魷魚肝臟蛋白酶的鑒定及組織蛋白酶L的分離純化

田元勇，宋 揚，鄭 堯，劉慧慧，劉俊榮*

魷魚肝臟蛋白酶的鑒定及組織蛋白酶L的分離純化

田元勇，宋 揚，鄭 堯，劉慧慧，劉俊榮*

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023）

魷魚肝臟含有豐富的蛋白酶，為利用其內源蛋白酶進行可控的酶解，本研究以鯉魚肌原纖維蛋白為底物對魷魚肝臟內源蛋白酶的種類和性質進行了研究。反應體系中添加E-64、1,10-菲啰啉和苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）后，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的降解得到了顯著抑制，確定了魷魚肝臟含有金屬類、半胱氨酸類、絲氨酸類3 類蛋白酶。半胱氨酸類蛋白酶熱穩定性最好，在50 ℃以上仍然具有較大活性，可將肌原纖維蛋白酶解成小分子質量的降解產物。利用特異性底物對半胱氨酸蛋白酶種類進行鑒定發現，該酶只酶解Z-Phe-Arg-MCA，添加亮抑酶肽后相對酶活性為0%，添加E-64相對酶活性僅存0.6%，初步確定魷魚肝臟中的半胱氨酸蛋白酶主要為組織蛋白酶L。最后，通過硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾對組織蛋白酶L進行分離純化，在電泳上得到了分子質量約為25 kD單一條帶。

魷魚肝臟；酶解；抑制劑；熒光底物；組織蛋白酶L

目前，關于水產蛋白利用的研究取得了很多重要的成果。對于功能性較差的蛋白資源，如低值魚肉[1-3]、水產殘渣[4]、魚的生殖腺[5]等通過添加外源酶[6-7]或者利用內源酶[8]進行酶解，生產具有各種功能性的多肽是提高廢棄物有效利用的途徑之一。內源酶由于個體差異、季節差異[9]等原因導致酶解的控制比較困難，因而為更有效、可控地利用內源酶，需要對水產品內源酶的性質進行系統研究。

魷魚是一個非常重要的水產經濟品種，在加工過程中會產生大量的廢棄物。主要包括頭部、內臟、皮等部位，占魷魚總質量的50%左右，其中肝臟占魷魚總質量的15%左右。這部分通常被當作廢棄物掩埋處理，這不僅造成了巨大的資源浪費，而且污染了環境。魷魚肝臟富含多不飽和脂肪酸[10]、蛋白質等營養成分，通過蛋白酶水解后可用作水產飼料[11-12]、調味料[13-14]、ACE活性肽[15-16]。此外，魷魚肝臟還含有豐富的蛋白酶。Cardenas-Lopez等[17]從巨型魷魚的肝臟中分離得到了組織蛋白酶L，日本研究者[18-20]從日本魷魚分離得到了肌球蛋白酶myosinaseⅠ、Ⅱ，Sakai-Suzuki等[21]從魷魚外套膜中分離出了酸性半胱氨酸蛋白酶，并分別對分離得到的蛋白酶的酶學性質進行了研究。Funaki等[22]研究了日本傳統食品鹽辛生產過程中魷魚肝臟蛋白酶的作用。為了使魷魚肝臟進行可控的自水解或對其他蛋白資源的酶解，Tian等[23]對其內源性蛋白酶的酶學性質及其對魚肉蛋白的消化特性進行了比較系統的研究，前期的研究中發現半胱氨酸類蛋白酶具有比較好的熱穩定性、pH值穩定性和對底物的低選擇性。本研究通過各種抑制劑對魷魚肝臟中的蛋白酶進行了鑒定，并對3 類蛋白酶的溫度特性進行比較，通過特異性底物對半胱氨酸蛋白酶的類型進行了鑒定，進一步對組織蛋白酶L進行了分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取新鮮魷魚肝臟部分，利用丙酮脫脂脫水后得到干燥粉末，-40 ℃冰箱貯存備用。活鯉魚購買于大連沃爾瑪超市；運至實驗室立刻速殺，去頭、內臟、鱗、鰭、鰓，然后清洗去皮、去骨、采肉、放入斬拌料理機中絞碎成肉泥狀，立即使用。

