輸血傳播病毒PCR-DHPLC檢測技術的建立及初步應用

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·論著·

輸血傳播病毒PCR-DHPLC檢測技術的建立及初步應用

楊春華,廖蕓,羅秋紅,孫思揚,夏彪，祝建新

目的應用聚合酶鏈式反應(PCR)結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術檢測輸血傳播病毒。方法根據輸血傳播病毒的核酸序列特點設計特異性引物進行PCR，將擴增產物進行DHPLC檢測分析,以驗證方法的靈敏度、特異性、重復性，同時進行臨床檢測的初步應用。結果以乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒進行特異性試驗，無交叉反應，具有較好的特異性；重復性良好；靈敏度可達1.0×101拷貝/反應。分別應用實時熒光PCR法、普通PCR法及本文所建立的PCR-DHPLC法同時檢測32份血清樣本，發現有17份樣本實時熒光PCR陽性，17份樣本PCR-DHPLC陽性，15份普通PCR陽性。結論本文建立的PCR-DHPLC法具有特異、敏感、重復性好等優點，可用于輸血傳播病毒感染的分子流行病學調查。

輸血傳播病毒；PCR-DHPLC；實時熒光PCR

Torque Teno virus首次發現于1997年，其存在于輸血后感染肝炎(非甲-戊型)的病人血清中，因此該病毒被命名為輸血傳播病毒，曾一度被認為這是一種新型肝炎病毒，對人引起不同程度的肝損傷[1]。之后，各國科研人員陸續于在不同的哺乳動物體內發現該病毒[2]，證實其是一種人獸共患病。輸血傳播病毒可通過多種途徑傳播，在人群中感染率較高，各國學者經過大量研究證明，輸血傳播病毒像戊型肝炎病毒一樣呈全球流行分布[3]。該病毒確切的致病機理尚不明確，不過大部分研究認為其可能與肝臟疾病、肺部疾病及血液疾病相關[4]。

輸血傳播病毒是指環病毒科(Anelloviridae)的成員，無囊膜，是一種單股負鏈環狀小DNA病毒，病毒粒子為二十面體，直徑30～32 nm[1]。在氯化銫(CsCl)溶液、糞便、膽汁中的浮密度約為1.31～1.35 g/cm3，在蔗糖中的浮密度稍低，為1.26 g/mL[1-3]?；蚪M大小為2.8 kb～3.9 kb，基因組長度因病毒感染宿主不同而略有差異[5]。輸血傳播病毒變異率極高，無論是在核苷酸水平還是氨基酸水平，各毒株序列之間都有著廣泛的多樣性[6]，但其非編碼區的核酸序列卻相對保守，這些特點給研究人員提供了檢測該病毒并進行分型的可能性。

當前，對于病毒的檢測應用較為廣泛的有基于血清的酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)，基于核酸的PCR類方法。有研究人員根據輸血病毒核酸片段進行克隆并原核表達蛋白建立ELISA方法，眾所周知，ELISA簡單、成本低，適合大規模樣本檢測，但靈敏度稍差。近年來應用越來越普遍的PCR類方法逐漸成為了病毒檢測的主流技術。PCR方法因其具有快速、敏感、方便等優點，近年來發展較快，在各個領域都有著廣泛的應用，但普通PCR存在著容易出現假陽性且極易產生交叉污染等弊端[7-8]。為解決這些弊端，研究人員建立了多重PCR技術、實時熒光定量PCR (Real time PCR)，多重PCR技術是在同一反應體系中加入多對引物擴增多個基因片段，通過與標準重組質粒的對比對目的基因進行分型，從而達到檢測的目的[7]，但產物分析工作量大、耗時、耗力；在PCR技術基礎上建立的實時熒光定量PCR技術，在普通PCR反應體系中引入一條帶熒光標記的核酸探針，規避了PCR反應假陽性高的弊端，在實際工作中越來越廣泛，但仍有一定的局限性，比如帶熒光標記的探針成本高、保存時間有限等[8]。PCR結合變性高效液相色譜法是將PCR方法與變性高效液相色譜技術相結合產生的新型PCR類檢測技術，其流程是將樣品進行PCR擴增后，應用變性高效液相色譜進行擴增產物的分析，該方法能夠識別具有個別核苷酸差別的核酸序列，從而快速識別病原。本研究通過對輸血傳播病毒核酸序列的精確分析，設計引物進行擴增，結合變性高效液相色譜技術檢測擴增產物，分析方法的特異性、靈敏度，并與其他常規檢測方法進行比對，建立了輸血傳播病毒的PCR-DHPLC檢測新技術。

