中國美利奴羊TLR4基因多態(tài)性的PCR—SSCP鑒定

王會敏　羅成　齊江姣　王元元　李村院　高劍峰

摘要：為了研究中國美利奴羊TOLL樣受體（TLR4）基因第3外顯子上的單核苷酸多態(tài)性（SNPS）和單氨基酸多態(tài)性（SAPS）。利用生物信息學(xué)方法對NCBI上公布的有關(guān)綿羊的TLR4序列進(jìn)行下載并用SeqMan對下載的綿羊TLR4基因外顯子進(jìn)行多態(tài)性比對分析，然后采用PCR-SSCP并結(jié)合測序的方法對119只中國美利奴羊TLR4基因的外顯子3的擴(kuò)增片段進(jìn)行分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，在中國美利奴羊第3外顯子1 180 bp處有1個突變位點，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點為有義突變。在1 537 bp處也有1個突變位點，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T），在TLR4第3外顯子的其他位點并沒有SNPS位點，說明中國美利奴羊TLR4基因上的第3外顯子區(qū)域有2個多態(tài)位點。

關(guān)鍵詞：中國美利奴羊；TLR4基因；多態(tài)性；生物信息學(xué)方法；PCR-SSCP；外顯子；突變位點

中圖分類號： S8268+62文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0027-05

收稿日期：2016-06-30

基金項目：國家“973”計劃（編號：2010CB530200）。

作者簡介：王會敏（1990—），女，碩士研究生，研究方向為動物基因工程。

通信作者：高劍峰，博士，教授，研究方向為動物功能基因組學(xué)與分子免疫學(xué)。E-mail：jianfengg@shuzueducn。

Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）最早是從果蠅體內(nèi)分離得到的，它對果蠅腹背側(cè)體軸的發(fā)展方向和非特異性免疫反應(yīng)起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人體分離出果蠅TLR的同系物，從而發(fā)現(xiàn)人類及哺乳動物存在一個TLR家族，它是一種重要的模式識別受體，能識別微生物的多種成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，從而激活非特異性和特異性免疫反應(yīng)，抵抗細(xì)菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10個TLR成員，它們分別在不同的免疫應(yīng)答機(jī)制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多態(tài)性可以使機(jī)體對疾病的遺傳具有易感性和抗性，基因TLR位點多態(tài)性與炎性應(yīng)答損傷和感染性疾病的遺傳易感性相關(guān)[3-5]。TOLL樣受體4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞內(nèi)區(qū)、富含亮氨酸的胞外區(qū)和跨膜區(qū)[6]。TLR4廣泛表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞表面，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于TLR4的多態(tài)主要集中在人和小鼠的研究上。例如，劉繼峰等對TLR2、TLR4基因多態(tài)性[CM（25]與尖銳濕疣患者易感性及復(fù)發(fā)性的相關(guān)性進(jìn)行研究[7]。韓璐等TLR4基因的多態(tài)性與胃癌的關(guān)系[8]。趙剛等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液組胺濃度、TLR4基因多態(tài)性與抗蜱能力的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，B等位基因可作為婆羅門雜交牛抗蜱選育的分子標(biāo)記[9]。呂偉麗等用 PCR-SSCP 方法檢測這4 種綿羊第3外顯子的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，白薩福克羊、小尾寒羊和特克塞爾羊處于高度多態(tài)，而永昌羊處于中度多態(tài)[10]。鮮有關(guān)于綿羊TLR4基因的多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)的報道。中國美利奴綿羊是新疆綿羊毛肉兼用細(xì)毛羊品種的一種，具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，包括軍墾型、科爾泌型、吉林型3種類型[11]。本試驗以中國美利奴羊為材料，利用生物信息學(xué)方法對NCBI上公布的有關(guān)綿羊的TLR4序列進(jìn)行下載并用SeqMan對下載的綿羊TLR4基因外顯子進(jìn)行多態(tài)性比對分析，然后采用 PCR-SSCP技術(shù)并結(jié)合克隆測序的方法來檢測中國美利奴羊TLR4基因的多態(tài)位點，從而為進(jìn)一步研究標(biāo)記輔助育種、培育中國美利奴綿羊抗性新品系奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料

111試驗動物試驗中的119只中國美利奴羊來自新疆建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)九師第170團(tuán)，取每只試驗羊的頸靜脈血于5 mL肝素鈉抗凝管中，放入車載冰箱里帶回實驗室，然后放入 -40 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

112主要試劑血液基因組試劑盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過硫酸銨和去離子甲酰胺，均購自北京索萊寶科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和 TEMED，均購自美國 Am-resco公司；親和硅烷、剝離硅烷，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其他試劑均由實驗室配制。

