霍亂弧菌毒力基因zot的克隆表達及生物活性

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·論著·

霍亂弧菌毒力基因zot的克隆表達及生物活性

熊長輝，楊夢，劉曉青，王鵬，徐曉倩

目的對霍亂弧菌zot毒力基因進行表達并研究重組蛋白的生物活性。方法從霍亂弧菌(Vibrio cholerae)MO45中克隆zot的全基因序列，構建其原核表達質粒pET-32a(+)-zot并轉化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，通過誘導表達和親和層析純化重組蛋白，研究zot表達蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用。結果純化蛋白的濃度為0.324 mg/mL，經Western blot驗證表達蛋白為目的蛋白，用流式細胞儀檢測經表達蛋白作用的人小腸上皮細胞顯示重組zot蛋白能引起人小腸上皮細胞的早期凋亡。結論成功克隆表達了霍亂弧菌毒力基因zot，重組蛋白能引起人小腸上皮細胞的早期凋亡。

霍亂弧菌；克隆表達；zot基因；人小腸上皮細胞

霍亂是由霍亂弧菌引起的急性水樣便為主要特征的腸道傳染病。由于僅有部分霍亂弧菌菌株可以引起霍亂流行，因此研究毒力基因分布和DNA分子特征，已成為目前學者們關注的重要課題[1]。霍亂毒力基因的分布特性為毒力因子產生水平轉移提供了環境毒力貯存庫，成為霍亂持續流行的重要因素[2]。外環境中大多數非致病性霍亂弧菌，經過復雜的進化和變異，某些特定的菌株可通過獲得毒力而有效定植在人類小腸并釋放腸毒素致病，其過程涉及多個毒力因子的協調作用[3-4]。在一定條件下，非流行株和非產毒株同樣可以感染人體引起腹瀉[5]。近年來發現，一些 O1/O139 群霍亂弧菌非產毒株也可以引起霍亂樣腹瀉[6]。zot毒力基因是檢測霍亂弧菌毒力強弱的第2個指標，其編碼的毒素增加腸黏膜通透性以及細胞間結構的耦合，本研究對霍亂弧菌zot毒力基因進行表達并研究表達蛋白對人小腸上皮細胞的作用。

1 材料與方法

1.1細胞株、菌株、質粒 人小腸粘膜上皮細胞(HUM-CELL-0032)，購自武漢原生原代生物醫藥科技有限公司；TOP10，BL21(DE3),質粒(pET-32a(+)),購自Invitrogen Biotechnology公司；O139霍亂弧菌標準株(MO45)，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所國家重點實驗室惠贈.

1.2試劑與培養基TaqDNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內切酶BamH I、XhoI(TaKaRa，Japan)；細菌DNA提取試劑盒，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，質粒抽提試劑盒(OMEGA，USA)；鼠抗-His抗體，羊抗鼠lg-G/辣根過氧化物酶標記二抗(Santa Cruze, USA)；蛋白純化Ni-IDA Resin(均購自南京凱基，中國)。

1.3主要儀器 高速低溫離心機(德國eppendorf公司)、PCR 擴增儀(美國Bio-Rad公司)、自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、電泳儀(中國上海天能科技有限公司TANONEPS-100)、超凈工作臺(中國蘇凈安泰SW-CJ-2FD)、培養箱(日本EYELA SLI-1200)、高速冷凍離心機(德國SIGMA 3-18K)、生物安全柜(美國Thermo公司)、Olympus IS71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)、流式細胞分析儀(美國BD FASCALBAR)、核酸/蛋白分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1引物設計與合成 根據NCBI數據庫公布的霍亂弧菌標株N16961(GenBank/NC_002505.1)的基因全長序列用Primer Primier 5軟件設計引物，其中，根據pET-32(a+)質粒圖譜序列的酶切圖譜，于引物的5′端分別加入BamH I(CGGGATCC)、XhoI(CCGCTCGAG)酶切位點和相應的保護堿基。引物如下：zotsense primer： 5′-CGGGATCCATGAGTATCTTTATTCATCAC-3′； zot Anti-sense primer： 5′-CCGCTCGAGTCAAAAT-ATACTATTTAGTCCTTTTTTATC-3′。

1.4.2MO45霍亂弧菌基因組DNA的提取 將霍亂弧菌MO45接種于LB肉湯，37 ℃，170 r/min培養至對數生長期，取1 mL菌液加入1.5 mL 離心管，5 000 r/min 10 min，棄上清后用細菌DNA提取試劑盒提取總DNA(方法參考OMEGA公司生產細菌DNA提取試劑盒說明書)。