1 材料與方法

1.1樣品 本實驗室留存血清樣本32份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1主要儀器 全自動核酸抽提純化儀(Mag NA LC2.0，瑞士Roche公司)，基因擴增儀(Veriti，美國ABI公司)，實時熒光定量PCR擴增儀(C1000TM，美國BioRad公司)，變性高效液相色譜(簡稱DHPLC，美國Transgenomic公司)，低溫高速離心機。

1.2.2主要試劑 三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司，乙腈(色譜純)購自Thermo Fisher公司；高保真KOD-plus-DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs(東洋紡生物科技有限公司，上海)；病毒總核酸提取試劑(Mag NA Pure LC總核酸分離試劑盒)；DNA純化回收試劑盒、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、質粒小提試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。其它常規試劑均由本實驗室提供。

1.2.3引物的設計與合成 運用Primer 5.0軟件(加拿大Premier公司)分析輸血傳播病毒的核酸序列，并進行引物設計。上游引物為5′-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3′，下游引物為5′-TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3′，預期片段大小為90 bp。

上述引物以及文中用于克隆及方法驗證的引物均由生工(上海)有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1病毒核酸的提取及質粒標準模板的制備 取經過實驗室間驗證的本實驗室留存的陽性血清樣本，用核酸抽提純化系統提取總核酸，用50 μL無RNase水溶解，保存于-20 ℃冰箱備用。以提取的總核酸為模板，用引物對5′-ACCCAAATTGGAGATCAAGGTAT-3′和5′-TATCCGGTTTGCCTCGACTCTT-3′[10]進行第一輪擴增，目的片段1 563 bp，用引物對5′-CCACCAAATACCTACACGCAGTC-3′和5′-CCTTAGGGTTCCACG-CGCTAATG-3′[10]進行第二輪擴增，目的片段1 397 bp，將兩輪擴增后的PCR產物構建重組質粒并進行PCR、酶切鑒定，經鑒定正確后送寶生物公司測序。

1.3.2檢測用引物篩選與反應體系優化 從GenBank下載所有靶基因的序列，用Primer 5.0進行序列比對，基于TTV非編碼區核酸序列保守的特點，在非編碼區截取最一致的序列設計PCR-DHPLC檢測用引物對N1和N2。調整引物濃度、引物用量、Taq酶、Mg2+濃度和退火溫度等，摸索出PCR最佳反應條件和反應體系。

PCR反應體系(25 μL): 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 5 μL、DNTPs(10 mmol/L)2 μL、高保真KOD-plus-DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、10倍PCR緩沖液2 μL、加水25 μL。

PCR反應條件：94 ℃ 7 min；94 ℃ 30 s，53.5 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 10 min，反應結束后4 ℃保存反應產物。

1.3.3DHPLC分析條件 上樣量：PCR產物3 μL；DHPLC緩沖液：緩沖液A為0.1% mmol/L TEAA；緩沖液B為0.1% mmol/L TEAA；流動相：緩沖溶液A濃度為 52.2%，緩沖溶液B濃度為 47.8%；流速：0.65 mL/min；色譜柱：C18 DNA色譜柱(4.6 mm×50 mm，粒度3 μm)；柱溫：52 ℃；檢測器：熒光檢測器(光源：150W Xenon 燈；激發譜帶寬：15 nm；發射譜帶寬：15.7 nm；檢測靈敏度：波長350 nm積分3 s)。