12方法

121生物信息學(xué)分析從NCBI上通過綿羊基因mRNA序列（登錄號：XM_012111214 ）下載綿羊的編碼區(qū)，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251&report=gene_table將TLR4基因的編碼區(qū)進(jìn)行外顯子的劃分。

122利用生物信息學(xué)方法對NCBI上公布的有關(guān)綿羊TLR4所有的mRNA序列進(jìn)行下載并用SeqMan軟件對下載的綿羊TLR4基因外顯子的序列進(jìn)行多態(tài)性比對分析找出位于其品種羊的多態(tài)位點并分析。

123基因組DNA的提取[JP3]采用血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，用紫外分光光度計估計濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA濃度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

124PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)NCBI上公布的綿羊TLR4基因的序列（登錄號：XM_012111214 ）利用Primer Premier 50設(shè)計擴(kuò)增TLR4第3外顯子的特異性引物，引物信息見表1。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

TLR4基因的第3外顯子（即表1中）的所有片段的反應(yīng)總體系都為20 μL：ddH2O 8 μL，Tap PCR MasterMix 8 μL，DNA模板20 μL，上、下引物（10 μmolL）各10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃變性1 min，72 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)；72 ℃總延伸10 s；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠系統(tǒng)照相檢測擴(kuò)增結(jié)果。endprint

125PCR-SSCP檢測和測序分析

分別取45 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與90 μL的變性上樣緩沖液（025%二甲苯菁、005%溴酚藍(lán)、95%去離子甲酰胺、pH值為80 的EDTA）離心混勻，于PCR儀上98 ℃變性10 min，然后取出立即冰浴 5 min。快速在預(yù)先制備好的10%非變性聚丙烯酰氨凝膠（90 mL 10×TTE，225 mL 40%丙烯酰胺，580 mL ddH2O，最后同時加入4500、700 μL TEMED）上點樣并連接至冷凝循環(huán)系統(tǒng)，9 ℃、300 V預(yù)電泳15 min，45 mA電泳5 h，結(jié)束后采用銀染色法顯色并在X光上分析帶型且拍照保存。

選擇有不同帶型樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測符合測序要求后，送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測通測序，然后用SeqMan和GenDoc等軟件對測序序列進(jìn)行比對分析。

2結(jié)果與分析

21用生物信息學(xué)對綿羊TLR4基因編碼區(qū)外顯子的劃分[HT]

TLR4基因的編碼區(qū)分為3個外顯子：外顯子1是從TLR4編碼區(qū)序列的1～90長93 bp、外顯子2是從TLR4編碼區(qū)序列的91～257長167 bp、外顯子3為TLR4編碼區(qū)序列的258～2 523長2 266 bp（圖1）。

22不同品種綿羊TLR4基因外顯子3的生物信息學(xué)分析[HT]

用SeqMan軟件對從NCBI上下載的所有有關(guān)綿羊TLR4的mRNA序列進(jìn)行多態(tài)性比對分析發(fā)現(xiàn)，其多態(tài)位點主要集中位于TLR4基因第3外顯子的316～532、530～753、821～1 066、1 093～1 370、1 382～1 634、1 867～2 098 bp之間。其中，316～532 bp 之間共有9個SNP位點，含有A→C、T→C的突變各2個，A→G突變4個，G→C突變1個；530～753 bp之間共有8個SNP位點，含有C→T、A→G、A→C的突變各2個，G→C、T→C的突變各1個；821～1 066 bp之間共有23個SNP位點，含有A→G突變6個，G→A突變4個、G→T突變3個，T→C、C→T突變各2個，C→A、G→C、T→A、C→G、A→T、T→CG 各1個； 1 093～1 370 bp之間共有20個SNP位點，

含有C→T突變6個、G→A突變5個、 A→G突變5個、G→C、G→T、A→T、C→G的突變各1個；1 382～1 634 bp之間共有11個SNP位點，含有T→C突變2個、G→A突變5個、A→C突變1個、C→T突變2個、A→G突變1個；1 867～2 098 bp之間共有9個SNP位點，其中C→A突變1個、C→T突變2個、G→A突變3個、A→G突變3個。G→C、G→T各占所有突變位點的5%、A→T、C→G、C→A各占所有突變位點的250%、T→A、T→CG各占所有突變位點的125%、T→C占所有突變位點的875%、C→T占所有突變位點的1750%、A→G占所有突變位點的2625%、A→C占所有突變點的625%、G→A占所有突變位點的2125%。從上述統(tǒng)計結(jié)果來看，G與A（即為轉(zhuǎn)換位點）之間的突變在綿羊的TLR4的第3外顯子中比較常見，C→T突變次之，且有1個T→CG即簡約信息位點。綿羊TLR4基因第3外顯子的所有突變位點中既有轉(zhuǎn)換位點又有顛換位點，且轉(zhuǎn)換位點多于顛換位點。可能是由于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的差異，越是結(jié)構(gòu)相似的堿基越易相互替換。

