江洪魚露發酵過程中微生物多樣性分析

齊寧利，饒夢微，李 濤，龔 霄，魏曉奕，王曉芳

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室（湛江），廣東湛江 524001；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524048；3.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，廣東湛江 524001）

江洪魚露發酵過程中微生物多樣性分析

齊寧利1，饒夢微2，李 濤1，*龔 霄3，魏曉奕3，王曉芳3

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室（湛江），廣東湛江 524001；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524048；3.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，廣東湛江 524001）

江洪魚露以我國北部灣青鱗魚為原料，經傳統工藝腌制、深埋、自然發酵而成。分析了發酵過程中微生物多樣性差異，并測定了pH值、氨基酸態氮、揮發性鹽基氮、游離氨基酸等理化特性的變化。結果表明，乳酸菌和酵母菌是江洪魚露發酵過程中的優勢菌，其菌相變化與各項理化指標密切相關，為江洪魚露生產過程中的品質控制和快速發酵技術研發提供理論基礎。

江洪魚露；微生物多樣性；理化特性

0 引言

魚露是一種以低值魚蝦或水產加工廢棄物為原料，利用自身酶或微生物發酵而成的海鮮調味品，風味獨特、營養豐富，并因兼有賦咸、起鮮、增香、調色等作用而深受消費者歡迎。魚露原產于我國廣東潮汕和福建等地，在東南亞國家（如日本、越南、泰國等）得到發展，目前在歐洲和非洲地區逐漸盛行。其中，江洪魚露又稱“魚鮐”，是以廣東江洪鎮北部灣水域的生猛青鱗魚為原料，在鹵化后的瓷瓶中經海鹽搓腌、密封發酵、深埋、變溫處理[1]等工藝制作而成，含有蛋白質、脂肪、氨基酸，以及鐵、鈣、碘等礦物質，營養豐富且易被人體吸收，當地人形容其為“血滴滴”。

江洪魚露經過多種微生物的共同作用釀造而成，生產周期一般在1～3年，作為一種特殊的地理標志產品，目前品質形成機理尚不清楚。黃紫燕等人[2]采用選擇性培養的方法對汕頭魚露傳統制作過程中微生物多樣性進行了分析，發現乳酸菌和酵母菌是優勢菌。但是，可培養的細菌只占很少一部分，而剩余的大多數細菌是不可培養或難以培養的，這些不可培養或難以培養的細菌也參與了魚露香氣物質的形成[3]。所以，通過一種新方法研究不可培養或較難培養細菌多樣性[4]，極具研究價值。

試驗對江洪魚露整個生產過程進行跟蹤采樣，利用高通量測序技術分析發酵各階段的微生物組成及其多樣性，對pH值、總酸、TSN和TVB-N，以及游離氨基酸等理化指標進行了測定，初步探討其品質形成機理，為快速發酵工藝[5]升級和魚露品質控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

魚露樣品，廣東省遂溪平順水產公司提供。以青鱗魚（Harengula zunasi bleeker） 為原料，加20%海鹽搓勻、裝壇（2/3容積）、自然發酵，在不同階段進行取樣分析。取樣時，將魚露發酵液混勻，取適量混合液，部分用于微生物檢測，部分用濾紙（新星，102#定性濾紙12.5 cm） 過濾，濾液沸水浴10 min后用于理化指標分析。

1.2 試驗方法

通過傳統工藝發酵江洪魚露，利用分子生物學方法——16S rDNA序列分析對洪江魚露中的微生物進行分離、培養和鑒定。研究發酵過程中微生物多樣性差異，分析pH值、總可溶性氮（TSN）、揮發性鹽基氮（TVB-N）和游離氨基酸組成。

1.3 樣品16S rDNA V4～V5可變區的擴增和高通量測序

按照參考文獻[6]的方法對樣品基因組DNA進行提取與純化，采用引物barcode 338F（5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3'）和806R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'），對樣品16S rDNA的可變區V3～V4的進行擴增。反應體系：Taq Mix 10 μL，模版 1 μL，正反引物各 0.5 μL和 dd H2O補足 20 μL。反應條件：94℃變性5 min；94℃45 s，50℃60 s，72℃ 60 s，25次循環，72℃延伸10 min；擴增產物純化回收；基因組測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司通過Miseq Illumina平臺完成。

1.4 群落組成分析[7]

基于Miseq Illumina平臺的測序得到不同發酵階段魚露樣品文庫，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類分析，利用Silva（Release123 http://www.arb-silva.de） 進行分類學研究，利用Shannon指數等方法完成多樣性分析指數分析，探索魚露發酵樣品中細菌豐度與發酵時間的相關性。