1.3.4特異性試驗 取本實驗室留存的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)陽性血清，用核酸抽提純化系統提取總核酸，用50 μL無RNase水溶解，與1.3.1中制備的質粒標準品分別進行PCR-DHPLC檢測，以PBS為陰性對照，進行PCR-DHPLC檢測的特異性分析。

1.3.5重現性試驗 取一個經PCR、實時熒光PCR、PCR-DHPLC分析均為陽性的血清樣品，將該樣品分成6份，分別提取病毒總核酸，按照1.3.2擴增條件和1.3.3分析條件進行試驗，記錄出峰時間及峰值，驗證方法的重現性。

1.3.6靈敏度試驗 將1.3.1中制備的質粒標準品進行10倍梯度稀釋，按照1.3.2擴增條件和1.3.3分析條件進行試驗，確定能夠檢測出的模板最低拷貝數。

1.3.7驗證試驗與應用 從本實驗室留存的血清樣本32個，用自動核酸提取儀器提取總核酸，應用Real-time PCR法[11]、普通PCR法[12]及本研究建立的PCR-DHPLC法同時檢測，對比檢測結果，分析方法之間的差異。

2 結 果

2.1特異性試驗 取乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)核酸與1.3.1中制備的質粒標準品分別進行PCR擴增及DHPLC過柱分析，檢測結果證明僅TTV結果為陽性，DHPLC分析中出現擴增吸收峰；HBV、HCV和HEV未在相應的位置出現擴增吸收峰，結果均為陰性，見圖1。結果表明：本試驗設計PCR-DHPLC檢測引物可以特異性檢測TTV，與乙HBV、HCV、HEV無交叉反應。

1. TTV 2-4. 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒1: TTV; 2-4: HBV, HCV, HEV圖1 PCR-DHPLC檢測TTV的特異性Fig.1 Specialty detection of PCR-DHPLC for TTV

2.2重現性試驗 取一個經PCR、實時熒光PCR、PCR-DHPLC檢測均為陽性的血清樣品，分成6份，分別作為模板進行PCR-DHPLC，分析方法的重現性，結果見圖2，在重復樣品之間出峰時間和峰型基本重疊，陰性對照(PBS溶液)的檢測結果為陰性。

1-6. TTV 7. PBS1-6: TTV; 7: PBS圖2 PCR-DHPLC檢測 TTV的重現性Fig.2 Repeatability detection of PCR-DHPLC for TTV

2.3靈敏度試驗 將1.3.1中制備的質粒模板進行10倍梯度稀釋，稀釋后濃度分別為1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101和1拷貝/μL，以此模板進行PCR-DHPLC。結果見表1，由表中可以看出，PCR-DHPLC檢測輸血傳播病毒的靈敏度可達到10個拷貝/μL。

表2 質粒標準品PCR-DHPLC檢測結果
Tab.2 Test results of plasmid standards by PCR-DHPLC

稀釋梯度aDilutiongradienta檢測結果Testresults第1梯度(1×107拷貝/μL)+第2梯度(1×106拷貝/μL)+第3梯度(1×105拷貝/μL)+第4梯度(1×104拷貝/μL)+第5梯度(1×103拷貝/μL)+第6梯度(1×102拷貝/μL)+第7梯度(1×101拷貝/μL)+第8梯度(1拷貝/μL)-