E-64（L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido-4-guandimobutane）、抑肽素、亮抑酶肽、N-乙基馬來酰亞胺（N-ethylmaleimide，NEM）、對-氯汞基苯甲酸鹽（p-chloromercuribenzoate，PCMB）、大豆胰蛋白酶抑制物（soybean trypsin inhibitor，SBIT）美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、1,10-菲啰啉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 日本和光純藥工業株式會社。

1.2 儀器與設備

AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多有限公司；Z-326K冷凍離心機 德國Hermle公司；PB-10 pH計德國賽多利斯集團；UV1800紫外-可見分光光度計日本島津株式會社；J-715熒光分光光度計 日本分光株式會社；AE-6500電泳儀 日本Atto株式會社。

1.3 方法

1.3.1 魷魚肝臟蛋白酶的提取

取2.0 g魷魚肝臟脫脂粉末，加入20 mL的0.1 mol/L NaCl、0.02 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液，7 000 r/min均質3 次，每次30 s。然后10 000×g離心20 min，收集上清液，用同一緩沖溶液透析12 h，所得的溶液即為魷魚肝臟粗酶液。以上所有操作均在4 ℃進行。

1.3.2 魷魚肝臟蛋白酶活性的測定

以鯉魚肌原纖維蛋白為底物，對魷魚肝臟蛋白酶的活性進行測定。肌原纖維蛋白的提取參考Kato等[24]的方法，略有修改。取5.0 g鯉魚背部白肉，切碎后加入0.1 mol/L NaCl、0.02 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液反復漂洗3 次，在4 ℃、3 000 r/min條件下，離心5 min。取沉淀加入25 mL的同一緩沖溶液，在14 000 r/min均質3 次，每次間隔 30 s。離心得到的沉淀用上述緩沖溶液漂洗后懸濁，用兩層紗布過濾，濾液即為鯉魚肌原纖維蛋白溶液。使用該溶液作為底物檢測魷魚肝臟蛋白酶的活性。在0.2 mL反應組成液（其中包括肌原纖維蛋白2.5 mg/mL、粗酶液0.2 mg/mL、NaCl 0.5 mol/L、Tris-HCl（pH 7.5）20 mmol/L）中分別加入以下各種抑制劑：E-64（10 mmol/L）、PMSF（1 mmol/L）、EDTA（5 mmol/L）、1,10-菲啰啉（3 mmol/L）、亮抑酶肽（10 mmol/L）、NEM（1 mmol/L）、PCMB（5 mmol/L）、SBIT（100 mg/mL）、抑肽素（10 mg/mL）。在20 ℃條件下反應20 min，反應停止后添加 0.3 mL電泳緩沖溶液（2%巰基乙醇、2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、0.05%溴酚藍、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）），并立即煮沸5 min。所得到的樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）進行分析，并通過肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）量的變化來評價蛋白酶的活性。

1.3.3 3 種蛋白酶不同溫度的酶切特性

在蛋白酶提取液中分別添加E-64和PMSF、1,10-菲啰啉和PMSF、E-64和1,10-菲啰啉制備金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶反應體系。3 個反應體系中分別添加10%、2.5%、10%的粗酶，并與肌原纖維蛋白溶液混合，分別在 20、30、35、40、45、50、60、70、80、90 ℃反應30 min，最后加入0.3 mL電泳緩沖溶液煮沸5 min，進行SDS-PAGE分析。

1.3.4 基于特異性熒光多肽底物的蛋白酶活性檢測

參考Sherekar等[25]的方法，以熒光多肽為底物，對半胱氨酸蛋白酶活性進行了測定。方法如下：比色皿放置于熒光分光光度計中，3 mL緩沖溶液中加入0.1 mL熒光多肽底物，37 ℃預熱2 min后，加入0.02 mL粗酶溶液，立刻測定反應釋放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強度，測定的激發波長為380 nm，發射波長為460 nm。在反應液中分別添加亮抑酶肽、E-64、PMSF、EDTA檢測蛋白酶活性的變化。酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC需要的酶量。

