豬流感H3N2型病毒特異性sIgA抗體分泌規律研究

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·論著·

豬流感H3N2型病毒特異性sIgA抗體分泌規律研究

白昀1，2，舒采松3，甘源1，倪博1，2，華利忠1，吳猛1，邵國青1，馮志新1

目的研究不同品種豬應答豬流感病毒感染，呼吸道分泌特異性sIgA抗體的分泌規律，以及針對不同抗原蛋白sIgA抗體的分泌差異。方法將豬流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染試驗豬(1×107TCID50/mL，2 mL/頭)，采集感染后21 d內不同時間點的鼻拭子樣品，用M1、NS1和PB1三種重組蛋白分別建立的間接ELISA方法檢測特異性sIgA抗體，并分析其分泌規律及差異。結果顯示針對3種重組蛋白的特異性sIgA抗體在整個檢測周期內，分泌規律相似，差異無統計學意義，均表現為感染后第5 d特異性sIgA抗體水平迅速升高，第14 d達到高峰，隨后開始逐漸下降。在不同品種豬之間，僅巴馬豬分泌抗PB1蛋白的sIgA抗體在第14 d和21 d時高于二元豬(Plt;0.05)，而抗M1和抗NS1蛋白的sIgA抗體在兩種品種豬之間無統計學差異(Pgt;0.05)。結論初步探索了豬在感染豬流感病毒后特異性sIgA黏膜抗體的分泌規律，為進一步研究SIV黏膜抗體診斷試劑奠定基礎。

豬流感病毒；間接ELISA；sIgA抗體

豬流感病毒(Swine Influenza virus, SIV)為A型流感病毒，屬RNA病毒，豬感染可出現食欲下降、發熱、咳嗽、打噴嚏、流鼻涕、精神萎靡等癥狀，比較常見的亞型有H1N1和H3N2。豬是流感病毒基因重排的“混合器”和流感變異毒株產生的“孵化器”，在人類流感和其他動物流感的研究和控制中具有重要地位[1]。因此建立SIV快速、特異、敏感的檢測技術用于該病感染的實時、早期監測具有重要的公共衛生意義。本研究從機體應答病原感染的首道屏障切入，監測SIV感染后，豬呼吸道黏膜針對病毒各抗原蛋白產生特異性黏膜sIgA抗體的分泌規律，評價不同品種豬對SIV感染，以及對不同抗原蛋白產生黏膜免疫反應的差異性，為進一步研究SIV黏膜抗體診斷試劑奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1病毒、細胞與載體 豬流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)，MDCK細胞，表達載體pET-32a(+)均由江蘇省農業科學院獸醫研究所實驗室保存。

1.2試驗動物 30日齡巴馬豬5頭和48日齡二元仔豬(長白×梅山)5頭，由南京洲邦生物科技有限公司提供；豬流感血清抗體HI檢測呈陰性；自由飲水和采食。

1.3主要試劑 His標簽蛋白純化試劑盒購自MACHEREY-NAGEL公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗豬IgA購自BETHYL公司，其他化學試劑均為進口或國產分析純。

1.4.1引物設計與合成 根據GenBank數據庫中流行毒株的M1、NS1和PB1基因蛋白編碼序列片段，進行同源性比較分析，選擇保守序列設計引物。在上游引物引入EcoR I酶切位點，下游引物引入SalI或HindIII酶切位點(表1)。引物由南京金斯瑞生物科技有限責任公司合成。

表1 豬流感病毒的基因片段引物設計
Tab.1 PCR amplification primes of gene segments of SIV H3N2

目的片段Gene上游引物Forwardprimer下游引物Reverseprimer限制性內切酶Restrictionenzymes預期長度/bpExpectedlength/bpM1CCGGAATTCACGTATGTTCTCTCCCAAGCTTCACTTGAATCGEcoRIHindIII752NS1CCGGAATTCAGTTTCCAGGCCCAAGCTTTCAAACTTTTGACEcoRIHindIII690PB1GGGGAATTCATGGAACAGGAA?CAGGATCCCGTCGACTCAGTTTGTCCACCCT?TGEcoRISalI273