a：各個相鄰梯度之間的稀釋倍數為10。

Note:a,The dilution ratio between each successive gradient is 10

2.4驗證試驗與應用 將32份血清樣本提取總核酸，用引物對5′-CGAATGGYWGAGTTTWYGCCGC-3′和5′-GCCCGAATTGCCCCTWGACTKCG-3′及探針FAM-CTCCGGCACCCGCCCAG-VIC進行實時熒光PCR[11]檢測、用引物對5′-GTAAGTGCACTTCCGAATGGCTGAG-3′和5′-AGCCCGAATTGCCCCTTGAC-3′以及5′-AGTTTTCCACGCCCGTCCGCAGC-3′和 5′-GCCAGTCCC-GAGCCCGAATTGCC-3′進行常規PCR[12]檢測，同時用本試驗所建立的PCR-DHPLC法進行檢測，試驗設立陽性對照(以質粒標準品)和陰性對照各2份 (以PBS溶液)，樣品編號分別為P1、P2和N1、N2。試驗結果如表3所示，常規PCR有15份樣本為TTV核酸陽性；實時熒光PCR有17份樣本TTV核酸陽性，PCR-DHPLC法檢測結果與實時熒光PCR法結果一致。

表3 PCR-DHPLC方法與常規PCR、Real-time PCR方法比較
Tab.3 Comparison of the detected results of normal PCR, real-time PCR and PCR-DHPLC

樣品Sample常規PCRNormalPCRReal?timePCRPCR?DHPLC樣品Sample常規PCRNormalPCRReal?timePCRPCR?DHPLCP1+++N1---P2+++N2---1---17---2+++18+++3+++19+++4+++20+++5---21---6---22+++7-++23---8+++24---9---25---10---26---11---27-++12+++28+++13---29---14+++30+++15+++31---16+++32+++

注:“+”代表結果陽性，“-”代表結果陰性。

Note: “+” represents positive results, “-” represents negative results

3 討 論

當前對于輸血傳播病毒的檢測主要是基于血清學診斷方法和PCR技術。血清學診斷方法指利用抗原或抗體來進行檢測的體外免疫反應。Catherine將TTV核酸序列的ORF1 C-末端序列進行原核表達構建重組蛋白，通過Western和ELISA來檢測人血清中的TTV抗體[13]。隨后，有學者將輸血傳播病毒核酸序列ORF2的部分區域進行原核表達構建重組蛋白，并以此作為抗原，建立了酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法[7]，方法簡便，但TTV的基因群和基因型眾多，各型之間交叉反應嚴重，使得ELISA未能在醫學檢驗中大范圍應用。

PCR是分子生物學中的一種常見技術，在醫學檢驗中應用很廣，尤其是在感染性疾病中病原的檢驗。變性高效液相色譜(DHPLC)是將單鏈構象多態性和變性梯度凝膠電泳相結合的基礎上發展而來的雜合雙鏈檢測技術，利用離子對反相液相色譜進行核酸片段的分離及分析，可檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。在傳染病病原的檢驗中，利用DHPLC技術的這一特點, 與PCR技術相結合應用，達到快速檢測的目的，PCR-DHPLC可同時檢測上百個樣品，可實現高通量檢測，是一種對致病微生物檢測的有效方法，并且已經在快速檢驗中應用。目前, 國內已建立了多種病原微生物的PCR-DHPLC檢測技術，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒[17]、克雷伯氏菌[18]、阪崎腸桿菌等[19]。本研究應用PCR-DHPLC技術檢測TTV，要同時考慮PCR和DHPLC兩者對檢測效果的影響。而其中應用PCR檢測TTV成功的關鍵因素是引物的設計和樣品的處理。本研究在進行引物設計時考慮到TTV具有高度基因變異性的特點[14]，未選擇以前研究人員經常選用的ORF1的N22區，而是選擇ORF2上游核酸序列保守區，該區域可以檢測TTV的不同基因群和基因型[15-16]。同時考慮到血清樣本中含有大量的雜蛋白和其他物種DNA，采用基于磁珠吸附原理的自動核酸提取設備提取核酸，從試驗結果來看，有效保證了樣品核酸的純度。DHPLC對檢測的影響因素主要是過柱條件的摸索，本研究通過大量的試驗最后獲得了最佳條件。

