具有皮膚美容應用潛能的透皮型彈性蛋白樣多肽的制備

白轉麗+都慧聰+耿文鑫

[摘要]目的：設計、制備透皮型彈性蛋白樣多肽（elastin-like polypeptide， ELP）融合蛋白，探索其作為皮膚美容制劑的潛能。方法：設計具有透皮特性的蛋白轉導功能域（protein transduction domain， PTD）和ELP融合蛋白PTD-ELP，聯合密碼子優化、重疊延伸PCR和定向遞歸連接等技術構建其原核表達載體。在此基礎上將該載體轉化至大腸桿菌中，進行異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside， IPTG）誘導表達并對目標蛋白的亞細胞定位和可溶性進行分析。結果：成功構建了攜帶PTD-ELP讀碼框架的原核表達載體，攜帶該載體的大腸桿菌在IPTG誘導5h時PTD-ELP融合蛋白的表達量達到峰值，約占菌體總蛋白的23.6%；亞細胞定位分析表明PTD-ELP融合蛋白主要以包涵體形式在胞內表達。結論：成功設計并構建了能夠表達PTD-ELP融合蛋白的原核表達載體并在大腸桿菌中實現了其高效表達，為深入探討PTD介導的ELP透皮給藥在逆轉皮膚衰老和預防、治療光老化中的應用奠定了基礎。

[關鍵詞]彈性蛋白樣多肽；蛋白轉導功能域；原核表達；重組蛋白

[中圖分類號]Q591.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）10-0064-04

Abstract： Objective To design and express an elastin-like polypeptide （ELP） fusion protein which can be transcutaneously delivered to skin tissues to explore its potential as a skin cosmetics agent in the future. Methods A protein transduction domain （PTD）-ELP fusion protein with transdermal properties was designed and back-translated with E.coli-preferred codons. And its expression vector was constructed by overlap extension PCR and recursive directional ligation. After transforming the vector into Escherichia coli cells， the PTD-ELP protein was expressed by IPTG induction and the subcellular location and the solubility of the recombinant protein were analyzed. Results A prokaryotic vector containing PTD-ELP-coding cassette was successfully constructed as designed. And the E.coli cells harboring the vector could express the fusion protein after IPTG induction， which reached the highest level at 5h post induction with amount of 23.6% of total bacterial proteins. Further analysis demonstrated that PTD-ELP protein was subcellularly located in cytoplasm as insoluble inclusion bodies. Conclusion The recombinant prokaryotic expression vector was constructed successfully and the PTD-ELP fusion protein was efficiently expressed in Escherichia coli cells. These results laid a foundation for further investigating whether PTD-mediated transdermal delivery of ELP could prevent skin aging and reverse photoaging.

Key words： elastin-like polypeptide； protein transduction domain； prokaryotic expression； fusion protein

彈性蛋白是在維持皮膚組織結構和功能中發揮重要作用的細胞外基質蛋白，其約占皮膚總蛋白成分的2%[1-2]。彈性蛋白前體是由成纖維細胞和角質細胞合成并分泌的、分子量約為60～72kDa的可溶性彈性蛋白原，后者可在賴氨酰氧化酶的作用下發生分子內和分子間交聯形成不溶性彈性蛋白，進而維持皮膚彈性[3]。彈性蛋白在人體內的合成從出生開始逐漸升高到青春期達到峰值，此后迅速下降。相關研究證實[4]，在光老化過程中，基質金屬蛋白酶表達上調從而引發彈性蛋白降解，致使皮膚組織出現日光性彈力纖維變性?；瘖y品中添加動物組織源性的彈性蛋白水解產物用于延緩皮膚衰老、對抗光老化、促進皮膚細胞增殖和誘導皮膚年輕化等由來已久，然而動物源性蛋白存在人畜共患病風險，同時彈性蛋白因分子量較大而難以穿越表皮屏障進入淺表真皮組織發揮其生物學作用[5]。因此使用基因工程技術設計、制備具有透皮能力的重組彈性蛋白具有重要意義。endprint

