高脂飲食對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響研究

胡波 李德才

621000四川綿陽四○四醫院心內科

高脂飲食對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響研究

胡波 李德才

621000四川綿陽四○四醫院心內科

目的：探討高脂飲食對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響。方法：將SD大鼠分為對照組(N組)、糖尿病組(D組)和高脂飲食組(H組)。H組以高脂飼料喂養，其余兩組以普通飼料喂養。結果：D組大鼠心肌TNF-α表達較對照組明顯升高，H組心肌TNF-α表達明顯較N組及D組升高(P＜0.05)。D組及H組心肌EGFR、TGF-β1表達均增加(P＜0.05)。結論：高脂飲食通過上調TNF-α、EGFR、TGF-β1表達及增加心肌膠原纖維沉積，在糖尿病心肌纖維化過程中具有重要作用。

糖尿病；心肌纖維化；高脂飲食

糖尿病(DM)具有病程長、并發癥多等特點，其中糖尿病心肌病(DC)是其嚴重的并發癥之一，是引起糖尿病患者心力衰竭的重要原因。DC的發生與冠狀動脈粥樣硬化無關，其發病原因目前尚未完全明確。DC早期臨床表現為心臟舒張功能障礙，逐漸進展為心肌收縮功能障礙，病理學檢查可發現心肌細胞肥大、壞死，心肌間質纖維化，膠原大量沉積[1]。糖脂代謝異常是DM的顯著特征，高脂血癥是否與DC的發生、發展有關尚未明確。本研究采用糖尿病大鼠模型，給予高脂飲食，觀察糖尿病大鼠心肌膠原、TNF-α及表皮生長因子受體(EGFR)、轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達，了解高脂血癥在DC發病中的作用。

資料與方法

建立糖尿病大鼠模型并分組：8周齡雄性SD大鼠60只，體重180～200 g，隨機分為正常對照組(N組20只)和造模組(40只)。禁食12 h后，對照組注射65mg/kg緩沖液；造模組按照同體積一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h后，采鼠尾靜脈血測血糖，以隨機血糖≥16.7mmol/L確定為糖尿病模型成立。共38只符合糖尿病大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為糖尿病組(D組，18只)和高脂飲食組(H組，20只)。N組和D組喂以普通飼料，H組以高脂飼料喂養12周。

方法：①標本收集：實驗結束時禁食10 h，稱取每只大鼠體重(BW)。腹主靜脈取血測血脂。大鼠斷頭處死后迅速取出心臟，測量左室質量(LVM)，計算左室質量指數(LVMI)=LVM/BW，用于評價左心室肥厚程度。采用10%中性甲醛固定部分左心室組織，供天狼猩紅和免疫組化染色；另取部分組織做心肌EGFR、TGF-β1的檢測。②測定血糖和血脂生化指標。③心肌膠原及TNF-α表達檢測：取心室部冠狀切面心肌組織，常規脫水石蠟包埋，制作切片，連續切片(厚5μm)，標本脫蠟，梯度乙醇脫水。膠原檢測采用苦味酸天狼猩紅染色，具體步驟按試劑盒說明進行。操作結束后在光鏡下觀察膠原纖維陽性區染呈紅色，細胞核呈藍色，在偏振光顯微鏡下采集圖像，測定紅色和橙黃色的Ⅰ型膠原、綠色的Ⅲ型膠原，得到Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，計算Ⅰ/Ⅲ型膠原比值。TNF-α表達檢測采用免疫組化SP法，按照試劑盒說明進行，細胞質內出現黃色為陽性反應。在光學顯微鏡400倍下觀察：每張切片按順序選10個視野，分別檢測每個視野內陽性細胞數，最后以每組的均值進行數據處理。④EGFR、TGF-β1Western blot：提取心肌組織總蛋白后，樣品150μg用10%SDS-PAGE電泳后半干式轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。EGFR、TGF-β1一抗1:250稀釋，室溫過夜，加馬抗山羊IgG抗體(1:500稀釋)室溫反應1.5 h，DAB顯色，膜置濾紙上干燥，掃描，以β-actin為對照，進行半定量分析。

統計學方法：采用SPSS 10.5進行統計分析，計量資料以±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，用q檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

各組大鼠LVMI、生化指標的改變：D組大鼠LVMI、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯均較N組明顯增加(P＜0.05)，H組大鼠LVMI、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯均較D組及N組升高，組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

光鏡觀察結果：N組大鼠心肌組織結構完整，心肌細胞排列整齊、致密，結構清晰。D組及H組大鼠心肌組織結構發生明顯改變，表現為心肌細胞排列紊亂、細胞肥大、細胞間隙擴大。N組大鼠心肌間血管周圍可見少許膠原纖維沉積，D組及H組大鼠血管周圍膠原纖維沉積明顯增加。

各組大鼠心肌膠原、TNF-α的表達：各組心肌組織均有膠原表達。與N組相比較，D組和H組大鼠心肌間質膠原纖維明顯增多(P＜0.05)；與D組相比較，H組大鼠心肌間質膠原纖維明顯增加(P＜0.05)。TNF-α在N組心肌細胞質內弱表達，而其在D組心肌細胞質中表達明顯增加，H組中表達較D組明顯增加，組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

各組大鼠EGFR、TGF-β1的表達：糖尿病大鼠心肌組織均有一定程度EGFR、TGF-β1表達。與N組比較，D組及H組EGFR、TGF-β1表達增加，組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。H組EGFR、TGF-β1表達較D組增加，MMP-9/TIMP-1比值降低，組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3和圖1。

