）分泌型，VSMC遷移至血管內膜并在內膜中快速增殖［11］。本研究結果發現，PM2.5染毒可顯著誘導VSMC增殖，提示PM2.5可作為細胞應激因素，參與VSMC的增殖過程。VCAM-1可促進單核細胞黏附于血管內皮細胞并進入炎癥部位，釋放細胞活性物質，引起VSMC增殖［12］。本研究結果發現，PM2.5可使VSMC分泌VCAM-1增加，提示PM2.5誘導VSMC增殖與VCAM-1分泌增加有關。血管內皮舒張因子NO具有保護血管內膜、抗血小板黏附和抑制VSMC增殖的作用［13］。ET-1是一種內源性長效收縮血管調節因子，具有較強的促進VSMC有絲分裂、增殖的作用［14］。NO與ET-1二者平衡紊亂參與了VSMC增殖過程。本研究結果發現，PM2.5可使VSMC分泌ET-1含量升高，NO含量降低，提示PM2.5誘導VSMC增殖與ET-1分泌增加、NO分泌減少有關。FGFR-1是堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）發揮促增殖作用的主要受體，與bFGF親和力最高，也是重要的VSMC增殖促進因子，其表達水平與VSMC增殖程度正相關［15］。本研究結果發現，PM2.5可使FGFR-1蛋白的表達顯著增加，提示PM2.5誘導VSMC增殖與FGFR-1蛋白表達增加有關。本研究與前期在體水平研究報道高濃度PM2.5吸入可引起小鼠VSMC增殖結果一致［16］，為進一步研究抑制PM2.5誘導VSMC增殖藥物的作用機制提供了實驗依據。

VSMC的增殖過程是在外界各種因素剌激作用下細胞外傳導信號通過細胞內信號傳導系統到達細胞核內，誘導與VSMC增殖相關的蛋白表達改變，啟動細胞周期，從而導致VSMC分裂和增殖［17］。因此，阻斷促細胞分裂、增殖信號的傳導，并降低增殖相關蛋白的表達是減少VSMC增殖的關鍵策略。本研究結果發現，TMP可抑制PM2.5誘導的VSMC增殖，減少VSMC內FGFR-1蛋白表達，減少VSMC分泌VCAM-1和ET-1，并增加NO的分泌，同時TMP可抑制JNK，使其磷酸化水平降低，提示TMP抑制VSMC增殖的作用與調節VSMC內FGFR-1蛋白、分泌VCAM-1，ET-1及NO含量等途徑有關。為了進一步檢測TMP的干預機制，本研究觀察JNK抑制劑SP600125聯合TMP共同預處理VSMC與TMP單獨預處理VSMC對PM2.5誘導VSMC增殖干預作用的區別。結果顯示，與TMP預處理組比較，TMP聯合SP600125可進一步抑制PM2.5誘導的VSMC增殖，減少VSMC內FGFR-1蛋白表達，減少VSMC分泌VCAM-1和ET-1含量，并增加NO的分泌，同時降低JNK磷酸化水平。JNK是相對分子質量分別為46×103和54×103的蛋白，進化上屬于保守型絲氨酸或（和）蘇氨酸蛋白激酶，可以被紫外線照射、活性氧等環境因素和熱休克、脂多糖、腫瘤壞死因子、缺血/再灌注損傷等細胞應激所激活，參與調節細胞生長、分化、增殖、凋亡和存活、炎癥反應等多種病理生理過程［4］。本研究結果提示，TMP可能通過下調JNK磷酸化，并調節VSMC內FGFR-1蛋白、分泌VCAM-1，ET-1和NO含量等途徑抑制PM2.5誘導的VSMC增殖。本研究可為TMP臨床治療PM2.5所致的心血管疾病提供實驗依據。促進VSMC增殖的細胞內信號轉導機制非常復雜，JNK信號轉導途徑的激活可能是其機制之一，但不足以完全闡明VSMC增殖現象。本研究局限性在于只檢測了JNK通路，關于PM2.5誘導VSMC增殖機制以及TMP對此過程的干預作用及機制和臨床應用仍需進一步研究。

［1］Li Y，Ma Z，Zheng C，Shang Y.Ambient temperature enhanced acute cardiovascular-respiratory mortality effects of PM2.5in Beijing，China［J］.Int J Biometeorol，2015，59（12）：1761-1770.