1 材料和方法

1.1 材料：原核表達載體pET28a購自Novagen公司；克隆載體pSP73購自Promega公司，ER2566購自NEB公司；限制性核酸內切酶Nco I、Xho I、BamH I和Bgl II、T4 DNA Ligase、Pyrobest DNA Polymerase購自Takara公司；IPTG、Tris和SDS購自Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺購自Sigma公司；GeneRuler DNA Ladder Mix和PageRuler Prestained Protein Ladder購自Fermentas公司；引物pPTD1： 5-TTT CTC GAG TGC GGC CGC AAG CTT GTC GAC GGA GCT CGA ATT CGG ATC CAC GAC GAC GC-3， pPTD2： 5-GCC GTG GTT ATG GCC GTA AGA AAC GTC GTC AGC GTC GTC GTG GAT CCG AAT TCG AGC TC-3， pPTD3： 5-CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC GGC ATT GAA GGC CGT GGT TAT GGC CGT AAG AAA CGT CG-3， pPTD4： 5-AAA CCA TGG GCA GCA GCC ATC ATC ATC ATC ATC ACA GCG GCA TTG AAG G-3， pELP1：5-AAA AGA TCT GTG GCG CCG GGC GGT GTT GCG CCG GGC GTG GGT CTC GCG CCG-3和pELP2：5‘-AAA CTC GAG CTA TTA GGA TCC TAC GCC CGG CGC GAG ACC CAC GCC CGG CGC-3由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 構建原核表達載體pPTD：配置反應體系（10×Pyrobest BufferⅡ5.0μl，dNTP4.0μl，Pyrobest DNA Polymerase0.25μl，濃度為10μM的引物pPTD1和pPTD4各1.0μl，濃度為1μM的引物pPTD2和pPTD3各1.0μl，加去離子水至終體積為50μl），進行重疊延伸PCR。循環參數為變性30s，退火30s，延伸30s，共30個循環。反應結束后使用DNA回收試劑盒回收PCR產物，經NcoI和XhoI雙酶切后克隆至pET28a的相應酶切位點之間獲得pPTD，經DNA測序證實。

1.3 ELP編碼序列的設計和構建：根據人彈性蛋白特有基序VAPGXG設計ELP氨基酸序列為VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，使用大腸桿菌偏愛密碼子反翻譯為cDNA序列，并在此基礎上設計引物pELP1和pELP2，進行重疊延伸PCR后以Bgl II和Xho I雙酶切后克隆至pSP73的相應酶切位點獲得pSP73-3ELP，經DNA測序證實后使用定向遞歸連接技術構建pSP73-96ELP。

1.4 PTD-96ELP原核表達載體的構建：利用Bgl II和BamH I能夠酶切產生相同的粘端，使用Bgl II和Xho I將96ELP從pSP73-96ELP上切下并克隆至pPTD的BamH I和Xho I之間獲得原核表達載體pPTD-96ELP，經Bgl II和Xho I雙酶切鑒定后保存備用。

1.5 PTD-96ELP在大腸桿菌ER2566中的誘導表達：使用pPTD-96ELP轉化ER2566感受態細胞并涂布在含30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板。經37℃過夜培養篩選后，挑取生長狀態良好的菌落接種于含30μg/ml卡那霉素的LB中，置于37℃、220rpm條件下振蕩培養12h獲得種子液。將種子液用含30μg/ml卡那霉素的LB以1：100比例稀釋，置于37℃、220rpm條件下振蕩培養2h，加入1M IPTG至終濃度為1mM進行誘導表達，分別在誘導3h、4h、5h、6h、7h和8h時收獲樣品進行SDS-PAGE分析。

1.6 PTD-96ELP表達產物的可溶性分析：將200ml誘導后菌液在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體并重懸于20ml去離子水中。在-20℃～37℃反復凍融3次后超聲破碎菌體，超聲條件為400W，工作5s，間隔5s，重復200次。在4℃、16 000g條件下離心30min，分別取上清和沉淀制樣進行SDS-PAGE分析。

1.7 PTD-96ELP表達產物的亞細胞定位分析：將200ml誘導后菌液在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體并重懸于高滲液（pH8.0，30mM Tris-HCl，1mM EDTA，20%蔗糖）中，室溫攪拌10min。在4℃、2 000g條件下離心15min，收獲菌體重懸于預冷的5mM MgSO4中，冰浴攪拌10min后4℃、10 000g條件下離心15min，分別取上清和沉淀制樣進行SDS-PAGE分析。

2 結果

2.1 PTD-96ELP的設計：如圖1所示，PTD-ELP融合蛋白由4個功能域構成，從氨基端到羧基端分別為：①組氨酸標簽，用于檢測和純化融合蛋白；②X因子a識別位點，用于最終切除組氨酸標簽；③來源于HIV反式轉錄激活因子（transactivator of transcription， TAT）的PTD，用于介導ELP穿越表皮屏障；④32倍串聯重復的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，用于發揮彈性蛋白樣生物學作用。

2.2 pPTD-96ELP的鑒定和測序分析結果：對原核表達載體pPTD-96ELP進行Bgl II和Xho I雙酶切鑒定可見約2000bp新生條帶（圖2），與預期相符；pPTD-96ELP中的目標蛋白開放讀碼框架如圖3所示，進一步DNA測序證實插入序列與設計完全相符（圖4）。endprint

