擬南芥熱激因子AtHsfA1a在低溫脅迫下對細胞程序性死亡中Caspase—3活性的影響

郭麗紅　徐婭　郤秋霞　李念　檀文濤　張學蘭

摘要：為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細胞程序性死亡（programmed cell death，簡稱PCD）中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific protease，簡稱Caspase）活性的影響，進一步確定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與低溫脅迫中PCD的關系。以熱激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的擬南芥為材料，首先獲得單細胞，于4 ℃處理1 h后，測定熱激因子AtHsfA1a的表達量，發現基因沉默型中AtHsfA1a的表達量低于野生型。接著用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI）進行染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態，結果表明，低溫脅迫后野生型未出現凋亡小體，基因沉默型的細胞出現了細胞凋亡小體。最后根據熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度測定Caspase-3活性，結果發現，低溫處理后的擬南芥Caspase-3活性明顯增強，而]AtHsfA1a基因沉默型擬南芥Caspase-3活性比野生型擬南芥的高，說明低溫脅迫下擬南芥AtHsfA1a能夠抑制Caspase-3蛋白酶的活性。研究結果初步表明，在低溫脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a可以通過抑制 Caspase-3 蛋白酶的活性而對細胞程序性死亡有一定的抑制作用，這對于揭示植物耐逆境反應機制具有重要意義。

關鍵詞：擬南芥；熱激因子AtHsfA1a；低溫脅迫；細胞程序性死亡；Caspase-3活性

中圖分類號： Q94578文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）21-0024-03[HS）][HT9SS]

收稿日期：2016-06-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260061、31060039）；云南省高校特色生物資源開發與利用重點實驗室項目（編號：GXZD201601）。

作者簡介：郭麗紅（1971—），女，云南大理人，博士，教授，主要從事植物生理學與分子生物學研究。E-mail：guolihong7122@163com。

在自然界中，低溫是影響植物生長發育、制約農作物增產增收的主要因子。植物細胞在遭受各種低溫脅迫時，轉錄因子調控一系列防御基因的表達，啟動相應的耐低溫生理、生化途徑，從而獲得耐低溫能力。植物熱激因子（heat shock transcription factor，簡稱HSF）是真核生物中結構和功能上相對保守的一類轉錄因子家族，多個HSFs家族成員形成了復雜的分子網絡[1-2]。根據寡聚域的區別，HSF可分為A、B、C三類，A類HSF（HsfA）主要負責基因表達的調控[3-4]。擬南芥中存在21個HSFs，研究表明，AtHsfA1a是HsfA類中參與逆境調控的重要轉錄因子[5-7]。研究發現，逆境脅迫可以誘導植物細胞程序性死亡（programmed cell death，簡稱PCD），PCD是一個由基因決定的自動結束生命的過程，表現出特殊的細胞形態特征，具有復雜的生化基礎[8-10]。關于HSF對PCD的調控，在動物中獲得了一些有價值的研究成果，研究發現哺乳動物HSF1誘導熱激蛋白的表達可以保護細胞免受脅迫引起的細胞凋亡[11]，HSF1可以調控干細胞中與PCD相關基因FasL的表達[12]，也可以調控腸癌細胞的抗細胞凋亡基因[WTBX][STBX]BAG3和XAF-1的表達[13-14]。但是對于植物中HSF與PCD的直接關系研究相對較少，尚不清楚熱激因子AtHsfA1a是否調控PCD以及如何調控PCD。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，簡稱Caspase）家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3是凋亡信號通路中一個重要的蛋白酶，也是凋亡的關鍵執行分子[15-16]。關于Caspase-3能否在AtHsfA1a調控PCD的過程中起作用值得研究。為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細胞程序性死亡中Caspase-3的影響，以熱激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的擬南芥為試驗材料，在低溫處理后，測定熱激因子AtHsfA1a的表達量并觀察細胞形態，分析擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下Caspase-3活性的影響。本試驗旨在鑒定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與低溫脅迫下PCD的關系，對于揭示熱激因子AtHsfA1a的作用機制和PCD的調控機制均具有重要的意義。

1材料與方法

11材料

擬南芥哥倫比亞種（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia）；]AtHsfA1a基因沉默的轉基因擬南芥植株（ST）、野生型擬南芥植株（WT），由云南省高校特色生物資源開發與利用重點實驗室提供。

12方法

121擬南芥]AtHsfA1a不同基因型單細胞獲得及低溫處理用01%HgCl2和70%乙醇對擬南芥種子進行滅菌處理后，將種子接種于MS固體培養基中，置于25 ℃光照下萌發。待種子長出3或4張真葉時，將小苗移至土壤中，用保鮮膜遮蓋，遮陰恒溫培養3 d后去膜，4周后取不同基因型擬南芥葉片，用無菌水沖洗干凈后依次用75%乙醇、01% HgCl2滅菌。將滅菌的擬南芥葉片切成邊長為05 mm的正方形葉片，將葉片置于愈傷組織誘導培養基（MS培養基中添加 3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）上，置于25 ℃溫度條件下光照培養（16 000 lx），誘導愈傷組織。將疏松透明的愈傷組織放入液體培養基（以MS培養基為基本培養基，添加3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）中。在120～140 rmin、（25±05） ℃的搖床中進行振蕩懸浮培養，每周更換新鮮液體培養基2次，每次更換13體積，直至獲得分散的單個懸浮細胞。將單細胞培養液置于4 ℃低溫處理1 h，以25 ℃為對照溫度。endprint

122擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細胞低溫處理后AtHsfA1a表達量的測定參照Guo等的方法[17]。總RNA提取采用QIAGEN RNA提取試劑盒，采用15%瓊脂糖凝膠電泳（120 V）15 min，在凝膠成像儀下檢測總RNA。按照下列配方反轉錄合成cDNA：RNAmRNA（8 μL）、Transcript TmRTRI Enzyme Mix（1 μL）、Anehored Oligo（dT）18（1 μL）、2×TS Reaction Mix（10 μL），加RNase-free water 定容至 20 μL，輕輕混勻后，在85 ℃水浴鍋中加熱5 min以失活Trans ScriptTMRT。以反轉錄產物作為PCR模板，[WTBX][STBX]Actin2作為內參，擴增引物如下：[WTBX][STBX]AtHsfA1a-F，5′-AATGGGCTTGGAGAG [JP3]ATGAAT-3′，[WTBX][STBX]AtHsfA1a-R，5′-AATGCCGAGACTTCCCAGAT-3′；[WTBX][STBX]Actin2-F，5′-TTGTCACACACAAGTGCATCAT-3′，[WTBX][STBX]Actin2-R，5′-AAGCTGGGGTTTTATGAATGG-3′。PCR擴[JP3]增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增后的產物用15%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

123擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細胞程序性死亡的形態特征觀察取于4 ℃處理1 h的2種類型擬南芥單細胞，涂在載玻片上，用01%多聚甲醛固定30 min，再用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）洗5 min。將制備好的裝片用5 mgL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI）染液染色10 min，用蓋玻片封片，避光將制作好的裝片放到載物臺上，用熒光正置顯微鏡在359 nm激發光下觀察細胞的形態學變化。

124擬南芥]AtHsfA1a不同基因型細胞中Caspase-3活性的檢測將細胞在液氮中研磨后，懸浮在裂解液[含 50 mmolL pH值80的Tris-HCl，15 mmolL NaCl，1%Triton X-100，01 mgL苯甲基磺酰氟（PMSF）]中，在冰上輕輕搖動培養30 min后，于4 ℃、12 000 g離心5 min，取上清液備用。蛋白濃度測定采用Bradford的方法[18]。Caspase-3的活性通過測定熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度來衡量[以單位時間、單位質量蛋白的對硝基苯胺（p-nitroaniline，簡稱pNA）的數量表示]，在405 nm處測定自由熒光pNA的吸光度[19]。

2結果與分析

21擬南芥AtHsfA1a不同基因型細胞中低溫脅迫后[WTBX][STBX]AtHsfA1a的表達情況[HT]

以]AtHsfA1a基因沉默的轉基因植株和野生型植株為試驗材料，擬南芥]AtHsfA1a基因沉默植株是本試驗前期通過RNA干擾技術獲得內源]AtHsfA1a基因沉默的轉基因擬南芥植株。由于RNA干擾，該植株]AtHsfA1a基因不能正常表達。為了探究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細胞程序性死亡中Caspase-3活性的影響，首先必須研究在低溫環境下]AtHsfA1a基因沉默的轉基因植株和野生型中]AtHsfA1a基因的表達情況。將2種基因型細胞在4 ℃低溫處理1 h，以 25 ℃ 為對照溫度，然后提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA，再用[WTBX][STBX]AtHsfA1a引物進行PCR擴增。由圖1可以看出，在25 ℃下野生型的AtHsfA1a條帶比基因沉默型的亮；在4 ℃下，2種基因型的AtHsfA1a條帶亮度明顯增強，但野生型的AtHsfA1a條帶也明顯比基因沉默型的亮，說明基因沉默型的熱激因子的AtHsfA1a由于RNA干擾無法正常表達。以Actin2為對照，計算相對表達量，從圖2中可以看出，在同一溫度下，野生型中AtHsfA1a的表達量高于基因沉默型，經過低溫脅迫處理后的野生型中的表達量增量較多，而基因沉默型中的表達量雖有所增加，但增加量相對較少。

22擬南芥AtHsfA1a不同基因型細胞中低溫脅迫后細胞程序性死亡的形態特征[HT]

將熱激因子AtHsfA1a不同基因型的細胞置于4 ℃低溫處理1 h后，通過DAPI染色后封片，在熒光顯微鏡下觀察。從圖3中可以看出，野生型擬南芥的單細胞在低溫脅迫下，細胞核開始發生變化，但未出現凋亡小體，基因沉默型的細胞出現了細胞凋亡小體，細胞質的濃縮現象更突出。細胞程序性死亡凋亡小體出現在熱激因子AtHsfA1a表達量低的基因沉默型植株中，初步推測低溫脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a對細胞程序性死亡有一定的抑制作用。