1.4.2病毒RNA的提取 取收獲的SIV H3N2病毒液200 μL加入900 μL病毒裂解液TRIzol Reagent，顛倒混勻，室溫裂解15 min后，加200 μL氯仿，振蕩混勻室溫靜置15 min；12 000 r/min低溫離心15 min，吸取上清與等量的異丙醇混勻，室溫放置20 min； 12 000 r/min低溫離心15 min后棄上清，用預冷的75%乙醇洗滌一次，置37 ℃溫箱烘干；用50 μL H2O溶解即為病毒RNA。

1.4.3RT-PCR擴增 以豬流感H3N2病毒RNA為模板，用Takara的M-MLV RTase反轉錄體系進行反轉錄，反應程序：42 ℃，1 h；95 ℃，5 min。反應結束后直接用產物cDNA進行PCR擴增，反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(25 pmol/μL)各1.0 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，cDNA模板2 μL，滅菌雙蒸水補至25 μL。反應條件為95 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，45～62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.4重組表達質粒的構建 將經過膠回收純化的PCR產物和pET-32a(+)表達載體分別經對應的限制性內切酶(表1)雙酶切，片段經1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后進行連接，連接產物經熱沖擊法轉化入E.coliBL21，經氨芐青霉素LB平板初篩，挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB培養基中，180 r/min振搖37 ℃培養過夜，小量抽提質粒，用對應的限制性內切酶進行雙酶切及PCR鑒定。

1.4.5重組蛋白的表達 將測序正確的工程菌按2%的量接種于含氨芐青霉素的LB 培養基中，振蕩培養至OD600值為0.4～0.6，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導表達20 h。收集菌體，對菌體蛋白進行SDS-PAGE分析并用His標簽蛋白純化試劑盒對其純化后分裝保存備用。

1.4.6重組蛋白的Western blotting分析 采用文獻[2]的方法進行重組蛋白進行Western blotting分析。重組蛋白及陰性對照(空表達質粒菌體蛋白)先經12% SDS-PAGE電泳分離，再經半干式電印跡轉移至硝酸纖維素膜上，4 ℃封閉過夜，與1∶100稀釋的豬流感高免血清反應2 h，洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG作用1 h，洗滌3次，DAB(3, 3-二氨基聯苯胺)顯色，觀察，拍照。

1.5 豬流感病毒的人工感染

政府部門應該進一步轉變發展理念，充分重視農業發展對促進本地區經濟發展的作用，通過不斷加強農田水利工程建設力度，可以在飲水和輸水環節有效控制水資源浪費與不合理的丟失。節水灌溉工程在施工建設進程中，要結合實際情況，積極應用先進的施工技術、節水材料，配置完善的輸水管道，確保工程施工質量過關，不存在開裂下滲問題。定期對節水灌溉工程開展養護管理，提高工程運行質量，使得水資源能夠得到更加高效科學的使用。

1.5.1病毒的擴增 待MDCK細胞貼壁80%～90%時棄去細胞培養液，用病毒生長液(opti-MEM，0.5 μg/mL TPCK-胰酶)洗滌2次，每次5 mL；然后每瓶細胞加入8～10 mL病毒生長液和0.2 mL病毒液(HA為log29)，CO2培養箱37 ℃培養96～120 h收獲病毒液，定期觀察病毒生長狀況。若見大量細胞細胞核碎裂則表示大部分細胞已經被病毒感染，可以收獲病毒液；將收獲的病毒液反復凍融2次，混勻分裝1 mL/支，-70 ℃存放備用。取凍存后的病毒液進行TCID50測定，按Reed-Muench兩氏法計算結果。

1.5.2人工感染 將試驗豬分為感染組和對照組，其中感染組包括3頭巴馬豬和3頭二元仔豬，對照組包括2頭巴馬豬和2頭二元仔豬。用豬流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)按1×107TCID50/mL滴鼻接種感染組試驗豬，每頭接種2 mL；用PBS滴鼻接種對照組試驗豬，每頭接種2 mL。在接種前和接種后1、3、5、7、10、14和21 d采集所有試驗豬的鼻拭子樣品，用間接ELISA方法檢測其中M1、NS1和PB1蛋白的特異性sIgA抗體。

