HLA-F在ICP患者胎盤組織中的表達及意義

楊麗娟 葛靜 潘華 張晶

·論著·

HLA-F在ICP患者胎盤組織中的表達及意義

楊麗娟 葛靜 潘華 張晶

目的探討妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)患者胎盤組織中人類白細胞抗原F(HLA-F)的表達變化及意義。方法選取2013年1月至2015年7月產科確診的ICP患者65例(ICP組)、40例健康妊娠女性(健康組)，采用Western blot檢驗技術檢測2組胎盤組織中HLA-F蛋白的表達水平，并將ICP組根據病情進行亞組分析。結果ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值(0.729±0.164)顯著的低于健康組，差異有統計學意義(Plt;0.05)；ICP組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于健康組，差異均有統計學意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值顯著的低于ICP輕度組，差異有統計學意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于ICP輕度組，差異均具有統計學意義(Plt;0.05)；ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現出顯著的負相關關系(Plt;0.05)。結論ICP患者胎盤組織的HLA-F蛋白表達水平明顯降低，并且與患者的病情、血清TBA、ALT、AST水平密切相關性。

妊娠；肝內膽汁淤積癥；胎盤組織；人類白細胞抗原F

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy ，ICP)是臨床上較為常見的妊娠期合并癥，相關研究顯示ICP的發病率可達0.006%以上，且近年來呈現出一定的上升趨勢[1,2]。有研究顯示，母體與胎兒的免疫耐受的平衡對于降低妊娠期合并癥的發生具有重要的意義，免疫平衡的紊亂可以促進ICP的發生發展[2]。人類白細胞抗原F(human leukocyte antigen F，HLA-F)是重要的免疫調節分化因子，可以通過影響到T淋巴細胞的分化及免疫因子的釋放，進而穩定胎兒及母體之間的免疫耐受[3,4]。本研究探討ICP患者胎盤組織中HLA-F蛋白的表達變化，揭示HLA-F與ICP發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2015年7月我院產科確診的ICP患者65例(ICP組)、40例健康妊娠女性(健康組)。ICP組：年齡22～35歲，平均年齡(27.4±3.5)歲；孕周34～39周，平均(36.5±1.9)周；孕次1～3次，平均(1.3±0.7)次；孕晚期體重指數(BMI)(27.6±2.0)kg/m2；ICP輕度39例，ICP重度26例。健康組：年齡22～36歲，平均年齡(27.1±3.3)歲；孕周36～41周，平均(37.9±1.5)周；孕次1～3次，平均(1.5±0.7)次；孕晚期BMI(27.9±1.9)kg/m2。2組產婦年齡、孕次、孕晚期BMI差異無統計學意義(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①ICP的診斷及分度標準參考中華醫學會婦產科學分會2011年提出的診斷標準[5]；②ICP妊娠女性表現為中晚期出現皮膚瘙癢、伴或不伴有黃疸；③實驗室檢查：ICP患者的血清總膽汁酸(TBA)gt;10 μmol/L，可伴有AST、ALT水平升高；④本研究獲得研究對象的知情同意及醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2.2 排除標準：①雙胎妊娠女性；②合并病毒性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎及其他類型肝疾病的患者；③伴有免疫系統疾病的患者；④合并妊娠高血壓、妊娠糖尿病、胎膜早破等并發癥的女性。

1.3 Western blot檢驗方法 冰上分離出胎盤組織，置于預冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置1 h，4℃ 14 000 r/min離心30 min，去沉淀組織留上清。考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度，分裝。-70℃凍存。按總蛋白80 μg計算上樣體積，4∶1的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20 μl樣品緩沖液，于60 V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2 h，羊抗HLA-F抗體(1∶200)，2 h 后加入二抗。Image proplus 4．01版本的專業圖像分析軟件進行圖像分析。

1.4 觀察指標 檢測各組妊娠女性妊娠晚期血清總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。清晨采集空腹靜脈血，按照10 000 r/min的離心速度進行離心分離血清，-20℃保存待測，采集標本后1周內檢測TBA、ALT、AST，采用瑞士羅氏全自動生化分析儀E170模塊進行檢測，檢測試劑盒購自上海泰康生物科技有限公司。具體檢測方法參照試劑盒說明書，試劑盒內配有質控血清或質控標準品，所有操作嚴格按照操作說明完成。

2 結果

2.1 ICP組和健康組的胎盤組織中HLA-F蛋白表達水平比較 ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值顯著低于健康組，差異均有統計學意義(Plt;0.05)；ICP組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于健康組，差異均有統計學意義(Plt;0.05)。見表1，圖1。

