HPLC法同時(shí)測(cè)定婦樂顆粒中4種成分的含量

羅曉霞，曾偲偲，祁龍凱（.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣州500；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州50006）

HPLC法同時(shí)測(cè)定婦樂顆粒中4種成分的含量

羅曉霞1＊，曾偲偲1，祁龍凱2（1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣州510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006）

目的：建立同時(shí)測(cè)定婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為月旭XB-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為270 nm（沒食子酸、丹皮酚）、325 nm（綠原酸）、230 nm（芍藥苷），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.076 2～1.524 μg（r＝0.999 7）、0.037 6～0.751 μg（r＝0.999 9）、0.030 3～0.606 μg（r＝0.999 7）、0.020 6～0.412 μg（r＝0.999 8）；定量限分別為0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤2.04%；加樣回收率分別為95.24%～100.47%（RSD＝1.59%，n＝9）、99.49%～103.70%（RSD＝2.27%，n＝9）、96.27%～101.09%（RSD＝1.94%，n＝9）、95.05%～98.90%（RSD＝1.22%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可用于婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的同時(shí)測(cè)定。

婦樂顆粒；高效液相色譜法；沒食子酸；綠原酸；芍藥苷；丹皮酚；含量

婦樂顆粒是由忍冬藤、大血藤、牡丹皮、赤芍、川楝子、熟大黃等中藥制成的復(fù)方制劑，具有清熱涼血、化瘀止痛的功效；常用于瘀熱蘊(yùn)結(jié)所致的帶下病，癥見帶下量多、色黃，小腹疼痛，慢性盆腔炎見上述證候者，為婦科常用藥[1]。目前婦樂顆粒收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]及部頒標(biāo)準(zhǔn)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第18冊(cè)）[2]；前者僅要求測(cè)定大黃中大黃素和大黃酚的含量，后者也只要求測(cè)定牡丹皮中丹皮酚的含量，兩者均缺乏對(duì)忍冬藤主要活性成分綠原酸[3]，大血藤主要活性成分沒食子酸、綠原酸等[4-5]，赤芍、牡丹皮主要活性成分沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚等的測(cè)定[6-9]。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695型HPLC儀，包括2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器（美國Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水機(jī)（德國Merck公司）。

1.2 藥品與試劑

婦樂顆粒（湖北襄陽隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：151018、160404、160820、160918，規(guī)格：6 g/袋）；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201630）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201716）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201640）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201407）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98.0%；甲醇和磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：月旭XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，5%→11%A；8～18 min，11%→13%A；18～19 min，13%→15%A；19～27 min，15%→18%A；27～28 min，18%→53%A；28～38 min，53%→60%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：270 nm（沒食子酸、丹皮酚）、325 nm（綠原酸）、230 nm（芍藥苷）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品各適量，精密稱定，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL含沒食子酸152.4 μg、綠原酸75.1 μg、芍藥苷60.6 μg、丹皮酚 41.2 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品1袋，置于研缽中，研成細(xì)粉，真空干燥過夜后，精密稱取樣品粉末1.0 g，至于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz，下同）處理20 min，放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，制備分別缺大血藤、赤芍、牡丹皮，缺忍冬藤、大血藤，缺赤芍、牡丹皮的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)為5 500，保留時(shí)間為6.948 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚的LOQ分別為 0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL，LOD 分別為0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.27%、0.85%、1.04%、0.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：151018）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.39%、1.02%、1.50%、1.85%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：151018）適量，共6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚的含量平均值分別為 3.41、1.03、0.64、0.36 mg/g，RSD 分別為1.68%、2.04%、1.81%、1.70%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：151018）適量，共9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Result of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

取4批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Result of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

筆者曾考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-0.05%磷酸溶液為本試驗(yàn)的流動(dòng)相體系對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果，當(dāng)采用甲醇-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，待測(cè)成分達(dá)到基線分離，峰形良好，且分析時(shí)間短，故選擇上述溶液為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

通過二極管陣列檢測(cè)器在210～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，沒食子酸丹皮酚在270 nm波長處、綠原酸在325 nm波長處、芍藥苷在230 nm波長處分別具有最大吸收峰，故采用波長切換技術(shù)最終確定本試驗(yàn)的檢測(cè)波長為270 nm（0～10 min，沒食子酸）、325 nm（10～20 min，綠原酸）、230 nm（20～30 min，芍藥苷）、270 nm（30～43 min，丹皮酚）。

3.3 提取溶劑的選擇

筆者曾考察了水、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取時(shí)待測(cè)成分的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇溶液3種提取溶劑的提取效果無明顯差異，但50%甲醇和75%甲醇溶液較難過濾，故采用甲醇作為提取溶劑。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可用于婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的同時(shí)測(cè)定。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：896-897.

[2]衛(wèi)生部.衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第18冊(cè)[S].WS3-B-3403-98.

[3]于曉，李松濤，劉建升，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定忍冬藤中綠原酸、馬錢苷、芍藥苷含量的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，47（9）：124-126、145.

[4]劉曉涵，祁龍凱.UPLC法同時(shí)測(cè)定大血藤中4種成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（5）：689-692.

[5]馬瑞麗，于小鳳，徐秀泉，等.大血藤的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源，2012，31（6）：1-5.

[6]陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（4）：595-602.

[7]鄧開英，朱必越，朱照靜.改良RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定牡丹皮藥材中芍藥苷和丹皮酚的含量[J].中國藥房，2013，24（15）：1406-1408.

[8]范旭航，馬天成，沈旭，等.UPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位牡丹皮中6種活性成分[J].中成藥，2012，34（2）：317-320.

[9]劉杰，陳琳，范彩榮，等.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的白芍和赤芍主要成分定性定量研究[J].中國中藥雜志，2015，40（9）：1762-1770.

Simultaneous Determination of 4 Components in Fule Granules by HPLC

LUO Xiaoxia1，ZENG Caicai1，QI Longkai2（1.Dept.of Pharmacy，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou 510120，China；2.College of TCM，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol in Fule granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 270 nm（gallic acid，paeonol），325 nm（chlorogenic acid）and 230 nm（paeoniflorin）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol were 0.076 2-1.524 μg（r＝0.999 7），0.037 6-0.751 μg（r＝0.999 9），0.030 3-0.606 μg（r＝0.999 7），0.020 6-0.412 μg（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantification were 0.353，0.276，0.421，0.540 μg/mL，and the limits of detection were 0.121，0.104，0.148，0.186 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all no more than 2.04%.The recoveries were 95.24%-100.47%（RSD＝1.59%，n＝9），99.49%-103.70%（RSD＝2.27%，n＝9），96.27%-101.09%（RSD＝1.94%，n＝9），95.05%-98.89%（RSD＝1.22%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of gallic acid，chlorogenic acid，paeoniflorin and paeonol in Fule granules.

Fule granules；HPLC；Gallic acid；Chlorogenic acid；Paeoniflorin；Paeonol；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4732-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.34

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：Yuerluo@qq.com

（編輯：劉 柳）

2017-06-07

2017-08-12）