1.5 理化指標的測定

總可溶性氮（TSN），采用凱氏定氮法[8]測定；揮發性鹽基氮（TVB-N），采用康維皿法（微量擴散法） 測定[9]；pH值，按照GB/T 10786—1989方法，用數字式pH計測定；總酸，按照GB/T 12456—1990方法；總酯，按照GB/T 10345.5—1989測定揮發性風味物質中乙醇含量的測定，采用氣相色譜-質譜聯用（GCMS）進行定性定量分析[10]。

1.6 游離氨基酸組成的測定

游離氨基酸的測定，采用L-8900型日立氨基酸自動分析儀和日立專用離子交換樹脂色譜柱（4.6 mm I.D.×60 mm×3 μm），溫度范圍20～85℃（步進1℃），檢測波長570 nm，標準氨基酸溶液為Sigma產品。

2 結果與討論

2.1 魚露發酵過程微生物菌系的消長變化分析

按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，利用稀釋曲線，分析了測序質量。通過Silva數據庫（Release123 http://www.arb-silva.de） 比對鑒定，可以發現江洪魚露發酵過程中的細菌主要屬于6個菌門（Phylum），即變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門 （Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria） 和藍藻門（Cyanobacteria）。發酵前期，檢測出真菌（Aspergillus） 分泌豐富的蛋白酶，使蛋白質水解成多肽、氨基酸等，為其他微生物的生長提供條件。其中，乳酸桿菌、乳酸乳球菌、芽孢桿菌在江洪魚露發酵過程中最為豐富，發酵前10個月，優勢菌互相交替變化。這些細菌大部分為耐鹽菌，這和青鱗魚生存的海水環境及魚露制作工藝（添加20%～30%海鹽）有直接關系。發酵12個月為江洪魚露發酵主要活動期，經細菌多樣性分析，共發現13個門、20個屬（其中有3個Unclassified），這是由于隨著海鹽滲入魚體，魚汁滲出，腸道內的海洋桿菌、假單胞菌和變形菌等開始生長。除此之外，也發現腸球菌、鏈球菌等少量腐敗菌。隨著乳酸菌發酵產生乳酸使pH值下降，一定程度上抑制了其他微生物的生長，使菌群組成保持相對穩定。

2.2 魚露發酵過程pH值、總酸含量的變化

酸度可以反映出魚露發酵的優劣程度，pH值可以影響微生物的生長繁殖。通過對江洪魚露的pH值測定可以發現，江洪魚露的優勢菌是酵母菌和乳酸菌。通過試驗可以得知，發酵前4個月，pH值不斷增高到5.8，酵母菌生長加快，氨基酸發生生化反應，轉變為揮發性鹽基氮；發酵4個月后，乳酸菌抑制雜菌生長，發酵液中游離的氨基酸轉變為有機酸，pH值開始下降。總酸的變化趨勢則和乳酸菌相反，江洪魚露中主要風味物質是揮發性脂肪酸，產生揮發性脂肪酸的主要途徑是通過微生物發酵。江洪魚露中含有大量的有機酸，在發酵4個月后，轉變為乙酸、丁酸等，總酸數值變大，是江洪魚露特殊風味的重要組成部分。

2.3 江洪魚露發酵過程TSN和TVB-N含量的變化

江洪魚露發酵過程中TSN和TVB-N的含量見表1。

利用凱氏定氮法和測定揮發性鹽基氮得到的TSN，TVB-N數值，可以反映出江洪魚露中微生物的發酵及品質狀況。TSN總數值呈不斷增長的狀態，前6個月快速增長，乳酸菌及酵母菌等優勢菌共同作用，分泌水解蛋白質；后6個月緩慢增加，證明蛋白質水解達到完全。利用TVB-N來測量洪江魚露的腐敗變質情況，蛋白質水解成氨基酸后，進一步發生生化反應，產生新的物質。前4個月TVB-N數值快速增長，緩沖液里雜菌較多，隨后優勢菌抑制雜菌，TVB-N數值增長變緩。

2.4 江洪魚露發酵過程主要香氣成分含量的變化

魚露發酵液通過測定乙醇的含量，確定微生物發酵進程。在江洪魚露的香氣物質中，可以測定乙醇是快速增長的物質，發酵初始階段，由于微生物的繁殖，眾多微生物互相作用，乙醇含量不斷增多，發酵8個月達到最大值（占揮發性風味物質總量的25.46%），隨后開始減少，逐漸轉化為其他揮發性風味物質。江洪魚露的總脂含量隨著發酵時間的延長也在不斷增多，與發酵8個月后乙醇含量不斷減少相互作用（與參考文獻[2]試驗結果一致），形成江洪魚露的獨特滋味。

