響應面法優化羊肉發酵香腸工藝

李靜雯+李秋桐+母應春+蘇偉

摘 要：以山羊肉為原料，添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）和米根霉（Rhizopus oryzae，RO）進行混合發酵，制作羊肉發酵香腸。結合pH值、色差和感官評價結果探究菌種的復配比例、接種量、發酵溫度和發酵時間對羊肉發酵香腸的影響，在單因素試驗的基礎上，以感官評分為響應值，選取菌種復配比例、接種量和發酵溫度進行三因素三水平的Box-Behnken design（BBD）響應面優化試驗設計，確定制作羊肉發酵香腸的最佳工藝參數。結果表明：在發酵時間為16 h的條件下，PA與RO復配發酵羊肉香腸的最佳工藝參數為復配比例1∶1、接種量2.2%、發酵溫度32 ℃。在此條件下羊肉發酵香腸的感官評分為6.34 分，與模型理論值相接近。最佳工藝條件下，PA與RO復配發酵羊肉香腸的pH值在5.2～5.3之間，酸度適中，且色差值與空白組無顯著差異，感官品質提高，膻味降低。

關鍵詞：乳酸片球菌；米根霉；Box-Behnken響應面優化試驗；羊肉發酵香腸

Abstract： In this study， we aimed to the optimum processing parameters for fermented mutton sausage made from goat meat using a mixed starter culture of Pediococcus acidilactici （PA） and Rhizopus oryzae （RO）. The effect of PA/RO ratio， inoculum size， fermentation temperature and time on the pH value， color and sensory evaluation of sausage was investigated by one-factor-at-a-time method. Subsequently， PA/RO ratio， inoculum size， fermentation temperature were optimized using response surface methodology with a three-factor， three-level Box-Behnken design （BBD）. The response variable was sensory score. A fermentation time of 16 h， temperature of 32 ℃， a PA/RO ratio of 1：1 and an inoculum size of 2.2% were found to be the optimum processing conditions to obtain a higher sensory score of 6.34， agreeing with the model predicted value. The sausage prepared using the optimized conditions had moderate acidity （pH 5.2–5.3） and showed no significant difference in color difference as well as improved sensory quality and reduced mutton smell compared with the uninoculated and fermented sausage.

Key words： Pediococcus acidilactici （PA）； Rhizopus oryzae （RO）； Box-Behnken design （BBD）； fermented mutton sausage

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201711004

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）11-0020-06

羊肉不僅味道鮮美、營養豐富，還含有人體所需的必需氨基酸，但生羊肉具有讓人難以接受的膻味[1-3]。羊肉的膻味主要來自脂肪中的支鏈脂肪酸[4-7]，目前，國內外研究人員主要利用植物乳桿菌[8-11]、彎曲乳桿菌[12]、產香戊糖片球菌[12-13]、葡萄球菌[13]、清球乳桿菌[12，14]、木瓜蛋白酶[8]以及嗜酸乳桿菌[15]等對羊肉進行發酵除膻。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）具有較好的耐鹽性，產酸速度快，且抑菌能力較強[16-17]，現已從發酵香腸[18]、發酵肉[19]、啤酒[20]和米酒[21]等食品中分離出乳酸片球菌，并將其用于豬肉[22-23]和鴨肉香腸[24]的制備，獲得了感官品質較好的產品。乳酸菌可以通過糖酵解途徑進行發酵，使肉制品的pH值及水分活度（water activity，aw）降低，產生刺激性氣味，引起肉中蛋白質的降解和凝固，對氨基酸的產生有重要作用，從而影響產品的整體風味。

發酵香腸的風味形成與霉菌和酵母菌的蛋白質、脂肪分解以及乳酸降解有關。大多數根霉脂肪酶具有Sn-1（3）位置特異性，將適量具有這一特性的脂肪酶加入香腸中可以顯著增加香腸的香氣，同時加速脂肪的氧化及水解[25-26]。脂肪酶大多以胞內酶為主，當pH值下降至5時可以促進根霉產胞外脂肪酶。本研究以山羊肉為原料，添加乳酸片球菌和米根霉（Rhizopus oryzae，RO）[27-29]