1.3.5 組織蛋白酶L的分離純化

魷魚肝臟提取的粗酶溶液（0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5））中加入40%硫酸銨，在冰水中靜置30 min后，20 000×g離心20 min取上清液，進一步加入硫酸銨至飽和質量分數60%，收集沉淀。用0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的緩沖溶液透析12 h后，20 000×g離心20 min，取離心后上清液5 mL進行分離純化。TOYOPRARL DEAE-650M（1.6 cm×20 cm）先用1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的緩沖溶液洗凈，再用0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液平衡。用0.05～0.4 mol/L NaCl溶液進行線性洗脫，流速10 mL/min，3 mL/管進行回收。然后以肌原纖維蛋白為底物對各管的酶活性進行測定，收集半胱氨酸蛋白酶活性高的組分，濃縮后添加到0.1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）平衡的TOYOPEARL HW-55F（1.6 cm×100 cm）色譜柱。5 mL/h的流速，3 mL/管進行收集。使用Z-Phe-Arg-MCA為底物對各組分的活性進行測定，收集高活性組分，濃縮后得到純化的組織蛋白酶L。

2 結果與分析

2.1 魷魚肝臟粗酶對肌原纖維蛋白的酶解特性

表1 各種抑制劑組合方式Table 1 Different combinations of protease inhibitors

按照表1所示的組合添加各種抑制劑到魷魚肝臟粗酶，分析各種蛋白酶對肌原纖維蛋白的酶解特性，結果如圖1所示，在不添加任何抑制劑的條件下（A），MHC和肌動蛋白都呈減少趨勢，相應能看到很多新條帶的產生。添加各種抑制劑后，MHC的降解不同程度得到抑制，生成的條帶也有所不同。其中E-64、1,10-鄰菲羅啉、PMSF、NEM、亮抑酶肽、PCMB、EDTA等抑制劑，不管是單獨添加到反應體系，還是幾種混合后添加到反應體系，都對MHC的降解產生了顯著的抑制效果。E-64、1,10-鄰菲羅啉、PMSF聯合添加到反應體系，幾乎可以完全抑制MHC的降解，SBTI和抑肽素的添加幾乎沒有作用。因此推定魷魚肝臟內主要含有金屬類、半胱氨酸類和絲氨酸類蛋白酶，而幾乎不含有天冬氨酸類蛋白酶。

圖1 各種抑制劑對魷魚肝臟蛋白酶的抑制效果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of inhibition of squid liver proteases by different inhibitor combinations

2.2 3 類蛋白酶對肌原纖維蛋白的酶解特性

根據圖1的結果可知，通過添加兩類蛋白酶的抑制劑，僅使其中一類蛋白酶起作用，可分析某一類蛋白酶的性質。在反應體系中分別添加E-64和PMSF、1,10-鄰菲羅啉和PMSF、E-64和1,10-鄰菲羅啉制備金屬蛋白酶作用系、半胱氨酸蛋白酶作用系、絲氨酸蛋白酶作用系，根據酶活性大小不同調節了粗酶添加量。圖2A顯示，在30℃條件下的降解物條帶比較固定，包括150、140、110 kD的重酶解肌球蛋白（heavy meromyosin，HMM）和50、60、90 kD的輕酶解肌球蛋白（light meromyosin，LMM），酶切位點比較專一，與Tamori等[19]報道魷魚肝臟的金屬蛋白酶對肌球蛋白酶解降解的片段類似；40 ℃以上，降解物條帶減少，Okamoto等[18]報道魷魚金屬蛋白酶有myosinaseⅠ和Ⅱ兩種類型，本研究的粗酶未進行分離純化，其中含有多種金屬類蛋白酶，每種酶的熱穩定性不同引起了降解圖譜的改變。圖2B顯示，在35 ℃以下，半胱氨酸類的降解物條帶比較固定；40 ℃以上，MHC量急劇減少，而且條帶顯著增加，由此推測在40 ℃以上，半胱氨酸類蛋白酶酶切位點增多，其原因可能是在40℃以上肌原纖維蛋白的結構發生了變化導致酶切位點暴露而引起。Tian等[26]報道的肌球蛋白結構的改變可導致胰凝乳蛋白酶酶切位點的增多。圖2C顯示，在40 ℃以上，絲氨酸類蛋白酶的降解物條帶也有所增加。通過以上結果可知半胱氨酸類蛋白酶對溫度耐受性最強，活性最高，可把肌原纖維蛋白分解成更小的片段，在多肽生產方面具有更好的應用前景。