23基因組DNA電泳圖檢測結(jié)果

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖2可見，電泳條帶清晰單一，可以進(jìn)行下步試驗。

24綿羊TLR4基因第3外顯子片段的PCR擴(kuò)增[HT]

由圖3可知，綿羊TLR4基因第3外顯子TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）的PCR擴(kuò)增，上述序列的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測與目的片段大小一致且?guī)颓逦o雜帶符合SSCP試驗要求。

25PCR-SSCP檢測

對綿羊TLR4基因第3外顯子的TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP試驗檢測，在擴(kuò)增片段中都沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性都為AA[CM（245]基因型（圖4-A至圖4-D）；TLR4（1 093～1 370）與

[FK（W13][TPWHM222tif]

TLR4（1 382～1 634）PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行SSCP試驗，在擴(kuò)增產(chǎn)物片段中發(fā)現(xiàn)不同的帶型，即TLR4（1 093～1 370）有AA、AB、BB等3 種基因型TLR4（1 382～1 634）有2種基因型AA、AB（圖4-E至圖4-F）。

26綿羊TLR4第3外顯子的TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）序列的測序結(jié)果[HT]

通過測序和SeqMan軟件的比對分析（圖5至圖6）可知，在TLR4基因第3外顯子的1 180 bp處有1個突變位點，由G突變成T，氨基酸由天冬氨酸（D）變成酪氨酸（Y），即該位點為有義突變。在TLR4基因第3外顯子的1 537 bp處也有1個突變位點，即由G突變成了A，氨基酸由丙氨酸（A）變成蘇氨酸（T）該位點為有義突變。

3討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外學(xué)者在人TOLL樣受體的多態(tài)性方面研究得比較廣泛。Mu等發(fā)現(xiàn)，人的TLR9-1486TC和2848GA 的基因型能增加患宮頸癌的風(fēng)險[12]。吳春香等采用PCR-FLRP技術(shù)對110例AAV患者及101例健康的成人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TLR4-1837AG基因型影響AAV患者的血紅蛋白、endprint

[血尿發(fā)生率、血沉水平、C反應(yīng)蛋白[13]。林茂虎等用iMLDR 技術(shù)對 423 例鮑曼不動桿菌感染病人和 385 例非感染病人的血標(biāo)本進(jìn)行 TLR4基因的多態(tài)性檢測，證明位于啟動子區(qū)域的TLR4單倍型 GCG與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性[14]。王永堂等用PCR-RFLP技術(shù)對正常漢族人群樣本TLR4啟動子區(qū) -2 242、-1 892 和 -1 837 這 3 個多態(tài)位點進(jìn)行基因分型，證明中國漢族人群中位于TLR4基因啟動子區(qū)的 -2 242 位點可能是膿毒癥關(guān)聯(lián)分析重要的遺傳標(biāo)記[15]。從以上可知，TLR4基因的多態(tài)性在人方面研究得比較成熟，但其在家畜方面研究得比較少，有待進(jìn)一步研究，TLR4基因具有SNPs的免疫基因，而基因多態(tài)性能夠與生產(chǎn)性能上的一些經(jīng)濟(jì)性狀聯(lián)系起來，為動物遺傳育種提供一定的依據(jù)。同時，TLR基因多態(tài)性與動物的免疫力及疾病的易感性和抗病性也有很大關(guān)聯(lián)性。綿羊是這個星球上最有經(jīng)濟(jì)價值的家養(yǎng)動物之一，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要的地位。羊肉蛋白質(zhì)含量高、膽固醇含量低、營養(yǎng)豐富，是世界上很多人喜愛的食物[16]，2012年中國的出口羊肉產(chǎn)量為401萬t，占世界的32%。優(yōu)質(zhì)羊毛是毛紡工業(yè)的重要原材料，此外綿羊也是重要的科學(xué)研究模式動物。因此，對于選育具有優(yōu)良品種和抗性新品系的綿羊尤為重要，必須從多個方面考慮、創(chuàng)新、發(fā)現(xiàn)新的有關(guān)提高綿羊經(jīng)濟(jì)價值領(lǐng)域。在本試驗中，將中國美利奴羊的TLR4編碼基因的第3外顯子分成7個在300 bp以下的片段，分別為TLR4（316～532）、TLR4（530～753）、TLR4（821～1 066）、TLR4（1 093～1 370）、TLR4（1 382～1 634）、TLR4（1 867～2 098）來檢測TLR4編碼基因第3外顯子在中國美利奴羊上的多態(tài)性，因為TLR4編碼基因的第3外顯子總長為2 266 bp，而做SSCP試驗DND片段總長最好在 300 bp 以下，這樣檢測到目的DNA片段多態(tài)性的靈敏度才高[17]。對以上TLR4編碼基因的7個片段進(jìn)行多態(tài)檢測，除TLR4（1 093～1 370）與TLR4（1 382～1 634）片段中各有1個有義突變外，其他片段都沒有多態(tài)，這種現(xiàn)象可能是因為中國美利奴羊TLR4基因在所檢測的區(qū)域是比較保守的，由此也可得出中國美利奴羊具有多態(tài)位點的改變。有關(guān)更多的突變基因可能位于中國美利奴羊TLR4基因的其他外顯子或啟動子區(qū)、調(diào)控區(qū)域，還有可能是檢測樣本量和羊所選地區(qū)偏少導(dǎo)致的。因此，須要擴(kuò)大樣本的數(shù)量和對多個地區(qū)的中國美利奴羊進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#][JP2]Hashimoto C，Hudson K L，Anderson K V The toll gene of drosophila，required for dorsal-ventral embryonic polarity，appears to encode a transmembrane protein[J] Cell，1988，52（2）：269-279