討 論

研究表明，＞70%的糖尿病患者因并發心血管系統疾病而死亡，是非糖尿病患者的2～3倍。DC主要表現為心肌細胞肥大、凋亡、間質纖維化及血管壁增厚，其發病不依賴于高血壓、冠狀動脈疾病和其他已知心臟疾病。研究認為心肌間質纖維化可能是DC的特征性病理改變[2]，心肌纖維化是心肌重構的主要特征，表現為細胞外基質合成與降解失衡，心肌組織結構中collagenⅠ和collagenⅢ含量明顯增加[3]。本實驗通過腹腔注射STZ建模糖尿病大鼠成功，心肌組織染色可見心肌組織結構紊亂、纖維增生明顯，與文獻報道相符[4]。予以高脂飲食飼養后心肌纖維組織明顯增生，表明高脂飲食可促進糖尿病大鼠心肌纖維化。

表1 各組LVMI、生化指標比較(±s)

表1 各組LVMI、生化指標比較(±s)

注：與對照組比較，①P＜0.05；與D組間比較，②P＜0.05。

·組別 只數 LVM I(mg/g) FPG(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L)N組 20 1.82±0.22 4.36±0.32 0.80±0.14 0.58±0.18 D組 18 2.46±0.32① 17.22±3.42① 3.46±1.84① 3.85±0.71①H組 20 3.15±0.41①②·19.61±3.82①②·4.25±1.56①②5.05±1.19①②·

表2 各組心肌膠原、TNF-α表達比較±s)

表2 各組心肌膠原、TNF-α表達比較±s)

注：與對照組比較，①P＜0.05；與D組間比較，②P＜0.05。

組別 只數 Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原 Ⅰ/Ⅲ膠原比值 TNF-a N組 20 2.56±0.05 1.58±0.04 1.62±0.04 0.21±0.02 D組 18 3.35±0.08① 1.82±0.05① 1.85±0.06① 0.45±0.03①H組 20 4.56±0.12①② 2.02±0.09①② 2.32±0.10①② 0.84±0.06①②

表3 各組EGFR、TGF-β1表達的比較±s)

表3 各組EGFR、TGF-β1表達的比較±s)

注：與對照組比較，①P＜0.05；與D組間比較，②P＜0.05。

組別 只數 EGFR TGF-β1 N組 20 1.54±0.42 0.82±0.06 D組 18 2.65±0.62① 1.98±0.56①H組 20 4.34±0.84①② 2.75±0.60①②

圖1 各組EGFR、TGF-β1蛋白的表達

在糖尿病機體中引起心肌間質纖維化的因素眾多，其中TNF-α、EGFR及TGF-β1等細胞因子被認為是促發心肌纖維化的重要的因素。TNF-α作為判斷心衰程度和預后的指標[5]。TNF-α可誘導原癌基因c-myc和c-f0smRNA表達，引起心肌間質膠原纖維堆積、膠原蛋白沉著和間質纖維化，導致心肌重構。EGFR對促進細胞增殖具有重要的作用，EGFR可通過激活CTGF調節細胞增殖、凋亡、遷移，促進心肌纖維化[6]。在EGFR基因敲除小鼠血管及心肌組織中纖維化較正常小鼠明顯減少，從反面證實了EGFR能促進心肌纖維化[7]。TGF-β1是公認的引起心肌間質纖維化最重要因素之一，也是諸多因素所致心肌纖維化的共同通路[8]。活化型TGF-β1受體介導TGF-β1的作用，使心肌成纖維細胞合成細胞外基質，并抑制蛋白水解酶表達，抑制纖溶酶原、膠原酶基質酶原等酶激活物的產生，導致ECM降解作用減慢，造成ECM的沉積，從而引起心肌纖維化[9]。本研究發現糖尿病大鼠心肌TNF-α、EGFR及TGF-β1表達增加，高脂飲食可進一步誘導其表達，表明高脂飲食可促進糖尿病大鼠心肌纖維化。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，并予以高脂飲食誘發高脂血癥，初步發現高脂飲食在糖尿病大鼠心肌間質纖維化發生、發展的病理過程中具有重要作用，表明高脂血癥可能參與了DC的發生發展，其進一步作用機制值得繼續研究。

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Study on the effect of high fat diet on myocardial fibrosis in diabetic rats

Hu Bo,Li Decai
Department of Cardiology,Mianyang No.404 Hospital of Sichuan621000

Objective:To investigate the effect of high-fat diet on myocardial fibrosis in diabetic rats.Methods:SD rats were divided into the control group(group N),the diabetic group(group D)and the high fat diet group(group H).Group H was fed with high fat diet,and the other two groups were fed with normal diet.Results:The expression of TNF-a in the myocardium of the D group was significantly higher than that in the control group,and the expression of TNF-a in the H group was significantly higher than that in the N group and the D group(P＜0.05).The expressions of EGFR and TGF-β1in myocardium of the D group and the H group increased(P＜0.05).Conclusion:High fat diet plays an important role in the process of myocardial fibrosis in diabetes by up regulating the expression of TNF-a,EGFR,TGF-β1,and increasing the deposition of myocardial collagen fibers.

Diabetes;Myocardial fibrosis;High-fat diet

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.33.1

科研項目四川省綿陽市原衛生局科研課題(編號201335)

Research projectscientific research project of Mianyang health bureau of Sichuan province(No.201335)