圖2 溫度對3 種蛋白酶消化圖譜的影響Fig. 2 Effect of temperature on the digestion patterns of the three types of proteinases in squid liver

2.3 基于特異性熒光多肽底物檢測半胱氨酸蛋白酶活性

表2 魷魚肝臟蛋白酶對不同熒光底物酶切效果Table 2 Squid liver proteinases activities measured using synthetic substrates

利用各種特異性熒光底物對魷魚肝臟蛋白酶的活性進行測定，結果如表2所示，組織蛋白酶B/L的特異性底物Z-Phe-Arg-MCA能檢測到較大的酶活性，以該活性作為100%進行比較發現，組織蛋白酶B的特異性底物Z-Arg-Arg-MCA幾乎沒有檢測到粗酶的活性，僅為0.53%，由此推定粗酶中組織蛋白酶B的含量很少。此外組織蛋白酶S/L的特異性底物Z-Val-Val-Arg-MCA也幾乎沒有檢測到粗酶的活性，僅為1.7%。根據Br?mme等[27]的報道可知，組織蛋白酶S對Z-Val-Val-Arg-MCA的分解活性為Z-Phe-Arg-MCA的10 倍，所以可推定粗酶中也幾乎不含組織蛋白酶S。組織蛋白酶H、K的特異性底物也幾乎沒有檢測到酶活性。所以推定魷魚肝臟中半胱氨酸蛋白酶的主要成分是組織蛋白酶L。進一步利用Z-Phe-Arg-MCA為底物，檢測各種抑制劑的抑制效果，結果如表3所示，E-64和亮抑酶肽抑制效果最好。

表3 Z-Phe-Arg-MCA為底物檢測的抑制劑抑制效果Table 3 Inhibition of crude proteinase activity with Z-Phe-Arg-MCA as substrate

2.4 組織蛋白酶L的分離純化

圖3 TOYOPEARL DEAE-650M分離半胱氨酸蛋白酶結果Fig. 3 Chromatography of cystein proteinase on TOYOPEARL DEAE-650M

魷魚肝臟粗酶經40%～60%飽和度的硫酸銨沉淀，離心后所得沉淀溶解于0.05 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液中，透析48 h后，上樣品到平衡好的TOYOPRARL DEAE-650M離子交換層析柱，0.05～0.4 mol/L NaCl溶液線性洗脫，在280 nm波長處檢測吸光度，結果如圖3所示，可以得到未吸附組分Ⅰ和被吸附組分Ⅱ。再用鯉魚肌原纖維蛋白為底物，在pH 7.0、37 ℃檢測每管蛋白酶的活性。在未吸附組分Ⅰ中可以檢測到金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶活性（圖4a、c）。在吸附組分Ⅱ可以檢測到金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶（圖4a、b）。在組分Ⅰ和組分Ⅱ中金屬蛋白酶對肌球蛋白的酶切圖譜并不一致，分析可能是不同種的金屬類蛋白酶。Tamori等[19]也報道過魷魚肝臟來源的金屬蛋白酶包含3 種類型，肌球蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中肌球蛋白Ⅰ可將兔MHC降解成130 kD和90 kD的片段，而肌球蛋白酶Ⅱ酶切的片段分子質量為158 kD和65 kD，肌球蛋白酶Ⅲ酶切的片段為120 kD和100 kD。據此推測組分Ⅰ中含有的金屬類蛋白酶可能是肌球蛋白酶Ⅱ，在組分Ⅱ中含有的金屬類蛋白酶是肌球蛋白酶Ⅰ和Ⅲ。肌球蛋白酶Ⅰ、Ⅱ和組織蛋白酶L不能通過DEAE-650M分開。收集組分Ⅱ，濃縮后添加到平衡好的TOYOPEARL HW-55F層析柱（1.6 cm×100 cm），所得結果如圖5所示，同樣可以得到組分Ⅰ和組分Ⅱ，利用Z-Phe-Arg-MCA為底物對各組分活性進行檢測發現，組分Ⅱ有較高的活性。收集組分Ⅱ，采用膠質量分數為12%的SDS-PAGE進行分析，結果如圖 6所示，所得粗酶經過硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾后得到的單一條帶分子質量為25 kD。其他研究從海參[28]、美國巨型魷魚肝臟[17]、藍圓鰺肌肉[29]、雜色鮑[30]中分離的組織蛋白酶L的分子質量在23～30 kD之間，與本研究結果類似。