[2]韓凝，張彩，羅南萍 TLR4研究進(jìn)展與腎臟疾病[J] 放射免疫學(xué)雜志，2009，22（2）：133-135

[3]Kiechl S，Lorenz E，Reindl M，et al Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis[J] New England Journal of Medicine，2002，347（3）：185-192

[4]Szomolanyi-Tsuda E，Liang X，Welsh R M，et al Role for TLR2 in NK cell-mediated control of murine cytomegalovirus in vivo[J] Journal of Virology，2006，80（9）：4286-4291

[5][JP3]張欣，張小麗，馬小軍，等 甘肅高山細(xì)毛羊TLR2基因遺傳多態(tài)性及其與乳房炎相關(guān)性[J] 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（6）：1357-1361

[6]李靜，姜相君 Toll樣受體及其基因多態(tài)性與胃黏膜疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展[J] 胃腸病學(xué)，2015（7）：431-434

[7]劉繼峰，瞿鑌，王向東，等 TLR2、4基因多態(tài)性與尖銳濕疣患者易感性及復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究[J] 中華男科學(xué)雜志，2015，21（8）：708-712

[JP2][8]韓璐，趙真真，王笑峰，等 TLR3和TLR4基因多態(tài)性與EBV相關(guān)胃癌易感性的關(guān)系[J] 腫瘤防治研究，2015，42（1）：14-18

[9]趙剛，余梅，崔群維，等 牛血液組胺濃度、TLR4基因多態(tài)性與抗蜱能力的關(guān)聯(lián)分析[J] 中國奶牛，2015（6）：1-5

[10][ZK（#]呂偉麗，馬小軍，張小麗，等 綿羊TLR4基因的遺傳多態(tài)性分析[J] 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（4）：790-795

[11]劉守仁，邵長發(fā)，張鳳林，等 中國美利奴羊（新疆軍墾型）多胎品系的選育研究[J] 畜牧與獸醫(yī)，1995（6）：246-248

[12]Mu X Y，Zhao J，Yuan X，et al Gene polymorphisms of Toll-Like receptor 9 -1486TC and 2848GA in cervical Cancer risk[J] International Journal of Gynecological Cancer，2015，25（7）：1173-1178

[13]吳春香，薛超，廖蘊華，等 TLR4基因1837AG多態(tài)性與廣西漢族人群原發(fā)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性小血管炎的相關(guān)性[J] 廣東醫(yī)學(xué)，2015（4）：528-531

[14]林茂虎，朱曉應(yīng)，苗芮，等 TLR-2和TLR-4受體單核苷酸多態(tài)性與鮑曼不動桿菌感染的相關(guān)性[J] 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015（8）：829-831

[15]王永堂，蔣建新，段朝霞，等 TLR4基因啟動子區(qū)多態(tài)性及其對蛋白表達(dá)的影響[J] 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（7）：1209-1212

[16]Gao J，Liu K，Liu H，et al A complete DNA sequence map of the ovine major histocompatibility complex[J] BMC Genomics，2010，11（11）：466

[17]李玉梅，姚紀(jì)元，吳靜，等 PCR-SSCP技術(shù)的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J] 生物技術(shù)通報，2007（6）：71-74endprint