本研究針對輸血傳播病毒建立了特異、靈敏、高通量的PCR-DHPLC檢測方法，為該病毒的快速診斷奠定基礎。將該方法初步用于臨床樣本的檢測中，其靈敏度與Real-time PCR相當，低達10個拷貝/μL，而且能夠檢測出常規PCR檢測不出的樣本。同時，PCR-DHPLC法可以自動取樣，檢測每個樣品只需要8 min左右。DHPLC與其他檢測DNA突變方法最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。利用本研究建立的PCR-DHPLC檢測方法，可用于輸血傳播病毒的流行病學調查，同時也為該病毒在人體內的感染及分布等相關研究提供了新的技術手段。

[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophys Res Communi, 1997, 241: 92-97. DOI:10.1006/bbrc.1997.7765

[2] Zhuang H. Research status and prospect of TT virus [J].Chin J Inter Med，1999，38(11)：727-728.(in Chinese)

莊輝.TT病毒的研究現狀及展望 [J].中華內科雜志，1999，38(11)：727-728.

[3] Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T, et al. Genomic characterization of TT viruses (TTVs) in pigs, cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias[J]. J Genomic Virol, 2002, 83: 1291-1297. DOI: 10.1099/0022-1317-83-6-1291

[4] Zheng H, Ye L, Fang X, et al. Torque teno virus (SANBAN isolate) ORF2 protein suppresses NF-kappa B pathways via interaction with IkappaB kinases[J]. J Virol, 2007, 81: 1917-11924. DOI: 10.1128/JVI.01101-07

[5] Biaqini P. Classification of TTV and related viruses (Anelloviruses)[J]. Curr Topics Microbiol Immunol, 2009, 331: 21-33

[6] Okamoto H, Nishizawa T, Ukita M. A novel unenveloped DNA virus (TT virus) associated with acute and chronic non-A to G hepatitis.[J]. Intervirology,1999, 42(2-3):196-204. DOI: 24961

[7] Li Y, Xiao J. Research progress of TTV detection methods[J]. Chongqing Med, 2006, 35(18):1718-1720.(in Chinese)

李陽，肖潔. TTV 檢測方法研究進展 [J].重慶醫學, 2006, 35(18):1718-1720.

[8] Yang CH, Sun SY,Sun J, et al.Development and application of real-time PCR for detection of the Torque teno sus virus[J].Chin J Vet Sci，2017, 37(6): 999-1006. (in Chinese)

楊春華，孫思揚，孫潔,等.豬細環病毒實時熒光PCR檢測技術的建立及應用 [J]. 中國獸醫科學, 2017, 37(6): 999-1006.

[9] Kekarainen T, Lopezsoria S, Segale J. Detection of swine Torque teno virus genogroups 1 and 2 in boar sera and semen[J]. Theriogenology, 2007, 68: 966-971. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2007.07.010

[10] Wang MM, Zhou YJ, Chen ZY, et al. Identification and survey of torque teno virus in pigs in china[J]. Chin J Prevent Vet Med, 2009, 31 (10): 751-755.(in Chinese)

王礞礞, 周艷君, 陳宗艷,等. 我國豬群中TTV 的鑒定及其分子流行病學分析[J]. 中國預防獸醫學報, 2009, 31 (10): 751-755.

[11] Brassard J, Gagen M J, Houde A, et al. Development of a real-time TaqMan PCR assay for the detection of porcine and bovine Torque teno virus[J]. J Appl Microbiol, 2010, 108: 2191-2198. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2009.04624.x

[12] Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T, et al. Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TT virus demonstrated by PCR with primers from coding and noncoding regions[J]. Virology, 1999, 259(2): 428-436. DOI: 10.1006/viro.1999.9770

[13] Ott C, Duret L, Chemin I, et al. Use of a TT virus ORF1 recombinant protein to detect anti-TT virus antibodies in human sera[J]. J General Virol, 2000, 81: 2949-2953. DOI: 10.1099/0022-1317-81-12-2949