23擬南芥熱激因子AtHsfA1a低溫脅迫后對Caspase-3活性的影響[HT]

以熱激因子AtHsfA1a不同基因型的細胞為試驗材料，低溫脅迫處理后，根據熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度測定Caspase-3活性。從圖4中可以看出，與25 ℃處理相比，經過低溫4 ℃處理1h后，野生型擬南芥和沉默型擬南芥Caspase-3活性均明顯增強，但基因沉默型擬南芥Caspase-3活性高于野生型擬南芥的Caspase-3活性，這與圖2的熱激因子AtHsfA1a的表達量呈負相關，說明擬南芥熱激因子AtHsfA1a在低溫脅迫下對Caspase-3活性有抑制作用。

3討論與結論

近年來的研究發現，在正常環境中，HSF主要以無活性單體的形式存在，受到逆境脅迫時，單體向有活性的同源三聚體形式轉變，三聚體能與熱激元件結合，從而導致抗逆基因的表達[3-5]。本研究采用]AtHsfA1a基因沉默的轉基因植株為試驗材料，該植株是利用RNA干擾技術將2個反向重復的[WTBX][STBX] C-AtHsfA1a 序列克隆到植物發夾RNA表達載體中，從而篩選出穩定、有效的內源]AtHsfA1a基因沉默的轉基因擬南芥植株。通過RT-PCR方法檢測低溫脅迫后熱激因子AtHsfA1a的表達情況，結果表明，盡管低溫處理后不同基因型熱激因子AtHsfA1a的表達量均會增加，但是與野生型相比，]AtHsfA1a基因沉默型植株在低溫脅迫后表達量明顯較少。表達量的減少勢必會影響熱激因子AtHsfA1a執行生理功能。植物在逆境中會發生細胞程序性死亡，本研究結果也表明，低溫脅迫后野生型細胞核開始發生變化，但未出現凋亡小體，而基因沉默型的細胞出現了細胞凋亡小體，細胞程序性死亡凋亡小體出現在熱激因子AtHsfA1a表達量低的基因沉默型植株中，表明冷脅迫下擬南芥熱激因子AtHsfA1a對細胞程序性死亡有一定的抑制作用。至于擬南芥熱激因子AtHsfA1a是如何抑制細胞程序性死亡的，涉及復雜的生化基礎。研究發現各種富含半胱氨酸Caspase被激活后，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割，從而造成細胞程序性死亡，其中 Caspase-3是凋亡信號通路中一個重要的蛋白酶，也是凋亡的關鍵執行分子[12]。Caspase-3正常以酶原（32 ku）的形式存在于胞漿中，沒有活性。在凋亡的早期階段，Caspase-3被激活；活化的Caspase-3由2個大亞基（17 ku）和2個小亞基（12 ku）組成，裂解相應的胞漿、胞核底物，最終導致細胞凋亡[13]。關于熱激因子AtHsfA1a抑制PCD是否與 Caspase-3活性有關需要深入研究。為了研究擬南芥熱激因子AtHsfA1a對低溫脅迫下細胞程序性死亡中Caspase-3活性的影響，探究擬南芥熱激因子AtHsfA1a與逆境中PCD的關系，本試驗將AtHsfA1a不同基因型（野生型、沉默型）的擬南芥幼苗于4 ℃低溫處理1h后，在用RT-PCR技術分析擬南芥熱激因子AtHsfA1a表達量和觀察細胞形態的基礎上，根據熒光底物Ac-DEVD-pNA的斷裂程度，測定Caspase-3的活性，經過低溫處理后的擬南芥類Caspase-3活性明顯增強，說明低溫可以誘導細胞程序性死亡。而結果也顯示，基因沉默型擬南芥類Caspase-3活性相對較高，野生型擬南芥類Caspase-3活性相對較低，與熱激因子AtHsfA1a的表達量呈負相關，說明低溫脅迫下熱激因子AtHsfA1a抑制擬南芥Caspase-3蛋白酶的活性。至于熱激因子AtHsfA1a影響Caspase-3蛋白酶活性是通過調控細胞程序性死亡其他基因的表達來調控Caspase-3蛋白酶活性大小，還是直接調控Caspase-3蛋白酶表達，還需要通過染色質免疫沉淀分析、凝膠阻滯電泳及酵母雙雜交等方法進行進一步研究。本研究初步表明，熱激因子AtHsfA1a可能通過抑制類Caspase-3蛋白酶的活性而對細胞程序性死亡有一定的抑制作用，從而保護植物免受逆境的傷害。從分子水平鑒定擬南芥熱激因子AtHsfA1a與逆境中PCD關鍵基因[WTBX][STBX]Caspase-3的關系，對于揭示植物抗逆機制具有重要的意義。endprint

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