［2］Dorans KS，Wilker EH，Li W，Rice MB，Ljungman PL，Schwartz J，et al.Residential proximity to major roads，exposure to fine particulate matter，and coronary artery calcium：the Framingham Heart Study［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2016，36（8）：1679-1685.

［3］Hou J，Xue X，Li J.Vasostatin-2 inhibits cell proliferation and adhesion in vascular smooth muscle cells，which are associated with the progression of atherosclerosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2016，469（4）：948-953.

［4］ Sozen E，Karademir B，Yazgan B，Bozaykut P，Ozer NK.Potential role of proteasome on c-jun related signaling in hypercholesterolemia induced atherosclerosis［J］.Redox Biol，2014，2：732-738.

［5］ Li WM，Liu HT，Li XY，Wu JY，Xu G，Teng YZ，et al.The effect of tetramethylpyrazine on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in human umbilical vein endothelial cells［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2010，106（1）：45-52.

［6］Li XY，He JL，Liu HT，Li WM，Yu C.Tetramethylpyrazine suppresses interleukin-8 expression in LPS-stimulated human umbilical vein endothelial cell by blocking ERK，p38 and nulear factor-kappaB signaling pathways［J］.J Ethnopharmacol，2009，125（1）：83-89.

［7］Wu X，Zhang F，Xiong X，Lu C，Lian N，Lu Y，et al.Tetramethylpyrazine reduces inflammation in liver fibrosis and inhibits inflammatory cytokine expression in hepatic stellate cells by modulating NLRP3 inflammasome pathway［J］.IUBMB Life，2015，67（4）：312-321.

［8］Li T，Song T，Ni L，Yang G，Song X，Wu L，et al.The p-ERK-p-c-Jun-cyclinD1 pathway is involved in proliferation of smooth muscle cells after exposure to cigarette smoke extract［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，453（3）：316-320.

［9］Hua JY，He YZ，Jiang XH，Ye W，Yang MY.Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation and collagen synthesis of vascular smooth muscle cells［J］.Chin J Integrated Tradit West Med（中國中西醫結合雜志），2013，33（9）：1226-1231.

［10］Du CQ，Liu XW，Zeng GZ，Jin HF，Tang LJ.Inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase attenuates angiotensinⅡ-induced fibrotic responses in vascular smooth muscle cells［J］.Int J Mol Med，2015，35（6）：1767-1772.

［11］ ChistiakovDA， OrekhovAN， BobryshevYV.Vascular smooth muscle cell in atherosclerosis［J］.Acta Physiol（Oxf），2015，214（1）：33-50.

［12］ Lee HM，Kim HJ，Won KJ，Choi WS，Park SH，Song H，et al.Soluble form of vascular cell adhesion molecule 1 induces migration and proliferation of vascular smooth muscle cells［J］.J Vasc Res，2008，45（3）：259-268.

［13］Wong JC，Fiscus RR.Protein kinase G activity prevents pathological-level nitric oxide-induced apoptosis and promotes DNA synthesis/cell proliferation in vascular smooth muscle cells［J］.Cardiovasc Pathol，2010，19（6）：e221-e231.

［14］ Gomez SY，Levesque LO，Li Y，Anand-Srivastava MB.Role of epidermal growth factor receptor transactivation in endothelin-1-induced enhanced expression of Gi protein and proliferation in A10 vascular smooth muscle cells［J］.Can J Physiol Pharmacol，2013，91（3）：221-227.