組別HLA-F(灰度值)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ICP組(n=65)0.729±0.16435.41±11.05204.9±57.8176.9±60.4健康組(n=40)1.356±0.22827.40±3.5317.5±5.217.0±3.9t值16.3544.44020.41716.691P值lt;0.001lt;0.001lt;0.001lt;0.001

圖1 Western blot檢測圖

2.2 不同病情的ICP組胎盤組織中HLA-F蛋白表達水平比較 ICP重度組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值顯著低于ICP輕度組，差異均有統計學意義(Plt;0.05)；ICP重度組患者的血清TBA、ALT、AST水平均高于ICP輕度組，差異均有統計學意義(Plt;0.05)。見表2，圖1。

病情HLA-F(灰度值)TBA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ICP輕度(n=39)0.822±0.15732.64±7.33139.7±51.698.3±39.7ICP重度(n=26)0.584±0.13940.62±10.76289.6±55.3268.4±52.1t值6.2623.56111.15016.852P值lt;0.01lt;0.01lt;0.01lt;0.01

2.3 ICP組胎盤組織中HLA-F蛋白表達水平與血清TBA、ALT、AST的相關性分析 ICP組患者的胎盤組織中HLA-F蛋白表達灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現出顯著的負相關關系(Plt;0.05)。見表3。

表3 相關性分析

3 討論

遺傳易感因素、基礎性肝功能異常及免疫耐受的打破等，均可以促進ICP的發生發展，特別是在年齡介于25～30歲的初產婦中，ICP的發病率可較普通人群上升3～4倍[6,7]。臨床上ICP容易導致胎兒宮內窘迫、新生兒窒息、腦癱等風險，導致胎兒的存活率，治療花費大。而通過對于ICP發病過程中相關機制的研究，可以了解ICP的發病機制、ICP的綜合性的臨床治療提供理論基礎。

HLA-F編碼的蛋白主要為人類組織相容性抗原，從而介導免疫系統反應、免疫應答及免疫損傷。HLA-F結構上包含了多個重復的巰基結構，通過非化學鍵的結合作用，進而促進HLA-F本身與調節性T淋巴細胞及B細胞膜表面的結合，影響體液免疫及細胞免疫應答。胎盤組織中的HLA-F蛋白的表達，可以影響到胎盤血管的重塑、胎盤滋養細胞的侵襲等生理過程，抑制胎盤母體面及胎兒面的免疫排斥[8,9]；低水平的HLA-F失去了其對于滋養細胞抑制性受體a及胎盤血管內皮細胞受體的保護作用，導致相關抗原容易受到自身免疫分子的攻擊，導致肝膽管及肝臟組織細胞的損傷，促進了ICP的發生發展[10,11]。相關研究證實了HLA在ICP患者中的異常表達，認為低表達水平的HLA可以促進ICP的發生發展[12]，但相關研究的樣本量較少，且缺乏對于HLA-F與ICP病情嚴重程度關系的研究。

TBA、ALT、AST是評估ICP病情的重要指標，ICP患者血清中的ALT、AST等均明顯上升，高于正常對照人群，提示了ICP患者的肝功能的損傷和膽汁淤積的病理狀態。病例組患者胎盤組織中的HLA-F表達濃度明顯下降，對于對照組，表明HLA-F可能參與到了ICP的發生發展過程中。HLA-F的下降失去了其對于穩定胎盤母體胎兒免疫耐受的能力，導致膽管、肝臟實質性組織細胞容易受到自身免疫復合物沉淀的影響，從而促進了ICP的發生發展。Zhang等[13,14]通過回顧性分析了82例樣本量的ICP臨床資料，發現在相關病例組患者的胎盤組織中，HLA-F的表達可較正常對照下降25%左右，這與本研究的結論較為一致。而通過對于不同病情的ICP患者的臨床分析后發現，HLA-F的表達與ICP的病情嚴重程度的關系較為明顯，在病情越為嚴重的ICP患者胎盤組織中，HLA-F的表達濃度可進一步下降，其中重度ICP患者胎盤組織中的灰度值僅為(0.584±0.139)，下降較為明顯。但需要注意的是， Zhang等[13]的研究中并未發現不同病情的ICP與HLA-F的關系，這與本研究的結論存在一定的差別，考慮到檢測方法的差別、臨床資料的收集偏移等，均可能導致了統計結論的差異。相關關系分析也可以發現，HLA-F蛋白表達灰度值與血清TBA、ALT、AST水平均呈現出顯著的負相關關系，進一步提示HLA-F與ICP的密切關系。

綜上所述，在ICP患者胎盤組織中HLA-F的表達明顯下降，且HLA-F下降程度越明顯，ICP的病情越為嚴重。本研究的局限性在于：(1)缺乏對于HLA-F與ICP治療結局的關系研究；(2)胎盤組織中的HLA-F定性研究不足。

1 曹衛平，陳廷美，毛雨，等.功能性T細胞亞群與妊娠期肝內膽汁淤積癥關系的研究進展.中國婦幼保健,2013,42:6079-6080.