[14] Vignolini T, Macera L, Antonelli G, et al. Investigation on torquetenovirus (TTV) microRNA transcriptomeinvivo[J]. Virus Res, 2016, 124: 3457-3463. DOI: 10.1016/j.virusres.2016.03.003

[15] Focosi D, Antonelli G, Pistello M, et al. Torquetenovirus: the human virome from bench to bedside[J]. Clin Microbiol Infect, 2016, 22(7): 589-593. DOI: 10.1016/j.cmi.2016.04.007

[16] Haloschan M, Bettesch R, G?rzer I, et al. TTV DNA plasma load and its association with age, gender, and HCMV IgG serostatus in healthy adults[J]. Age (Dordr),2014, 36(5):9716-9723. DOI: 10.1007/s11357-014-9716-2[17] Yang CH,Zhu JX, Zhong Y, et al.Development and application of PCR-DHPLC assays for detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Chin J Vet Sci,2012,32(2):167-171. (in Chinese)

楊春華, 祝建新, 鐘毅, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR-DHPLC檢測新技術的建立及應用[J].中國獸醫學報，2012, 32(2):167-171.

[18] Yang CH, Cao JJ, Zhong Y, et al.Construction of identification ofKlebsiellapneumoniaein milk and diary product with PCR-DHPLC[J]. Microbiol Chin, 2010,37(12)：1805-1810. (in Chinese)

楊春華, 曹際娟, 鐘毅, 等. 乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌PCR-DHPLC檢測新技術的建立[J]. 微生物學通報, 2010,37(12)：1805-1810.

[19] Yang CH, Cao JJ, Gui JX, et al. Construction of identification ofEnterobactersakazakiiin milk and diary product with PCR-DHPLC[J]. Microbiol Chin, 2008, 35 (11): 1845-1849. (in Chinese)

楊春華, 曹際娟, 桂家祥, 等. 乳及乳制品中阪崎腸桿菌PCR-DHPLC檢測新技術的建立[J]. 微生物學通報, 2008, 35 (11): 1845-1849.

DevelopmentandpreliminaryapplicationofPCR-DHPLCassaysfordetectionoftheTorqueTenovirus

YANG Chun-hua，LIAO Yun，LUO Qiu-hong，SUN Si-yang，XIA Biao，ZHU Jian-xin

(JiangxiEntry-ExitInspectionamp;QuarantineBureau，Nanchang330002，China)

In order to identify the Torque Teno virus (TT virus), a PCR-DHPLC assay was performed in this study. Primers specific were selected according to the characteristics of TT virus nucleic acid sequence to conduct PCR, and PCR products assayed by DHPLC. We analyzed the sensitivity, specificity, repeatability of PCR-DHPLC and applied it preliminarily on clinical detection. The specific testing was performed with TTV, HBV, HCV and HEV, no cross reaction were found, and the PCR-DHPLC assays we developed had good specification and nice repeatability. Sensitivity analysis showed that the developed PCR-DHPLC assays could detect 1.0×101copy/μL. Then we detected 32 serum samples by this method, real-time PCR and normal PCR at same time. The results showed that 17 TTV positives results could be observed by PCR-DHPLC for 32 samples, it is consistent with real-time PCR test results and 15 positive by normal RT-PCR. PCR-DHPLC assays showed nice specification, sensitivity, repeatability, and could be used in epidemiological investigation.

Torque Teno virus; DHPLC; real-time PCR

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.006

江西省科技計劃項目(No.20151BBF60048)資助

中華人民共和國江西出入境檢驗檢疫局，南昌 330038

Email: ellenyung@foxmail.com

R373.2

A

1002-2694(2017)11-0979-05

Supported by the Jiangxi Science and Technology Project(No.20151BBF60048)

2017-05-12編輯王曉歡