［15］Guizoni DM，Dorighello GG，Oliveira HC，Delbin MA，Krieger MH，Davel AP.Aerobic exercise training protects against endothelial dysfunction by increasing nitric oxide and hydrogen peroxide production in LDL receptor-deficient mice［J］.J Transl Med，2016，14（1）：213.

［16］Floyd HS，Chen LC，Vallanat B，Dreher K.Fine ambient air particulate matter exposure induces molecularalterations associated with vascular disease progression within plaques of atherosclerotic susceptible mice［J］.Inhal Toxicol，2009，21（5）：394-403.

［17］Kim EJ，Choi YK，Han YH，Kim HJ，Lee IK，Lee MO.RORalpha suppresses proliferation of vascular smooth muscle cells through activation of AMP-activated protein kinase ［J］.Int J Cardiol，2014，175（3）：515-521.

2016-11-11 接受日期：2017-07-20）

（本文編輯：賀云霞）

Tetramethylpyrazine inhibits PM2.5-induced vascular smooth muscle cell proliferation by down-regulating JNK phosphorylation

WAN Qiang1,YANG Yu-ping2,YANG Xue1,CHEN Hong-tao1,WAN Chan-jun1,XU Ri1
(1.Department of Medical Cardiology,2.Department of Respiratory Medicine,Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China)

OBJECTIVETo investigate the inhibitory effect and the possible mechanism of tetramethylpyrazine(TMP)in preventing vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferation induced by fine particulate matter(PM2.5).METHODSPM2.520,200 and 400 mg·L-1was added to VSMCs for 24 h,the survival of VSMCs was measured by MTT assay,the protein levels of p-c-Jun N-terminal kinase(JNK)and fibroblast growth factor receptor-1(FGFR-1)in the VSMCs were detected by Western blotting,while the levels of vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1),endothelin-1(ET-1)and nitric oxide(NO)in the VSMCs were analyzed by ELISA,radioimmunoassay and nitrate reductase method,respectively.TMP 20,200 and 2000 mg·L-1or a specific inhibitor of JNK SP600125 10 μmol·L-1was added into the VSMCs to observe the effect of TMP.RESULTS Compared with the normal control group,PM2.5200 and 400 mg·L-1significantly increased theA570nmvaule,the protein levels of p-JNK and FGFR-1,the levels of VCAM-1 and ET-1,but decreased the level of NO(P＜0.01),while there were no significant changes in PM2.520 mg·L-1group.Compared with the PM2.5200 mg·L-1group,TMP 200 and 2000 mg·L-1pre-treatment markedly decreased the A570nmvaule,the protein levels of p-JNK and FGFR-1,the levels of VCAM-1 and ET-1,but increased the level of NO(P＜0.01),while there were no significant changes in TMP 20 mg·L-1pre-treated group.Moreover,the effects of TMP were significantly enhanced by the co-incubation of TMP 2000 mg·L-1with SP600125 10 μmol·L-1,compared to the TMP 2000 mg·L-1pre-treated group(P＜0.05,P＜0.01).CONCLUSION TMP displays a significant inhibitory effect against VSMC proliferation induced by PM2.5.The mechanism may be related to the inhibition of JNK phosphorylation,and the regulation of FGFR-1 protein expression and VCAM-1,ET-1 and NO levels.

PM2.5;tetramethylpyrazine;JNK;vascular smooth muscle cells

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81660770);Natural Science Foundation of Jiangxi Province(2016BAB215256);and Science and Technology Planning Project of Health and Family Planning Commission of Jiangxi Province(20171105)

WAN Qiang,E-mail:wanqiang109559140@163.com

R972.6

A

1000-3002-（2017）07-0707-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.002

國家自然科學基金（81660770）；江西省自然科學基金（20161BAB215256）；江西省衛生計生委科技計劃（20171105）

萬 強，男，博士，主治醫師，從事心血管疾病的臨床與實驗研究。

萬 強，E-mail：wanqiang109559140@163.com