1.4.3zot基因PCR擴增PCR反應體系為：10×Buffer 2.5 μL；dNTPs (每種dNTP溶液濃度為2.5 mmoL/ L) 2 μL；引物每條1 μL (終濃度1 μmol/L)；Taq酶0.5 μL (5 U/μL)；超純水16 μL；模板2 μL，總反應體積為 25.0 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min，變性模板DNA；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.4zot基因的克隆 純化后的zot基因PCR 擴增產物與載體pET32a(+) 用BamH I和XhoI進行雙酶切，雙酶切后的zot基因及載體pET32a(+)按摩爾比2∶1加入連接反應體系，T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉化預先制備的感受態細胞大腸桿菌TOP10，涂布含60 μg/mL Amp LB平板，同時將0.2mL感受態細胞涂布于不含Amp LB平板作為對照。倒置平板，37 ℃恒溫培養箱中培養12～16 h，挑取單個白色菌落接種于5 mL含Amp的LB液體培養基中，37 ℃，振蕩培養160 r/min， 6～10 h，用于提取質粒鑒定。將構建的重組質粒命名為pET-32 a(+)-zot。

1.4.5 重組質粒的鑒定

1.4.5.1重組質粒的PCR鑒定 提取的重組質粒pET-32a(+)-zot為模板，用引物zotsense primer和zotAnti-sense primer進行PCR擴增，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.5.2重組質粒的酶切鑒定 對提取的重組克隆質粒pET-32a(+)-zot用限制性核酸內切酶BamH I和XhoI進行雙酶切鑒定，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.5.3基因序列測定 將經雙酶切檢測陽性的重組質粒pET-32a(+)-zot送生工生物工程(上海)有限公司測序，采用通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG進行測序。

1.4.6重組克隆質粒pET-32a(+)-zot的原核表達及表達結果分析 將重組質粒pET-32a(+)-zot轉化預先制備的感受態細胞大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素的LB瓊脂培養基上，37 ℃培養過夜；從轉化的LB平板上挑取重組菌落，接種于的LB液體培養基(50 μg/mL的卡那霉素)，同時接種宿主菌E.coliBL21(DE3)作為對照，37 ℃振蕩(200 r/min)過夜培養；然后以50 μL轉種于5 mL LB液體培養基(100 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養至濃度OD600為0.6～0.8時，向培養菌液中加入IPTG(終濃度0.5 mmol)，分別置于15 ℃、28 ℃、37 ℃誘導表達過夜，分別取1 mL培養物，12 000 r/min離心5min，去除上清液。在每管收集的菌體中加入60 μL 1×SDS，100 ℃煮沸10 min，14 000 r/min離心5 min，上清即為蛋白，收集蛋白于-20 ℃保存，并用SDS-PAGE分析表達產物。

1.4.7表達蛋白放大培養 培養1 L的表達菌，生長至OD600=0.8時，加終濃度0.5 mmol IPTG，15 ℃誘導16 h后收集菌體，用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化表達蛋白(整個純化過程在低溫下操作，方法按南京凱基公司生產蛋白純化Ni-IDA Resin說明書操作)。

1.4.8蛋白濃度測定 吸取2 μL重組蛋白于核酸/蛋白分析儀測定其濃度。

1.4.9蛋白復性 經Ni-IDA親和層析純化分析，收集純度較高的洗脫液進行蛋白復性，并加DTT至終濃度為5 mmol后放入到處理后的透析袋中，4 ℃環境下，透析到緩沖液中進行復性，每隔1.5 h換液一次，共9 h。然后用截留分子量為10 kDa的濃縮管濃縮，濃縮結束后，離心，取上清用0.22 μm濾器過濾后分裝，并將其凍存至-80 ℃，同時做Western blot鑒定表達蛋白。

1.4.10表達蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用 待細胞在培養板底部形成完整的類似上皮樣的膜狀結構時用于試驗，使用前細胞用Hank’s緩沖液洗3次，再向每孔加入1mLDMEM，分別向12孔板中加入10 μg(30.86 μL)、20 μg (61.73 μL)、40 μg(123.46 μL)、80 μg (246.91 μL) 表達蛋白，空白孔加入等量PBS進行對照。重復1板。置37 ℃，5%的CO2培養箱中培養6h后用流式細胞儀觀察并檢測細胞凋亡情況。