1.6鼻拭子樣品的采集和處理 將棉簽斜著插入豬鼻孔，輕輕轉動棉簽，使豬打3～5下噴嚏，取出棉簽放入含有鼻拭子浸泡液的EP管中，2～8 ℃浸泡2 h，取出棉簽，10 000 r/min離心5 min，收集上清置—20 ℃保存備用。

1.7豬流感病毒的特異性sIgA抗體ELISA檢測

取純化后的M1、NS1和PB1融合表達蛋白分別以1 μg/mL的濃度包被酶標板，100 μL/孔；2～8 ℃過夜后棄去包被液，經PBST洗滌3次(每次5 min)后，每孔加入200 μL 5% BSA溶液，37 ℃封閉2 h；棄去封閉液，洗滌5次，每孔加入100 μL待檢鼻拭子上清樣品，37 ℃孵育2 h棄去，洗滌5次后加入1∶40 000的HRP標記羊抗豬IgA抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min后棄去；再用PBST洗滌5次，TMB避光顯色5 min，以2 mol/L硫酸終止反應，在酶標儀上測定OD450nm值。

1.8特異性sIgA抗體的分泌規律檢測與數據分析

分別以融合表達蛋白M1、NS1和PB1的特異性sIgA-ELISA抗體檢測OD450nm值繪制分泌曲線，用軟件GraphPad Prism 5進行差異性分析。

2 結 果

2.1重組融合蛋白的表達 試驗結果表明，經誘導表達，pET-32a(+)-M1、pET-32a(+)-NS1和pET-32a(+)-PB1融合蛋白在菌體上清中均存在表達。融合蛋白大小分別約為42 kDa、40 kDa和30 kDa，與理論值接近。經過HIS標簽的蛋白純化試劑盒純化后的融合蛋白濃度分別為1.373 mg/mL、1.255 mg/mL和0.430 mg/mL。(見圖1：A，B，C)

表達產物經SDS-PAGE電泳后的蛋白條帶轉移到硝酸纖維素膜上進行Western blotting免疫印跡，結果顯示，M1、NS1和PB1融合蛋白分別在40 kDa、40 kDa和30 kDa大小左右的位置出現一個清晰的特異性反應條帶。由此證明，表達的目的蛋白均能與豬流感高免血清發生特異性結合，具有反應原性，有作為檢測抗原的潛力，可以用于后續實驗研究。(見圖1：D)

2.2豬流感病毒的特異性sIgA抗體檢測結果 經M1、NS1和PB1融合表達蛋白作為包被抗原，用間接ELISA方法檢測豬鼻拭子上清中的特異性sIgA抗體，結果顯示，3種重組蛋白的特異性sIgA抗體在整個檢測周期內，除抗M1的sIgA抗體在感染后第1 d相比抗NS1和PB1的sIgA抗體低(Plt;0.05)外，其它時間段分泌規律相似，均表現為感染后第5 d開始，特異性sIgA抗體水平迅速升高，第14 d達到高峰，隨后開始逐漸下降(圖2)。

2.3巴馬豬和二元豬感染豬流感H3N2后sIgA抗體分泌差異比較 如圖3顯示，整個監測周期內，抗M1和抗NS1蛋白的sIgA抗體在兩種品種豬之間無統計學差異(Pgt;0.05)，sIgA抗體分泌水平趨勢基本一致。而巴馬豬分泌抗PB1蛋白的sIgA抗體在第14 d和第21 d時高于二元豬(Plt;0.05)。

A：SDS-PAGE analysis of recombinant protein M1; B：Identification SDS-PAGE analysis of recombinant protein NS1; C：SDS-PAGE analysis of recombinant protein PB1. 1: Uninduced pET-32a(+); 2: Induced pET-32a(+); 3: Uninduced engineering bacteria; 4: Induced engineering bacteria; 5: Supernatant of lysis after induce; 6: Sediment after induce;7: Purified protein; M: Protein Marker.D：Western-blot analysis of recombinant protein M1、NS1 and PB11: pET-32a(+)-M1-BL21; 2: pET-32a(+)-NS1-BL21; 3: pET-32a(+)-PB1-BL21.圖1 豬流感M1、NS1、PB1重組蛋白表達和鑒定Fig.1 Expression and identification of SIV recombinant proteins M1, NS1 and PB1