2 何毛毛，王曉東.妊娠期肝內膽汁淤積癥胎兒宮內缺氧機制的研究進展.中華婦幼臨床醫學雜志(電子版),2011,25:60-63.

3 胡海軍，李佳平.妊娠期肝內膽汁淤積癥在細胞分子水平上的認識進展.川北醫學院學報,2015,24:128-131.

4 李明，吳晶，邢愛耘.人類白細胞抗原F在妊娠期肝內膽汁淤積癥患者胎盤中的表達及意義.實用婦產科雜志,2015,22:545-549.

5 孔艷，孔祥.妊娠期肝內膽汁淤積癥免疫因素的研究進展.中華婦幼臨床醫學雜志(電子版),2015,32:798-800.

6 劉金濤.血清總膽汁酸檢測在妊娠期肝內膽汁淤積癥中的臨床應用價值.檢驗醫學,2015,24:541-544.

7 Sanhal CY,Kara O,Yucel A.Can fetal left ventricular modified myocardial performance index predict adverse perinatal outcomes in intrahepatic cholestasis of pregnancy?J Matern Fetal Neonatal Med,2016,25:1-6.

8 Hubschmann AG,Orzechowski KM,Berghella V.Severe first trimester recurrent intrahepatic cholestasis of pregnancy:a case report and literature review.AJP Rep,2016,6:38-41.

9 Mella MT,Kohari K,Jones R,et al.Mitochondrial gene expression profiles are associated with intrahepatic cholestasis of pregnancy.Placenta,2016,32:90-92.

10 Zhang X,Ling YU,Ding Y.Human leukocyte antigen G and miR-148a are associated with the pathogenesis of intrahepatic cholestasis of pregnancy.Therapeutic Medicine,2014,24:56-58.

11 王萍萍，王增芳，王增艷，等.細胞因子網絡失衡與妊娠期肝內膽汁淤積癥.中國臨床研究,2012,32:1125-1126.

12 伍思玲，邵勇，何芳.妊娠期肝內膽汁淤積癥對母兒的影響及其機制.國際婦產科學雜志,2014,25:154-157.

13 Zhang YH,Pan YD,Lin CD,et al.Bile acids evoke placental inflammation by activating Gpbar1/NF-κB pathway in intrahepatic cholestasis of pregnancy.Journal of Molecular Cell Biology,2016,25:98-101.

14 吳瑛婷，張軍，陳慧芬.原發性膽汁性肝硬化合并妊娠的研究進展.診斷學理論與實踐,2015,25:573-576.

ExpressionandsignificanceofHLA-FinplacentaofpatientswithICP

YANGLijuan,GEJing,PANHua,etal.

DepartmentofObstetrics,HospitalforMaternalandChildHealthofHunanProvince,Changsha410008,China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of human leukocyte antigen F (HLA-F) in placenta of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP).MethodsSixty-five patients with ICP who were diagnosed and treated in our hospital from January 2013 to July 2015 were enrolled as ICP group,and 40 healthy pregnant women were enrolled as control group.The expression level of HLA-F protein in placenta tissues were detected by Western Blot,moreover the ICP group was redivided into subgroups according to pathogenetic condition.ResultsThe expression gray value (0.729±0.164) of HLA-F protein in placenta tissues of patients in ICP group was significantly lower than that (1.356±0.228) in control group (Plt;0.05). The serum levels of TBA,ALT and AST in ICP group were significantly higher than those in control group (Plt;0.05). The expression gray value [(0.584±0.139)μmol/L]of HLA-F protein in placenta tissues in severe ICP group was significantly lower than that [(0.822±0.157)μmol/L]in mild ICP group (Plt;0.05), however, the serum levels of TBA,ALT and AST in severe ICP group were significantly higher than those in mild ICP group (Plt;0.05).Moreover the expression gray value of HLA-F protein in placenta tissues of patients in ICP group was negatively correlated to the serum levels of TBA,ALT and AST (Plt;0.05).ConclusionThe expression levels of HLA-F protein in placenta tissues of patients with ICP are significantly decreased,moreover,which are closely correlated with patient's condition and the serum levels of TBA,ALT and AST.

pregnancy; intrahepatic cholestasis; placental tissue; human leukocyte antigen F

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.23.004

410008 長沙市，湖南省婦幼保健院產科

R 714.2

A

1002-7386(2017)23-3539-03

2017-05-18)