進行混合發酵，制作羊肉發酵香腸，結合pH值、色差和感官評價結果探究菌種的復配比例、接種量、發酵溫度和發酵時間對羊肉發酵香腸的影響，在此基礎上利用響應面優化試驗進一步分析，得到加工低膻羊肉發酵香腸的最佳工藝參數。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊瘦肉、羊肥膘 貴州省晴隆縣海權清真肉羊食品加工有限責任公司；食鹽、蔗糖、白酒、腸衣 貴州省貴陽市合力超市；CICC 10344乳酸片球菌 中國工業微生物菌種保藏管理中心；ATCC 96382米根霉 廣東省微生物菌種保藏管理中心；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Testo205便攜式pH計 德圖儀表（深圳）有限公司；SC20色差儀 蘇州欣美和儀器有限公司；FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司；DHP-420電熱恒溫培養箱 天津天泰儀器有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉發酵香腸配方及制作工藝

配方：羊瘦肉與羊肥膘質量比為8∶2，輔料為食鹽2.0%、蔗糖0.7%、白酒1.5%和冰水15%（均為在羊肉中的質量分數）。

制作工藝：原料→漂洗→瘦肉絞碎、肥肉切丁→加入輔料以及占輔料中冰水50%的冰水，腌制24 h→添加發酵劑→斬拌均勻→灌腸→恒溫發酵→干燥（20 ℃，2 d）→蒸制（85 ℃，1 h）

1.3.2 菌種培養

按照說明書中的步驟將PA活化2 代，接種于PA種子培養基中，37 ℃培養24 h；從種子培養基中取2%菌液加入PA擴大培養基中，37 ℃培養24 h；6 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水清洗沉淀3 次，加入無菌水，調整活菌數至108 CFU/mL，備用。

按照說明書中的步驟將RO活化2 代，轉接至斜面培養基中，30 ℃培養3～5 d；向斜面培養基[30-31]中加入5 mL無菌水并輕輕刮下孢子，重復清洗3 次，合并孢子液于盛有玻璃珠的三角瓶中，反復振蕩后用帶有滅菌脫脂棉的漏斗過濾，得到孢子液，調整孢子液濃度為108 CFU/mL，備用。

1.3.3 單因素試驗設計

以pH值、色差和感官評分為評價指標，探究2 種菌的復配比例（RO∶PA）（m/m）、接種量（菌液在羊肉中的質量分數）、發酵溫度和發酵時間對發酵香腸的影響。以不接種菌種的發酵香腸為空白對照組。單因素試驗設計中各因素的水平如表1所示。

1.3.4 響應面試驗設計

結合單因素試驗結果，以感官評分為響應值，選取對產品影響較大的3 個因素進行三因素三水平響應面試驗設計中心組合試驗，確定制作發酵香腸的最佳工藝參數。

1.3.5 pH值及色差測定

利用便攜式pH計測定香腸的pH值，利用色差儀測定香腸的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。樣品均平行測定3 次。

1.3.6 感官評價

由9 名食品專業的學生組成感官評定小組，采用10 分制對發酵香腸的形態、色澤、膻味和咀嚼性進行評分，并結合權重計算香腸的感官評分，感官評分=形態×10%+色澤×15%+膻味×60%+咀嚼性×15%。香腸的感官評價標準如表2所示。

1.4 數據處理

采用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面試驗設計與分析，采用SPSS 19.0軟件中的新復極差法對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 菌種復配比例對羊肉發酵香腸的影響

由圖1可知，菌種復配比例為1∶1時，羊肉發酵香腸的感官評分最高，為（6.67±0.44） 分，此時香腸的pH值為5.33±0.08；復配比例為1.25∶1時，香腸的感官評分最低，為（4.89±0.51） 分，此時的pH值為5.19±0.05。復配比例為1∶1的香腸，其感官評分顯著高于其他4 組香腸（P<0.05），且與復配比例為0.5∶1、1.25∶1的香腸差異極顯著（P<0.01）。這表明復配比例為1∶1時，菌種的產酸能力適當，香腸pH值降低，促使蛋白質沉淀和降解，使其滋味及膻味得到改善，這與李超等[24]的研究結果類似。