2.3 PTD-96ELP在ER2566中的誘導表達檢測結果：如圖5所示，SDS-PAGE分析表明，攜帶pPTD-96ELP的ER2566工程菌經IPTG誘導后可表達分子量約為53kDa的新生蛋白，與預期相符；同時，目標蛋白的表達量在IPTG誘導5h時達到峰值，約占菌體總蛋白的23.6%，進一步延長誘導表達時間并不能提高蛋白表達量。

2.4 PTD-96ELP表達產物可溶性分析結果：如圖6所示，SDS-PAGE分析表明，攜帶pPTD-96ELP的ER2566工程菌經IPTG誘導表達5h后目標蛋白主要位于細胞內，而周質空間內幾乎沒有目標蛋白。同時，目標蛋白主要位于菌體超聲裂解后的沉淀中，提示該蛋白主要以包涵體形式表達。

3 討論

鑒于具有串聯重復序列的蛋白常因特定tRNA豐度的限制而難于表達，本研究使用大腸桿菌偏愛密碼子對VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元的編碼序列進行了修飾，并在此基礎上使用定向遞歸克隆技術制備了ELP串聯重復序列cDNA并將之與PTD編碼序列融合，構建了能夠表達重組PTD-ELP融合蛋白的原核表達載體并在大腸桿菌中實現了PTD-ELP高效表達。

彈性蛋白的一級結構中富含有VPGXG和VAPGXG基序，其中X為除脯氨酸外的任意氨基酸。目前由人彈性蛋白第24個外顯子編碼的VGVAPG寡肽已經廣泛用做美容護膚品添加劑[6-8]，其能夠通過與分子量為67kDa的高親和性彈性蛋白受體結合發揮其生物學活性[9]。大量研究證實VGVAPG寡肽不但能夠趨化成纖維細胞，還能刺激人皮膚成纖維細胞增殖[10]，而VPGVG及其多聚體則無此作用[11]。同時，VGVAPG寡肽能促進角質形成細胞遷移和分化[12]。此外，VGVAPG寡肽能促進人血管內皮細胞遷移和成管，表明其能促進血管生成[13]。最近研究發現VGVAPG寡肽能通過激活IGF-1受體上調彈性蛋白表達并促進彈性組織生成[14]，并且含有（VGVAPG）3基序的多肽能上調彈性蛋白和膠原蛋白在人皮膚成纖維細胞和人皮膚組織體外培養物中的表達[15]。這些資料表明含有VGVAPG基序的多肽具有對抗皮膚衰老和促進皮膚組織再生的功能。本研究采用的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元中含有兩個VGVAPG基序，因此在理論上融合蛋白PTD-ELP也能夠通過刺激成纖維細胞增殖、誘導角質形成細胞遷移和分化、促進血管生成以及上調彈性蛋白和膠原蛋白表達等多種機制改善皮膚質量、延緩皮膚衰老，并極具潛力成為一種安全、高效的美容生物制劑。

表皮屏障雖然能保護皮膚組織免受外界物理化學損傷，但是也限制了功能分子的經皮給藥效率。近年來研究發現，HIV TAT-PTD、PEP-1和IMT-P8多種不同來源的PTD均能夠賦予與之融合表達的蛋白分子穿越表皮屏障的能力[16-18]。為了能夠獲得高效原核表達，本研究中選用了報道數量較多、透皮能力確切、長度僅為11個氨基酸殘基的TAT-PTD[16，19-21]。為了實現重組PTD-ELP在大腸桿菌中的高效表達，使用大腸桿菌偏愛密碼子對PTD和ELP編碼序列進行了改造。雖然結果顯示密碼子優化后PTD-ELP的表達量較高，但是目標蛋白主要存在于包涵體中，必須在溶解包涵體后才能應用ELP的溫度依賴性相變作用進行規模純化。因此優化誘導表達工藝以實現PTD-ELP的可溶性表達將是下一步工作的研究重點。

綜上所述，本研究設計了具有透皮能力的PTD-ELP蛋白，聯合密碼子優化和定向遞歸連接技術構建了其原核表達載體，并實現了PTD-ELP在大腸桿菌中的高效表達，不僅建立了相對簡單的ELP串聯重復序列構建方法，而且為深入探討ELP透皮給藥在對抗皮膚衰老和促進皮膚年輕化中的作用奠定了基礎。

[參考文獻]

[1]Widgerow AD，Fabi SG，Palestine RF，et al.Extracellular Matrix Modulation： Optimizing Skin Care and Rejuvenation Procedures[J].J Drugs Dermatol，2016，15（4 Suppl）：s63-71.