2.5 魚露發酵過程中游離氨基酸組成與含量的變化

魚露發酵過程中游離氨基酸的組成與含量見表2。

由表2可以看出，江洪魚露在發酵過程的各個階段中，游離氨基酸總量不斷增加，谷氨酸的含量隨發酵時間的延長，增加的含量比其他氨基酸要多，提升了江洪魚露的鮮味。經過12個月的發酵，最終江洪魚露的游離氨基酸總量為4.054 mg/100 g，然而在發酵8個月的時候，江洪魚露的游離氨基酸總量已經達到4.405 mg/100 g，前8個月的發酵中游離氨基酸總量不斷增加，在發酵過程中，優勢菌種處于活躍狀態，乳酸菌分泌出的蛋白酶使青鱗魚的蛋白質水解，酵母菌的存在也使江洪魚露的發酵更加完全。而從發酵10個月開始，環境發生變化，使得游離氨基酸總量減少。

3 結論

江洪魚露經12個月發酵完全，發酵前10個月，優勢菌互相交替變化，發酵前4個月酵母菌是優勢菌，4個月后乳酸菌共同作用促進江洪魚露發酵。乳酸菌發酵產生乳酸使pH值下降，一定程度上抑制了其他雜菌的生長，乳酸菌分泌出的蛋白酶使青鱗魚的蛋白質水解，酵母菌的存在也使江洪魚露的發酵更加完全、風味更加協調、營養更加豐富。

表1 江洪魚露發酵過程中TSN和TVB-N的含量

表2 魚露發酵過程中游離氨基酸的組成與含量/mg·（100 g）-1

[1]翁武銀，陳書霖，劉光明，等.溫度對加曲速釀低鹽魚露性質的影響 [J].食品工業科技，2012，33（23）：183-191.

[2]黃紫燕，朱志偉，曾慶孝，等.傳統魚露發酵的微生物動態分析 [J].食品與發酵工業，2010，36（7）：18-22.

[3]Rissana R P，Mitsuya S，Yutaka O.Further identification of volatile compounds in fish sauce[J].J Agric Food Chem，1996 （4）：3 606-3 610.

[4]燕平梅，馬雁飛，倪玲.發酵食品中微生物多樣性研究方法進展 [J].中國釀造，2011（2）：12-14.

[5]黃紫燕，晁岱秀，朱志偉，等.魚露快速發酵工藝的研究 [J].現代食品科技，2010，26（11）：1 207-1 211，1 288.

[6]LisaO，ChristinZ，StefanL，etal.Theignoreddiversity:complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16Spyrosequencing[J].SciRep-UK，2013，3（3）：4 422-4 427.

[7]Quast C，Pruesse E，Yilmaz P，et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project：improved data processing and web-based tools[J].Nucl Acids Res，2013，41 （D1）：590-596.

[8]Conway E J，Byrne A.An absorption apparatus for the micro-determination of certain volatile substances：The microdetermination of ammonia[J].Biochem J， 1935 （27）：419-429.

[9]Jiang J J， Zeng Q X， Zhu Z W.Analysis of volatile compounds in traditional Chinese fish sauce（Yulu） [J].Food Bioprocess Technol，2011，4 （2）：266-271.

[10]門脅清.醬醪中微生物間的相互作用 [J].中國調味品，1988 （5）：12-14.◇

Analysis of Microbial Diversity in the Fermentation of Jianghong Yulu

QI Ningli1，RAO Mengwei2，LI Tao1，*GONG Xiao3，WEI Xiaoyi3，WANG Xiaofang3
（1.Laboratory of Quality&Risk Assessment on Agro-product Processing（Zhanjiang），Ministry of Agricuture，Agricultural Products Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang，Guangdong 524001，China；2.College of Food Science and Technolgy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524048，China；3.Agricultural Products Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang，Guangdong 524001，China）

Jianghong Yulu is made from Harengula nymphaea（Richardson） obtained from Beibu Gulf in China，and processed by traditional pickled，submerged，and natural fermentation.The changes of microbial diversity during fermentation were analyzed，and the changes of pH value，amino acid nitrogen，volatile base nitrogen and free amino acid were determined.The results showed that lactic acid bacteria and yeasts were the dominant bacteria in the process of Jianghong Yulu.The change of microbial community was closely related to the physichemical properties，which will provided theoretical basis for quality control and rapid fermentation technology in the production Jianghong Yulu.

Jianghong Yulu；microbial diversity；physichemical properties

S816

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.017

1671-9646（2017） 11a-0056-03

2017-08-28

中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金（1630122017T23）。

齊寧利（1982— ），女，碩士，助理研究員，研究方向為食品質量安全。

*通訊作者：龔 霄（1984— ），男，博士，副研究員，研究方向為食品發酵與代謝組學。