由表3可知，空白組羊肉發酵香腸的L*與復配比例為1.25∶1的樣品間差異極顯著（P<0.01），但與其他處理組均無顯著差異，復配比例為0.75∶1和1.25∶1的樣品間差異顯著（P<0.05）；空白組羊肉發酵香腸的a*和b*與其他處理組間均無顯著差異。總體而言，復配比例為1∶1的樣品色差與空白組接近，具有較好的色澤。

2.1.2 菌種接種量對羊肉發酵香腸的影響

由圖2可知，菌種接種量為2.0%時，羊肉發酵香腸的感官評分最高，為（5.77±0.49） 分，此時香腸的pH值為5.26±0.10；菌種接種量為3.0%時，香腸的感官評分最低，為（4.16±0.09） 分，此時的pH值為5.16±0.02。接種量為2.0%和2.5%的香腸，其感官評分顯著高于其他3 組香腸（P<0.05），且與接種量為3.0%的香腸差異極顯著（P<0.01）。這表明菌種添加量過大時，發酵體系中產生大量的酸導致香腸酸味過重，pH值降低，影響其形態、色澤、膻味及咀嚼性，因此感官評分降低；但菌種添加量較少可能導致發酵不充分，使發酵香腸缺乏固有的酸味且香味和膻味較重，感官品質不佳。

由表4可知，空白組羊肉發酵香腸的L*和a*與其他處理組間均無顯著差異；菌種接種量為1.5%的羊肉發酵香腸的b*顯著低于空白組（P<0.05），其他處理組香腸的b*與空白組間均無顯著差異。

2.1.3 發酵時間對羊肉發酵香腸的影響

由圖3可知，羊肉發酵香腸的pH值隨發酵時間的延長呈下降趨勢，發酵16 h時，香腸的感官評分最高，為（5.89±0.14） 分，此時香腸的pH值為5.33±0.01；發酵24 h時，香腸的感官評分最低，為（3.88±0.11） 分，此時的pH值為5.16±0.02。發酵8 h時，香腸的pH值較高，為5.83±0.03，接近于空白組（6.03±0.01），但咀嚼性無顯著變化，膻味較重；發酵24 h時，香腸的pH值過低，酸味濃郁，咀嚼性明顯提高，色澤較差。不同發酵時間香腸間的感官評分差異均不顯著（P>0.05）。綜上所述，選擇16 h為最適宜的發酵時間。endprint

由表5可知，空白組羊肉發酵香腸的L*和b*與其他處理組間均無顯著差異；發酵24 h時，香腸的a*顯著低于空白組和發酵20 h的香腸（P<0.05），但與其他處理組間均無顯著差異。

2.1.4 發酵溫度對羊肉發酵香腸的影響

由圖4可知，發酵溫度為30 ℃時，香腸的感官評分最高，為（5.91±0.15） 分，此時香腸的pH值為5.35±0.02；發酵溫度為16 ℃時，香腸的感官評分最低，為（4.38±0.19） 分，此時的pH值為5.63±0.01。不同發酵溫度下，香腸的pH值呈先下降后上升的趨勢，發酵溫度為16、44 ℃時，香腸的pH值分別為5.63±0.01和5.72±0.02，接近于空白組（5.98±0.05）。這表明發酵溫度過低或過高時菌種的生長均會受到抑制[32]，導致香腸的pH值升高，膻味明顯，感官評分降低。發酵溫度為30 ℃時，香腸的感官評分最高，且與其他4 組間差異極顯著（P<0.01）。

由表6可知，發酵溫度為44 ℃時，香腸的L*顯著高于30 ℃時（P<0.05），但發酵溫度為30 ℃或44 ℃時，香腸的L*均與其他處理組間無顯著差異；發酵溫度為44 ℃時，香腸的a*顯著高于16 ℃時（P<0.05），但發酵溫度為16 ℃或44 ℃時，香腸的a*均與其他處理組間無顯著差異；空白組香腸的b*顯著高于發酵溫度為16 ℃時（P<0.05），但與其他處理組間均無顯著差異。表明發酵溫度過低時，香腸的色差值偏低。