[2]Almine JF，Wise SG，Weiss AS.Elastin signaling in wound repair[J].Birth Defects Res C Embryo Today，2012，96（3）：248-257.

[3]Theocharis AD，Skandalis SS，Gialeli C，et al.Extracellular matrix structure[J]. Adv Drug Deliv Rev，2016，97：4-27.

[4]Weihermann AC，Lorencini M，Brohem CA，et al.Elastin structure and its involvement in skin photoageing[J].Int J Cosmet Sci，2016，39（3）：241-247.

[5]Pai VV，Bhandari P，Shukla P.Topical peptides as cosmeceuticals[J].Indian J Dermatol Venereol Leprol，2017，83（1）：9-18.

[6]Husein El Hadmed H，Castillo RF.Cosmeceuticals： peptides， proteins， and growth factors[J].J Cosmet Dermatol，2016，15（4）：514-519.

[7]Zhang L，Falla TJ.Cosmeceuticals and peptides[J].Clin Dermatol，2009，27（5）： 485-494.endprint

[8]Reddy B，Jow T，Hantash BM.Bioactive oligopeptides in dermatology： Part I[J].Exp Dermatol，2012，21（8）：563-568.

[9]Floquet N，Hery-Huynh S，Dauchez M，et al.Structural characterization of VGVAPG， an elastin-derived peptide[J].Biopolymers，2004，76（3）：266-280.

[10]Chatron-Colliet A，Lalun N，Terryn C，et al.The elastin peptide （VGVAPG） induces the 3D reorganisation of PML-NBs and SC35 speckles architecture， and accelerates proliferation of fibroblasts and melanoma cells[J].Histochem Cell Biol，2015，143（3）： 245-258.

[11]Tajima S，Wachi H，Uemura Y，et al.Modulation by elastin peptide VGVAPG of cell proliferation and elastin expression in human skin fibroblasts[J].Arch Dermatol Res，1997，289（8）：489-492.

[12]Fujimoto N，Tajima S，Ishibashi A.Elastin peptides induce migration and terminal differentiation of cultured keratinocytes via 67 kDa elastin receptor in vitro： 67 kDa elastin receptor is expressed in the keratinocytes eliminating elastic materials in elastosis perforans serpiginosa[J].J Invest Dermatol，2000，115（4）：633-639.

[13]Robinet A，Fahem A，Cauchard JH，et al.Elastin-derived peptides enhance angiogenesis by promoting endothelial cell migration and tubulogenesis through upregulation of MT1-MMP[J].J Cell Sci，2005，118（Pt 2）：343-356.

[14]Qa'aty N，Vincent M，Wang Y，et al.Synthetic ligands of the elastin receptor induce elastogenesis in human dermal fibroblasts via activation of their IGF-1 receptors [J].J Dermatol Sci，2015，80（3）：175-185.

[15]Attia-Vigneau J，Terryn C，Lorimier S，et al.Regeneration of human dermis by a multi-headed peptide[J].J Invest Dermatol，2014，134（1）：58-67.

[16]Chen X，Liu S，Rao P，et al.Topical application of superoxide dismutase mediated by HIV-TAT peptide attenuates UVB-induced damages in human skin[J].Eur J Pharm Biopharm，2016，107：286-294.

[17]Gautam A，Nanda JS，Samuel JS，et al.Topical Delivery of Protein and Peptide Using Novel Cell Penetrating Peptide IMT-P8[J].Sci Rep，2016，6：26278.

[18]Nasrollahi SA，Taghibiglou C，Azizi E，et al.Cell-penetrating peptides as a novel transdermal drug delivery system[J].Chem Biol Drug Des，2012，80（5）：639-646.

[19]Liu TP，Chen YP，Chou CM，et al.Therapeutic evaluation of HIV transduction basic domain-conjugated superoxide dismutase solution on suppressive effects of the formation of peroxynitrite and expression of COX-2 in murine skin[J].J Biomed Sci， 2016，23：11.

[20]Song HY，Lee JA，Ju SM，et al.Topical transduction of superoxide dismutase mediated by HIV-1 Tat protein transduction domain ameliorates 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）-induced inflammation in mice[J]. Biochem Pharmacol，2008，75（6）：1348-1357.

[21]Uchida T，Kanazawa T，Takashima Y，et al.Development of an efficient transdermal delivery system of small interfering RNA using functional peptides， Tat and AT-1002 [J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（2）：196-201.

[收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-06

編輯/朱婉蓉endprint