圖4 TOYOPEARL DEAE-650M分離蛋白酶的酶解SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE analysis of proteinase in elution peak from TOYOPEARL DEAE-650M

圖5 TOYOPEARL HF-55F凝膠過濾純化組織蛋白酶LFig. 5 TOYOPEARL HF-55F chromatographic profile of cathepsin L

圖6 組織蛋白酶L分離過程的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 SDS-PAGE analysis of crude and purified cathepsin L

3 結 論

綜上所述，魷魚肝臟主要含有3 類蛋白酶（金屬類、半胱氨酸類、絲氨酸類），對魚肉的肌原纖維蛋白的酶切性質不同。金屬類蛋白酶的酶切位點比較固定，即使肌球蛋白發生變性酶切位點也不會增多，而半胱氨酸類蛋白酶在肌球蛋白發生變性后，酶切位點顯著增多，可得到小分子酶切片段，并且半胱氨酸類蛋白酶對溫度耐受性最好，在60 ℃依然表現出比較高的活性。通過特應性熒光底物確定半胱氨酸蛋白酶的主成分為組織蛋白酶L，通過分離純化后，確定其分子質量在25 kD左右，接下來有必要對組織蛋白酶 L進行深入研究。

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Identification of Proteases and Purification of Cathepsin L from Squid Liver

TIAN Yuanyong, SONG Yang, ZHENG Yao, LIU Huihui, LIU Junrong*
(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

In order to understand the applicability of endogenous proteases from squid liver as a rich source of proteases, the endogenous proteases of squid liver were identified and characterized with common carp myofibrillar protein as substrate by adding a variety of protease inhibitors. It was found that the degradation of myosin heavy chain (MHC) was significantly inhibited by addition of E-64, 1,10-phenanthroline and PMSF to the reaction system indicating that squid liver contained three kinds of proteases, metalloprotease, cysteine protease and serine protease. The cysteine protease had the best thermal stability and highest activity, which still maintained a high activity at temperatures higher than 50 ℃, and it could hydrolyze myofibrillar proteins into small molecules. Substrate specificity analysis indicated that the cysteine protease could only hydrolyze Z-phe-Arg-MCA, and was inhibited 100% by leupeptin and 99.4% by E-64, indicating that the enzyme consisted mainly of cathepsin L. At last, cathepsin L was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, ion exchange and gel filtration chromatography. The purified enzyme showed a molecular weight of about 25 kD.

squid liver; enzymatic hydrolysis; inhibitor; fluorogenic substrate; cathepsin L

10.7506/spkx1002-6630-201724005

TS254

A

1002-6630（2017）24-0028-06

田元勇, 宋揚, 鄭堯, 等. 魷魚肝臟蛋白酶的鑒定及組織蛋白酶L的分離純化[J]. 食品科學, 2017, 38(24): 28-33.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201724005. http://www.spkx.net.cn

TIAN Yuanyong, SONG Yang, ZHENG Yao, et al. Identification of proteases and purification of cathepsin L from squid liver[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 28-33. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724005.http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-08

國家自然科學基金面上項目（31671790）；遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2015082）；

教育部留學回國人員科研啟動基金項目（教外司留[2013]693號）

田元勇（1978—），男，講師，博士，研究方向為水產品加工。E-mail：tianyuanyong@foxmail.com

*通信作者：劉俊榮（1963—），女，教授，博士，研究方向為水產品加工與質量安全。E-mail：ljunrong@dlou.edu.cn