綜上所述，pH值為5.2～5.3時，羊肉發酵香腸的感官評分最高，此時酸度適中，口感在大多數人可接受的范圍內，且此條件下有利于RO產胞外脂肪酶促進脂肪分解和氧化，產生特殊風味物質，羊肉的膻味得到顯著降低。香腸的整體顏色偏黃少紅，這可能是由于蒸制時肌紅蛋白損失，導致香腸顏色變淺。由于不同發酵時間香腸間的感官評分差異均不顯著（P>0.05），因此選擇菌種復配比例、菌種接種量和發酵溫度3 個因素進行響應面優化試驗。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面優化試驗結果及方差分析

采用Design-Expert V8.0.6軟件對數據進行回歸分析，得到以感官評分（Y）為響應值的二次多項式回歸方程為：

Y=-22.606 56+29.669 44A+1.704 17B+0.770 10C+3.333 33AB+0.130 00AC+0.025 00BC-20.288 89A2-1.350 00B2-0.015 16C2。

由表7～8可知，各實驗組香腸的L*和a*均無顯著差異（P<0.05）；對于b*，第6組與第8組分別顯著高于第10、14、15組（P<0.05），但空白組香腸的b*與各處理組間均無顯著差異（P<0.05），這表明添加菌種后香腸的感官品質并未發生較大改變。

由表9可知，模型顯著性檢驗P<0.05，表明該模型具有統計學意義。B、AB項差異顯著（P<0.05），C、A2、C2差異極顯著（P<0.01）。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程度，即二者的差異程度，失擬項P=0.087 8>0.05，說明對模型有利，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。影響羊肉發酵香腸感官評分的因素依次為C（發酵溫度）>B（菌種接種量）>A（菌種復配比例），其中發酵溫度的影響極顯著（P<0.01），菌種接種量影響顯著（P<0.05）。矯正決定系數R2Adj=0.908 9>0.8，變異系數為1.98%，說明有9.11%的變異能由該模型解釋。

2.2.2 各因素間的交互作用分析

由圖5～7可知，菌種復配比例與發酵溫度、菌種接種量與發酵溫度對羊肉發酵香腸感官評分交互作用的響應曲面圖中的等高線接近圓形，交互作用不顯著，而菌種復配比例與菌種接種量間的交互作用顯著。

綜上所述，制作發酵羊肉香腸的最佳工藝參數為菌種復配比例（RO∶PA）1.01∶1.00（m/m）、接種量2.17%、發酵溫度31.52 ℃、發酵時間16 h，此時香腸的感官評分最高，為6.37 分。

2.2.3 驗證實驗

考慮到實際操作的可行性，將得到的最佳工藝參數條件調整為復配比例1∶1、接種量2.2%、發酵溫度32 ℃、發酵時間16 h進行驗證實驗，重復3 次。香腸的感官評分平均值為6.34 分，pH值為5.27±0.03，與模型理論值相近，說明該模型能較好地用于優化羊肉發酵香腸的制備工藝。

3 結 論

結合pH值、色差和感官評價結果探究菌種的復配比例、接種量、發酵溫度和發酵時間對羊肉發酵香腸的影響，在此基礎上利用響應面優化試驗進行進一步分析，得到加工低膻羊肉發酵香腸的最佳工藝參數為復配比例1∶1、接種量2.2%、發酵溫度32 ℃、發酵時間16 h，此時香腸的最佳感官評分為6.34 分。驗證實驗表明本研究建立的模型能較好地用于優化羊肉發酵香腸的制備工藝。pH值為5.2～5.3時，羊肉發酵香腸的感官評分較好，此時香腸的酸度值在可接受范圍內，不會由于過酸導致其他香味被掩蓋，同時能夠增加香腸的硬度和咀嚼性。對羊肉發酵香腸的色差分析表明，添加菌種后對羊肉發酵香腸的色澤影響不大，處理組與空白組間差異不顯著，香腸具有較好的感官品質。本研究結果表明，采用PA和RO復配發酵時，可以降低香腸膻味，提高香腸風味，本研究確定的制備工藝可行。

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