水稻紋枯病病菌β—微管蛋白基因克隆及其與多菌靈抗藥性的關(guān)系

陳洪娜　李建文　孫文秀

摘要：測定湖北省不同地區(qū)水稻紋枯病病菌對多菌靈的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的抗藥性水平不高。根據(jù)常見植物病原真菌β-微管蛋白基因設(shè)計引物，從水稻紋枯病病菌對多菌靈的敏感和抗性菌株中擴(kuò)增β-微管蛋白基因，均獲得了大小為695 bp的基因片段，其中含有1個53 bp的內(nèi)含子，與粗糙脈孢菌具有較高的同源性。序列分析結(jié)果表明，水稻紋枯病病菌抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，分別由T、T、T突變?yōu)镚、C、C，但這3個位點相對應(yīng)的氨基酸卻沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。由此可見，水稻紋枯病病菌對多菌靈抗藥性的產(chǎn)生與β-微管蛋白基因的變異有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：湖北省；水稻紋枯病病菌；β-微管蛋白；基因克隆；多菌靈抗藥性；堿基突變

中圖分類號： S4351114+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0106-03

收稿日期：2016-06-14

基金項目：長江大學(xué)長江青年人才基金（編號：2015cqr18）；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金（編號：KF201410）。

作者簡介：陳洪娜（1992—），女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：1242952938@qqcom。

通信作者：孫文秀，博士，副教授，主要從事植物病害的生物防治研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：wenxiusun@163com。

水稻是我國主要的糧食作物之一，在全球的糧食生產(chǎn)和供應(yīng)中占有重要地位。在水稻生長和生產(chǎn)過程中，水稻紋枯病的發(fā)生嚴(yán)重影響了其質(zhì)量和產(chǎn)量，給我國及世界各國的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）侵染引起，該病原菌寄主范圍廣、變異快、易產(chǎn)生抗藥性。目前，主要采用化學(xué)藥劑防治水稻紋枯病，卻也導(dǎo)致了病原菌抗藥性的產(chǎn)生并呈上升趨勢。

苯并咪唑類殺菌劑能夠通過與病原菌β-微管蛋白結(jié)合，影響微管的形成或使已形成的微管解聚，阻止細(xì)胞的有絲分裂1]，從而達(dá)到抑制病原菌的生長繁殖和侵入。但由于該類殺菌劑作用位點單一、選擇性強(qiáng)，使得病原菌在藥劑選擇壓力下易產(chǎn)生抗藥性2]。其中，多菌靈是一種應(yīng)用廣泛的廣譜性殺菌劑，對多種作物由真菌引起的病害具有良好的防治效果，但也產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物病原菌抗多菌靈菌株的突變位點發(fā)生在β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸上3-5]，使氨基酸的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，降低了藥劑的親和力6]。但也有因為β-微管蛋白其他位點突變而引起病原菌抗多菌靈的研究報道7-12]。更有研究表明，β-微管蛋白不同氨基酸位點的突變可以引起病原菌對多菌靈敏感性的差異13]。目前尚未見到有關(guān)水稻紋枯病病菌對多菌靈抗藥性的研究報道，本研究以篩選到的多菌靈敏感性和抗性菌株為試驗材料，對β-微管蛋白基因進(jìn)行克隆和測序，以明確β-微管蛋白是否發(fā)生基因突變，探索水稻紋枯病病菌對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制。

1材料與方法

11試驗材料

111供試菌株

2014年從湖北武漢、荊州、宜昌等地區(qū)采集水稻紋枯病病株并進(jìn)行分離純化，共獲得134株菌株。在含有10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水）上進(jìn)行抗性和敏感性菌株的篩選，隨機(jī)選取3株抗性菌株wkb2、wka3、wkd3和3株敏感性菌株wka2、wkb3、wkc1用于本研究。

112主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)DH5α和pEASY-T1載體，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨卡青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、dNTP、T4 DNA連接酶和Taq酶，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

12試驗方法

121藥劑敏感性測定

將3個敏感菌株分別接種在含0、02、04、06、08、10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上，再將3個抗性菌株分別接種在含0、10、12、14、16、18 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)2 d，十字交叉法測量各菌落的直徑。通過對菌絲生長抑制率和藥劑的有效濃度對數(shù)值之間的線性回歸分析，求出藥劑的EC50，測定供試菌株對多菌靈的敏感性表型。

122基因組DNA的提取

將供試菌株菌塊接種到PD液體培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 000 mL蒸餾水）中，25 ℃振蕩培養(yǎng)，5 d后無菌過濾收集菌絲，凍干，液氮研磨。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

123PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)已知植物病原真菌β-微管蛋白基因序列設(shè)計1對引物為Rs-F（3′-GTGAGTGAGAACJP3]CACCTCCA-5′）和Rs-R（3′-ACGTTGTTGG GGATCCACTC-5′），以供試菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α。在含Amp、X-gal、IPTG的LB平板（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl、15 g瓊脂、1 000 mL 蒸餾水）上篩選白色菌落，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR驗證，陽性克隆送至濟(jì)南博尚生物科技公司測序。

124序列分析

采用DNAclub軟件分析序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比較，比較水稻紋枯病病菌抗、感菌株β-微管蛋白基因片段的核苷酸和氨基酸序列，找出突變位點。endprint

2結(jié)果與分析

21水稻紋枯病病菌對多菌靈的敏感性測定

測定從湖北省分離獲得的水稻紋枯病病菌菌株對多菌靈的敏感性，發(fā)現(xiàn)2313%的菌株在含有10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上能夠正常生長，表明產(chǎn)生了一定的抗藥性14]。分別測定供試6個菌株對多菌靈的敏感性，結(jié)果如表1所示，敏感性菌株對多菌靈的EC50平均值為0301 2 μgmL，抗性菌株對多菌靈的EC50平均值為0613 4 μgmL，說明菌株的抗藥性水平不高，多菌靈可以繼續(xù)用來防治水稻紋枯病。

22序列分析

通過引物Rs-F和Rs-R對供試水稻紋枯病病菌的β-微管蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果表明，6個菌株均獲得了同等大小的基因片段，片段長度為695 bp，其核苷酸序列與菌株AG-1-IA的β-微管蛋白基因同源性達(dá)999%。同時，通過與典型模式菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的β-微管蛋白基因比較發(fā)現(xiàn)，供試水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因片段均含有53 bp的內(nèi)含子，其位置與粗糙脈孢菌的內(nèi)含子6相似15]，可以明確該片段為β-微管蛋白基因。由圖1可知，抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，即敏感菌株中分別為T、T、T，抗性菌株中分別突變?yōu)镚、C、C，且突變率為100%，但這3個位點相對應(yīng)的氨基酸卻沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。而報道較多的第198、第200位氨基酸并未發(fā)生突變。

FK（W20]TPCHN1tif；S+2mm]

3討論與結(jié)論

大多數(shù)研究表明，植物病原真菌對多菌靈的抗藥性與 β-微管蛋白基因變異有關(guān)，且由個別堿基突變導(dǎo)致氨基酸變異，從而產(chǎn)生抗藥性。報道最多的是β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸發(fā)生突變。例如，粗糙脈孢菌（N crassa）抗性菌株中β-微管蛋白的第198位氨基酸由甘氨酸變成了谷氨酸，第200位氨基酸由苯丙氨酸變成了酪氨酸3]；油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）β-微管蛋白的第198位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)楸彼?6]；膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第200位氨基酸由苯丙氨酸突變成了酪氨酸17]；小麥赤霉病病菌（Gibberella zeae）Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)槔野彼幔琂s519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸變?yōu)楣劝滨０?8]等。除此之外，芒果炭疽病病菌（C gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第181、第237、第363位氨基酸發(fā)生了突變，而其他位置（如第198位或第200位）均不變19]。也有研究表明，一些植物病原真菌對多菌靈抗藥性的產(chǎn)生與 β-微管蛋白基因無關(guān)，如水稻惡苗病病菌（Fusarium fujikuroi）20]、禾谷鐮孢菌（F graminearum）21]等。

本研究通過測定水稻紋枯病病菌對多菌靈的敏感性發(fā)現(xiàn)抗藥性水平不高，可以將多菌靈和井岡霉素交替使用來防治水稻紋枯病，防止抗藥性的產(chǎn)生和提高。比較了抗、感菌株的β-微管蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，敏感菌株中分別為T、T、T，而抗性菌株中分別為G、C、C，但這3個位點堿基的突變卻沒有導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生變化。而且報道較多的第198、第200位氨基酸也未發(fā)生突變。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。這些突變均有可能導(dǎo)致水稻紋枯病病菌對多菌靈產(chǎn)生抗藥性，也說明該病原菌對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制與其他真菌可能相同，但還有待于進(jìn)一步確認(rèn)這3個位點突變與多菌靈抗藥性之間的關(guān)系。

上述研究結(jié)果表明，在對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的植物病原真菌中，β-微管蛋白基因的突變沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律。本研究中水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因堿基的突變沒有引起氨基酸的變化，可能與多菌靈的抗藥性水平有一定的關(guān)系。此外，設(shè)計引物時主要考慮了第198、第200位的氨基酸位點，獲得的β-微管蛋白基因沒有包含全部突變位點，使本研究結(jié)果與以往報道不一致。為此，在本研究的基礎(chǔ)上通過單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子標(biāo)記技術(shù)22]進(jìn)一步分析水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因單個堿基的突變與多菌靈抗藥性之間的關(guān)系，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測抗性菌株和監(jiān)測抗性群體發(fā)展動態(tài)的方法，這對于治理抗藥性、延長藥劑的使用壽命及降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