A：the kinetics of sIgA antibody secretions against NS1、M1 and PB1 proteinsB：the kinetics of sIgA antibody secretion against NS1 proteinC：the kinetics of sIgA antibody secretion against M1 proteinD：the kinetics of sIgA antibody secretion against PB1 protein圖2 SIV H3N2 sIgA抗體分泌規律(* Plt;0.05)Fig.2 Secretion rule of SIV H3N2 sIgA antibodies (* Plt;0.05)

A. the kinetics of sIgA antibody secretions against M1 protein between two different breeds;B. the kinetics of sIgA antibody secretions against NS1 protein between two different breeds;C. the kinetics of sIgA antibody secretions against PB1 protein between two different breeds圖3 巴馬豬和二元豬H3N2 sIgA抗體水平差異(* Plt;0.05)Fig.3 Difference of sIgA antibody levels between Bama suckling pigs and cross pigs (Meishan×Landrace) (* Plt;0.05)

3 討 論

對于以呼吸道感染為主的豬流感病毒來說，黏膜免疫系統是抵御病毒的第一道防線，它不僅具有一般性的屏障作用，還參與機體的體液免疫和細胞免疫過程[3]，是執行局部特異性免疫功能的主要場所。其中分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulinA，SIgA) 是黏膜表面最重要的抗體，它能有效地阻止病原體黏附于黏膜表面，抵御病原體的感染和入侵[4]。sIgA是機體黏膜抵抗感染的重要因素，也是多種黏膜疾病的診斷和評價的重要指標。Chicubo等[5]將霍亂毒素B亞單位(CTB)和牛血清白蛋白(BSA)混合后由鼻腔免疫小鼠，產生高水平的BSA特異性血清和黏膜IgA抗體應答；袁軍等[6]用鼠傷寒沙門氏菌SOD 滴鼻免疫小鼠，能形成較好的局部黏膜應答和全身性應答。在流感病毒方面，也有大量的報道用黏膜IgA抗體作為感染或免疫的檢測指標。Jung等[7]用TCID50為2×106劑量SIV弱毒疫苗經鼻內免疫3周齡仔豬，結果表明sIgA抗體在感染后第7 d達到最大量，第2周開始下降。劉史婷等[8]分別用流感全病毒蛋白抗原經噴鼻免疫小鼠，一周后在肺泡灌洗液中檢測到較低的特異性sIgA抗體。吳仁蔚等[9]使用流感病毒HA1和M2重組蛋白聯用免疫佐劑去免疫雞在第14 d檢測到了鼻黏膜中分泌大量的sIgA抗體。由于免疫抗原及檢測抗體的不同，所報道的流感sIgA抗體分泌情況略有不同，本研究擬在同等條件下，比較豬應答SIV感染后分泌抗SIV不同蛋白的sIgA抗體的差異，為建立SIV黏膜診斷方法中靶標抗原的篩選奠定基礎。

豬流感病毒由8個基因節段編碼10個功能蛋白，我們在本試驗中先期選擇了3個基因比較保守區段進行蛋白的表達與檢測。M1蛋白是SIV的基質蛋白，與病毒粒子裝配和RNA轉運相關，基因序列保守，具有型特異性，是流感病毒分型的依據之一，在流感病毒中含量最豐富[10]。NS1蛋白為非結構型蛋白和毒力因子，常利用其突變株制備弱毒疫苗，都具有良好的抗原性[11]。PB1蛋白形成轉錄酶和復制酶復合物，參與病毒轉錄和復制。在建立間接ELISA檢測方法時，我們統一了3種方法的反應條件，以期能在相同的條件下比較3種蛋白作為檢測原的差異。試驗結果顯示，經豬流感弱毒株A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)感染試驗豬，抗M1和抗NS1蛋白的sIgA抗體水平在感染后第1 d就顯著高于對照組的特異性sIgA抗體水平，sIgA抗體分泌高峰期主要集中于第3～10 d，大約在第14 d附近達到抗體分泌最大量，隨后逐漸下降。從試驗豬感染SIV后針對各蛋白產生的黏膜抗體差異來看，M1、NS1和PB1三種表達蛋白的sIgA抗體變化差異無統計學意義(Pgt;0.05)，其中Anti-PB1蛋白sIgA抗體水平稍低。這可能是因為擴增的PB1基因略小，表達蛋白抗原性稍差的原因。另外，Western blot試驗結果也顯示，當相同含量的M1、 NS1和PB1表達蛋白與SIV高免血清作用時，SIV高免血清與M1和NS1表達蛋白的反應條帶要比SIV高免血清與PB1表達蛋白的反應條帶明亮，也說明其抗原反應原性的差異。

