豬圓環病毒2型體外刺激豬髖動脈血管內皮細胞的炎癥相關細胞因子mRNA轉錄分析

汪偉　胡屹屹　何孔旺　溫立斌　倪艷秀　王小敏　劉傳敏

摘要：通過PCV2病毒感染豬髖動脈血管內皮細胞（PIEC）后炎癥相關細胞因子mRNA轉錄水平變化，探討PCV2感染誘導炎癥產生的免疫機制。將PCV2病毒體外接種PIEC，感染不同時間后，收集樣品，熒光定量PCR方法檢測細胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA轉錄水平的變化。結果顯示，PCV2感染PIEC后，對促炎癥細胞因子IL-1β、IL-18及趨化因子IL-8主要起上調表達作用。由此推測細胞因子在體內的綜合效應會導致PCV2感染早期機體產生過度炎癥反應，并趨化中性粒細胞，引發機體免疫抑制，影響機體特異性免疫應答的正常運轉，為PCVD的發病創造條件。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；豬髖動脈血管內皮細胞；炎癥相關細胞因子；熒光定量PCR；mRNA轉錄分析；免疫機制；促炎癥細胞因子

中圖分類號： S8582853文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0032-03[

收稿日期：2016-11-16

基金項目：國家公益性行業（農業）科研專項（編號：201303046）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（14）2045]；江蘇省農業科學院基本科研業務專項-重大成果培育類[編號：ZX（15）1003]。

作者介紹：汪偉（1988—），男，安徽廬江人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。Tel：（025）84391226；E-mail：weiwang054@126com。

通信作者：何孔旺，研究員。E-mail：kwh2003@263net。

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬成員，為無囊膜、單鏈負股DNA病毒，于1982年由Tischer等首次發現[1]，是目前發現最小的病毒之一，病毒顆粒直徑為12～23 nm[2]，其中豬圓環病毒2型（PCV2）對豬群具有致病性。目前，PCV2已成為影響全球養豬業最重要的疾病之一，是豬圓環病（PCVD）的主要病原[3]。PCV2單獨感染豬群很少引起臨床發病[4]，而使豬群處于亞臨床感染狀態[5]；臨床上常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）及豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）混合感染[6-7]。

在PCVD中PCV2影響機體的免疫系統功能的發揮，從而產生免疫抑制[8]，給全世界養豬業造成了重大的經濟損失[9]。在PMWS豬中存在肉芽腫性炎癥和多核巨細胞，表明細胞因子分泌及其他免疫相關信號分子在該過程中發揮著重要作用。目前，在基因、蛋白水平上，通過在體內體外研究發現PCV2感染后對各種細胞因子產生影響，特別是炎癥相關細胞因子如IL-1β、IL-8、IL-18、TNF-α等，以及免疫調節因子IL-10、IFN-γ等；PCV2與其他病原共感染后對組織細胞的細胞因子也產生影響。通過PCV2對細胞因子產生影響的研究，來闡明PCV2感染對機體免疫系統的影響及引起免疫抑制的相關機理。

PCV2感染豬體后，可引起病毒血癥[10]；PCV2在血液內通過血液循環與血管內皮細胞相互作用，并引起血管內皮細胞分泌細胞因子，極少量的細胞因子即可在體內發揮重要的免疫作用。因此，研究PCV2與血管內皮細胞相互作用引起的細胞因子變化具有重要的意義。本研究旨在探討PCV2病毒感染豬髖動脈血管內皮細胞（pig iliac endothelial cells，PIEC）后對部分炎癥相關細胞因子轉錄水平的影響。

1材料與方法

11試劑與儀器

1640細胞培養液（Invitrogen公司），豬髖動脈血管內皮細胞（PIEC）（中國科學院生化細胞所細胞庫），2×SYBR Premix Ex Taq（大連TaKaRa公司），細胞RNA提取試劑盒（北京天恩澤科技公司），DNase Ⅰ（大連TaKaRa公司），5×qRT SuperMix反轉錄試劑盒（Biouniquer Technology公司）、ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

12病毒

PCV2病毒為筆者所在實驗室自行分離并鑒定，并在 PK-15細胞體外傳代58代后收獲的細胞毒，間接免疫熒光法（IFA）測定其TCID50為10-625 mL。

13PIEC的培養

PIEC培養于含10%血清的1640細胞培養液中，長至單層細胞。將已長滿單層的細胞用細胞培養液制成細胞懸液（細胞密度為50×105 mL）接種至6孔細胞培養板，每孔 2 mL。置37 ℃、5% CO2下培養24 h。

14病毒感染細胞

將6孔板上的細胞用1640培養液（無血清）清洗2次后，每孔接種病毒液2000 μL，補加1640維持液（5%血清）18 mL，共3個重復。另3孔只加20 mL 1640維持液（5%血清），作為細胞因子自然轉錄對照組。置37 ℃、5% CO2下分別作用24、48、72、96 h。

15細胞總RNA的提取與反轉錄

在各時間點分別取出細胞板，按細胞RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，得到的RNA按照DNase Ⅰ說明書進行基因組去除，按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。200 μL 反轉錄體系：5×qRT SuperMix 40 μL，總RNA 80 μL，RNase free ddH2O 80 μL。反轉錄程序：250 ℃ 10 min，420 ℃ 30 min，850 ℃滅活5 min。獲得cDNA，置 -20 ℃ 冰箱備用。

16熒光定量PCR法檢測樣品各細胞因子的cDNA拷貝數

用已經建立好的檢測各細胞因子（IL-1β、IL-18、IL-8）的熒光定量PCR方法[11]檢測各細胞因子的cDNA拷貝數。Real-time PCR經優化，250 μL反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq 125 μL，上、下游引物（10 μmolL）各 05 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）05 μL，cDNA模板 10 μL，ddH2O 100 μL。最佳反應程序：950 ℃ 30 s；950 ℃ 5 s，600 ℃ 34～60 s（表1），40個循環。每一循環結束時讀取熒光信號，總循環結束后，加入熔解曲線分析步驟。將各細胞因子基因的拷貝數除以同1樣本中β-actin基因的拷貝數，獲得1個相對比值，即為細胞因子mRNA相對轉錄水平。endprint