2 結 果

2.1 質粒pET-32(a+)-zot的構建

2.1.1zot全基因PCR擴增 用Primer Premier 5自行設計合成的特異性引物對從霍亂弧菌M045提取總DNA進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到與預計長度1 200bp一致的PCR產物(圖1)。

2.1.2重組質粒的酶切分析 重組質粒經BamHI和XhoI雙酶切后，產生兩條帶：一條為pET-32(a+)質粒帶，另外一條約為1 200bp的zot帶(圖2)。初步說明zot基因已插入質粒pET-32(a+)載體。

圖1 zot基因擴增圖Fig.1 Amplification of zot gene

圖2 重組質粒pET-32(a+)-zot雙酶切Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid

2.1.3pET-32(a+)-zot基因測序 以pET-32(a+)載體測序通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG對重組質粒測序，采用Blast程序將測序所得序列與模板序列的zot序列比對。結果顯示，各連接點正確，插入序列與模板序列完全相符，命名為：pET-32 a (+)-zot。

2.2 重組蛋白的表達與鑒定

2.2.1SDS-PAGE分析鑒定誘導表達結果 取15 ℃、28 ℃、37 ℃誘導表達過夜的菌液各1 mL制樣，SDS-PAGE分析結果(如圖3)顯示15 ℃為最佳表達溫度。

M: Standard protein marker; 1: Uninduced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2-4: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2: incubated at 15 ℃; 3: incubated at 28 ℃; 4: incubated at 37 ℃圖3 SDS-PAGE 分析zot蛋白于BL21(DE3)表達情況Fig.3 Expression of zot fusion protein

2.2.2 親和層析柱純化表達蛋白

2.2.2.1上清通過親和層析純化表達蛋白SDS-PAGE分析 全菌采用超聲裂解后，超速離心分離，取上清用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化目標蛋白，收集洗脫組分進行SDS-PAGE分析檢測。電泳結果顯示(圖4)：上清中無明顯目標蛋白。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: Whole cell bacteria break precipitated by centrifugation; 2: Whole cell supernatants after centrifugation bacteria break; 3: Supernatant and Ni-IDA effluent; 4-8: Eluent with different chromatography column圖4 SDS-PAGE 分析zot蛋白上清純化結果Fig.4 zot protein purified from supernatant were analyzed by SDS-PAGE

2.2.2.2包涵體通過親和層析純化表達蛋白SDS-PAGE分析 取誘導表達后的菌液用1×PBS洗滌，用Buffer B(8M Urea緩沖液)溶解菌體。超速離心后取上清用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化目標蛋白，收集每個洗脫組分進行SDS-PAGE分析檢測。電泳結果顯示(圖5)：目標蛋白能與Ni-IDA很好的結合，收集Lane3-5復性。

2.3蛋白濃度測定 用核酸/蛋白分析儀測定純化的重組蛋白濃度為0.324 mg/mL。

2.4Western blot分析重組蛋白 重組蛋白經SDS-PAGE分離后電泳轉移至PVDF膜，以鼠抗His-tag抗體為一抗，羊抗鼠lg-G/辣根過氧化物酶為二抗進行Western blot分析。結果顯示在zot重組蛋白預期大小處 (約48.0kD)有一條明顯的特異性免疫反應條帶 (圖6)。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: The supernatant after centrifugation was dissolved 8M urea; 2: 8M urea were dissolved supernatant and Ni-IDA column effluent; 3-5: Eluent with different chromatography column圖5 SDS-PAGE 分析zot蛋白包涵體純化結果Fig.5 zot protein purified from inclusion bodies were analyzed by SDS-PAGE

M: Prestained protein molecular weight marker; 1: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3)圖6 表達產物的免疫印跡分析Fig.6 Western blot analysis of expression products

2.5重組蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用 在培養人小腸上皮細胞的過程中，經流式細胞儀測定，隨著重組蛋白濃度的增加，人小腸上皮細胞的早期凋亡率升高(如表1)。

表1 重組表達蛋白對人小腸上皮細胞的作用
Tab.1 The role of recombinant expression protein in human intestinal epithelial cells

蛋白濃度(μg/mL)proteinconcentration(μg/mL)細胞比例(%)cellproportion(%)正常細胞normalcells死亡細胞dyingcells早期凋亡細胞viableapoptoticcell晚期凋亡細胞non?viableapoptoticcell1087．600．1211．171．112080．840．9015．522．744076．501．0619．802．648071．081．0324．163．73PBS對照94．602．122．171．11