本研究同時比較了不同品種豬應答SIV感染的差異性。二元豬(長白×梅山)在感染SIV后的第7 d開始出現微熱、食欲下降和輕微咳嗽及部分拉稀現象，癥狀持續2～3 d。與Blaskovic等[12]報道的通過鼻內接種斷奶仔豬，在4 d內所有試驗豬均出現典型臨床癥狀的結果推遲了3 d左右。這可能與其采用了較大的感染劑量(107.5EID50/mL，2.5 mL/鼻孔)和毒株的毒力差異有關。而巴馬豬在感染A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)后一直沒有出現典型臨床癥狀，而抗M1、NS1和PB1融合表達蛋白的sIgA抗體分泌水平基本與二元豬一致，這可能是相比于二元豬，巴馬豬具有性野早熟，適應性和抗病能力強等特點有關[13-15]。

對SIV的血清學診斷，目前所有商品化試劑盒均采用從血清中檢測IgG抗體，而這種方法存在諸多弊端，主要表現為費時間、費人工、對豬的應激性大。而檢測呼吸道黏膜抗體中的特異性sIgA只需要采集呼吸道黏液或鼻拭子樣本即可，相比血樣采集更為方便快捷，無針化采樣也適應于的動物福利的要求。本試驗對豬感染SIV后產生的特異性sIgA抗體分泌規律進行了研究，為進一步研究SIV黏膜抗體檢測試劑盒提供數據支持，同時也為豬流感抗體水平監測和豬流感防控提供一定的參考依據。

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SpecificsIgAantibodiesagainstswineinfluenzavirusH3N2infection

BAI Yun1,2, SHU Cai-song3, GAN Yuan1, NI Bo1,2, HUA Li-zhong1, WU Meng1, SHAO Guo-qing1, FENG Zhi-xin1

(1.InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofAnimalDiseasesDiagnosticandImmunology,MinistryofAgriculture,Nanjing210014，China;2.KeyLaboratoryofFoodQualityandSafetyofJiangsuProvince/StateKeyLaboratoryBreedingBase,Nanjing210014，China;3.NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

To study different breed pigs reply the swine flu virus infections, specific antibody of sIgA secretion regularity of respiratory tract and the differences of sIgA antibody according to different antigen proteins were detected. A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2) was intranasally infected pigs (1×107TCID50/mL and 2 mL/pig), and then the nasal swab samples were collected at different time points within 21 days after infection. M1, NS1 and PB1 recombinant protein, respectively, were used to establish indirect ELISA method for detecting specific antibody of sIgA, and to analyze its secretion regularity. Results displayed that there was no significant difference among three kinds of recombinant protein in the whole test, characterizing by specificity sIgA antibody levels rising rapidly after 5 infection days and reaching peak at day 14, then began to decline. Among different varieties of pigs, sIgA antibody production of PB1 protein in Obama group was significantly higher than that in binary pigs at 14th and 21st day (Plt;0.05). It had no significant difference between M1 group and the NS1 group (Pgt;0.05). This experiment preliminary explores the secretion regularity of specificity sIgA antibody after infected swine flu virus, which laid a foundation for further study of SIV mucosal antibody diagnostic reagents.

swine influenza virus; indirect ELISA; sIgA antibodies

Feng Zhi-xin, Email: fzxjaas@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.002

江蘇省農業科技自主創新資金項目(No.CX(14)2040)

馮志新，Email：fzxjaas@163.com

1.江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京 210014；

2.省部共建國家重點實驗室培育基地—江蘇省食品質量安全重點實驗室，南京 210014；

3.南京農業大學，南京 210095

S852.4

A

1002-2694(2017)11-0956-06

Supported by the Independent Innovation Fund of Jiangsu Agricultural Science and Technology(No.CX(14)2040)

2017-03-08編輯王曉歡