1]ZK（#]Fujimura M，Kamakura T，Yamaguchi I Action mechanism of diethofencarb to a benzimidazole-resistant mutant in Neurospora crassaJ] Journal of Pesticide Science，1992，17（4）：237-242

2]周明國，葉鐘音 植物病原菌對苯并咪唑類及相關(guān)殺菌劑的抗藥性J] 植物保護(hù)，1987（2）：31-33

3]Koenradt H，Jones A L Resistance to binomyl conferred by mutation in codon 198 or 200 of the beta-tubulin gene of Neurospora crassa and sensitivity to diethofencarb conferred by codon 198J] Phytopathlogy，1993，83（8）：850-853

4]Yanden O，Katan T Mutations leading to substitutions at amino acids 198 and 200 of beta-tubulin that correlate with benomyl-resistance phenotypes of field strains of Botrytis cinereaJ] Phytopathology，1993，83（12）：1478-1483endprint

5]Koenraadt H，Somerville S C，Jones A L Characterization of mutations in the beta-tubulin gene of benomyl resistant fields strains of Venturia inaepualisans other plant pathogenic fungiJ] Phytopathology，1992，82（11）：1348-1354

6]黃世文，黃雯雯，王玲，等 水稻主要病蟲害“傻瓜”式防控技術(shù)理論與實踐（1）J] 中國稻米，2009（4）：13-16

7]May G S，Tsang L S，Smith H，et al Aspergillus nidulans β-tubulin genes are unusually divergentJ] Gene，1987，55（2）：231-243

8]Burland T G，Schedl T，Gull K，et al Genetic analysis of resistance to benzimidazoles in Physarum：differential expression of β-tubulin genesJ] Genetics，1984，108（1）：123-141

9]Neff N F，Thomas J H，Grisafi P，et al Isolation of the β-tubulin gene from yeast and demonstration of its essential function in vivoJ] Cell，1983，33（1）：211-219

10]ZK（#]Thomas J H，Neff N F，Botstein D Isolation and characterization of mutation in the β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiaeJ] Genetics，1985，111（4）：715-734

11]Ma Z，Michailides T J Advances in understanding molecular mechanisms of fungicide resistance and molecular detection of resistant genotypes in phytopathogenic fungiJ] Crop Protection，2005，24（10）：853-863

12]Kawchuk L M，Hutchison L J，Verhaeghe C A，et al Isolation of the β-tubulin gene and characterization of thiabendazole resistance in Gibberella pulicarisJ] Plant Pathology，2002，24（2）：233-238

13]仇劍波 禾谷鐮孢菌β-微管蛋白基因定點突變及敲除對多菌靈敏感性和基因表達(dá)譜的影響D] 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：39-59

14]袁夢思，李建文，孫文秀 苯并咪唑類殺菌劑對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力測定J] 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（7）：1710-1712

15]Edelmann S E，Staben C A statistical analysis of sequence features within genes from Neurospora crassaJ] Experimental Mycology，1994，18（1）：70-81

16]李紅霞，陸悅健，周明國，等 油菜菌核病菌β-微管蛋白基因與多菌靈抗藥性相關(guān)突變的研究J] 中國油料作物學(xué)報，2003，25（2）：56-60

17]鄧維萍，梅馨月，楊敏，等 膠孢炭疽菌及兩種疫霉菌對苯酰菌胺的敏感性與β-微管蛋白氨基酸突變的相關(guān)性分析J] 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2012，14（2）：143-150

18]曾凡松，尹合興，史文琦，等 β1-和β2-微管蛋白基因在赤霉病菌抗多菌靈中的作用J] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（4）：695-704

19]詹儒林，鄭服叢 芒果炭疽病菌β-微管蛋白基因的克隆及其與多菌靈抗藥性發(fā)生的關(guān)系J] 微生物學(xué)報，2004，44（6）：827-829

20]馬曉偉，邢春杰，于金鳳，等 水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）β-微管蛋白基因克隆及與多菌靈抗藥性關(guān)系J] 微生物學(xué)報，2012，52（5）：581-587

21]李紅霞，陸悅健，王建新，等 禾谷鐮孢菌β-微管蛋白基因克隆及其與多菌靈抗藥性關(guān)系的分析J] 微生物學(xué)報，2003，43（4）：424-429

22]謝海強(qiáng)，孫巖巖，盤道興，等 貴州本地山羊STAT5A基因第10外顯子SNP研究J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：30-33endprint