3 討 論

霍亂是由O1和O139群霍亂弧菌引起的以急性腹瀉為特征的腸道傳染病，霍亂弧菌主要通過腸毒素致病，霍亂弧菌在通過胃到達小腸后，粘附于小腸粘膜表面，在腸腔的堿性環境下迅速繁殖并產生霍亂毒素，毒素作用于小腸粘膜，引起腸液的大量分泌。zot基因存在于霍亂弧菌中對霍亂的致瀉起輔助作用，該基因由溶源性噬菌體CTXΦ編碼[7]。對zot亞細胞定位的研究發現[8-9]，zot蛋白定位于霍亂弧菌的細胞外膜上，為相對分子質量大約為48 kD的一條單肽鏈。Uzzau還推測，zot的N-末端部分與CTXΦ的形態形成有關，而C-末端區域可能與zot的毒素活性有關[8-9]。Waldor等[7]認為，zot發生突變時CTXΦ遺傳因子不能正確自我傳遞，因此推測zot基因產物為CTXΦ復制所必需。臨床上也認為ctxAB基因與zot基因總是共存，提出zot可能與引起嚴重腹瀉的霍亂菌株高致病力有密切關系[10]。

近些年，研究者對細菌誘導宿主細胞凋亡的機理進行了大量研究發現，細胞凋亡主要與致病菌的毒力因子有關。細菌與宿主機體相互作用的關系非常復雜，1992年首次發現細菌可以引起受感染的宿主細胞發生凋亡，細胞凋亡研究開始涉足細菌感染領域[11]。目前對于zot基因研究還有些爭論，zot基因被報道參與多種疾病的發生和發展[12]。以前認為zot基因編碼的毒素對霍亂的致瀉起輔助作用，zot毒力基因與霍亂腸毒素ctxAB能夠激發完整的細胞毒性效應[13-16]，然而zot毒力基因的毒力機制以及對人小腸上皮細胞的作用機制還未見報道，所以本文構建zot原核表達質粒pET-32a(+)-zot并轉化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，通過誘導表達和親和層析純化重組蛋白，研究zot表達蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用。通過本研究發現zot表達蛋白能夠引起人小腸上皮細胞的早期凋亡，隨著蛋白濃度的增大人小腸上皮細胞的早期凋亡程度也增大，細胞膜的通透性也增大。利用分子生物學技術研究霍亂弧菌zot毒力基因的毒力強弱及細胞表達水平，為研究菌株的毒力強弱、致病機制及引起流行的潛力，以及更深入地研究霍亂弧菌的基因組特征提供依據，為研發抗霍亂感染的安全性疫苗提供進一步指導，為江西省霍亂的流行趨勢及防控策略提供科學依據。

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CloningandexpressionofzotgeneofVibriocholeraeanditsbiologicalactivity

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qing, WANG Peng, XU Xiao-qian

(DepartmentofInfectiousDiseases，JiangxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The aim of this study is to construct the expression vector ofzotgene ofVibriocholeraeand to realize the expression ofzotgene ofVibriocholeraeinE.coliand study the biological activity of its recombinant expression product. In order to expresszotprotein inE.coli, the full-length open reading frame ofzotwas amplified by PCR from the standard strains ofVibriocholeraeMO45 genome DNA. The PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+) with restriction enaymesBamH I andXhoI. The recombinant vector pET-32a(+)-zotwas transformed intoE.coliBL21 (DE3) and expressed by IPTG induction. Thezotfusion protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting and purified by Ni-NTA affinity chromatography. After expression and purification, the recombinant expression protein played as a target for human small intestinal epithelial cells. Restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing analysis showed that thezotgene of 1 200 bp was amplified fromVibriocholeraeDNA, and the recombinant plasmid pET-32a(+)-zotwas constructed and detected its expression in prokaryotic cell successfully with SDS-PAGE and Western blot techniques. Thezotrecombinant protein was successfully expressed and purified. The purifiedzotrecombinant protein can cause human intestinal epithelial cells apoptosis.

Vibriocholerae;zotgene; cloning and expression; human intestinal epithelial cell

Xu Xiao-qian, Email: xch526@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.009

江西省科技廳項目基金(No.20151BBG70106)

徐曉倩，Email:xch526@163.com

江西省疾病預防控制中心傳染病所，南昌 330029

R378.3

A

1002-2694(2017)11-0996-06

Supported by the Science and Technology Program of Science and Technology Department of Jiangxi Province(No.20151BBG70106)

2017-02-17編輯梁小潔