獼猴桃潰瘍病P—L菌株誘導植株系統的抗性

任平　阮祥穩　趙文娟　秦濤

摘要：將不同致病力的獼猴桃潰瘍病病菌接種于獼猴桃植株上，測定與抗病性相關的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）這5種防御酶的活性，結果表明，獼猴桃潰瘍病不同致病力菌株會導致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高；接種強致病力菌株P-H使獼猴桃植株的5種防御酶活性變化劇烈，尤其是POD活性明顯上升后又明顯下降；與接種無菌水相比，接種不同濃度P-L菌株可導致獼猴桃植株POD、PPO、SOD、CAT、PAL的活性明顯提高，其中接種濃度為107 CFUmL的P-L菌株發酵液，5種酶活性明顯高于其他2個濃度處理，且與P-H菌株接種侵染的各酶活性變化趨勢相同。高濃度 P-L菌株發酵液具有更好的激發植株體內防御酶活性的能力，弱致病力獼猴桃潰瘍病病菌P-L發酵液能誘導獼猴桃植株產生抗病性。

關鍵詞：獼猴桃；潰瘍病；防御酶；誘導抗性；P-L菌株；過氧化物酶；發酵液

中圖分類號： S436634文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0109-03

收稿日期：2016-06-17

基金項目：陜西省科學院基礎研究項目（編號：2013K-16）。

作者簡介：任平（1972—），女，陜西西安人，副研究員，主要從事微生物資源應用開發。E-mail：mysrenping@163com。

生物防治是控制植物病害、減少化學農藥污染的有效途徑，而誘導抗性又是植物病害生物防治的重要機理之一1]。誘導抗性是通過誘發植物免疫機制來實現的，利用物理、化學或生物因子預先處理植物，使原來的感病反應產生局部的或系統的抗性2]。植物經外界刺激或誘導會引起植物產生一些應急反應，進而引起植株的生理生化指標變化，使植物產生抗性。目前，研究植物誘導抗性機制時，主要是研究一些與抗病相關的酶或物質3]。植物受病原菌侵染或生物因子誘導，植物體內與抗病反應密切相關的防御酶活性會升高，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等是存在于植物體內與抵抗病原微生物侵染有關的重要酶類4]。

獼猴桃潰瘍病是獼猴桃生產過程中的一個重要病害，化學藥劑難以有效地防控，即使大量使用農藥，也收效甚微，還造成獼猴桃產品和生態環境污染。根據“植物獲得性抗性”學說5]，用獼猴桃潰瘍病弱致病菌株發酵液進行誘導接種，可刺激獼猴桃植株體內產生對潰瘍病的抗體，進而使獼猴桃植株產生對潰瘍病的抗性，從而達到不用化學農藥、用弱致病菌株防控獼猴桃潰瘍病的目的，實現獼猴桃的無污染生產。

前期研究發現，接種獼猴桃潰瘍病弱致病菌P-L發酵液能提高獼猴桃植株對強致病菌P-H的抗性。在此基礎上，本試驗通過將不同濃度P-L菌株發酵液接種到獼猴桃植株上，測定其體內PAL、POD、PPO等酶的活性變化，分析弱致病菌是否會引起植物系統產生抗病性，為揭示其生防機理提供依據。

1材料與方法

11試驗材料

強致病菌P-H、弱致病菌P-L，由陜西省科學院酶工程研究所微生物實驗室篩選出來；15株試驗植株為2年生盆栽獼猴桃實生苗。金氏B培養基（KBA培養基）：蛋白酶解蛋白胨200 g，KH2PO4 15 g，MgSO4·7H2O 15 g，甘油150 mL，加蒸餾水到1 L，pH值為72。培養基121 ℃滅菌20 min。

12試驗方法

121菌株懸液的制備及接種將不同致病力P-H菌株、P-L菌株分別接種于KBA培養基中，26 ℃ 160 rmin振蕩培養30 h；將P-L菌株發酵液用無菌水分別稀釋成105、106、107 CFUmL等3個濃度，采用超聲波對細胞進行破碎，超聲波輸出功率為250 W，工作6 s，間隔5 s，總工作時間66 min；將P-H菌株發酵液用無菌水稀釋成106 CFUmL作為對照1（CK1），以無菌水處理作為對照2（CK2）；每處理選取長勢一致、健壯的獼猴桃植株各3株，每株選擇3張大小均勻、長勢良好的葉片，將菌液及無菌水均勻噴在獼猴桃葉片上進行誘導抗性試驗，套上保鮮袋。

122POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性的測定接種前及接種后2、6、10、15、20 d分別采集獼猴桃葉片，測定其POD、PPO、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。POD提取及活性測定參照張龍翔等的方法6]進行，以 1 g 鮮質量1 min內D470 nm值變化001作為1個酶活性單位（U）。PPO提取及活性測定參照朱廣廉等的方法7]進行，以1 g鮮質量1 min內D525 nm值變化001為1個酶活性單位（U）。SOD提取及活性測定參照朱廣廉等的方法7]進行，以抑制氮藍四唑（NBT）還原的50%酶量為1個酶活性單位，以不加酶液而用緩沖液代替酶液的處理為空白對照，酶活性計算公式為：

JZ]N=2×（D560 nm空白-D560 nm處理）D560 nm空白。

CAT提取及活性測定參照李合生的方法8]進行，采用紫外吸收法，以1 g鮮質量1 min內D240 nm減少01的酶量為1個酶活性單位（U）。PAL提取及活性測定參照薛應龍等的方法9]進行，以1 g鮮質量D290 nm值變化001所需酶量為1個酶活性單位（U）。

2結果與分析

21P-L菌株不同濃度發酵液對過氧化物酶（POD）活性的影響

由圖1可知，處理組和對照組在接種前的POD活性差異不明顯；處理組和CK1的POD活性在接種后2～6 d多為緩慢升高，在接種后6～10 d的POD活性明顯上升且達到峰值，后下降較快，接種15 d后趨于平穩；接種后20 d時，處理組和CK1的POD活性仍高于CK2；CK2的POD活性在20 d內變化不大；處理C（P-L菌株發酵液濃度為107 CFUmL）的POD活性明顯高于其他2個處理；處理組的POD活性變化趨勢與CK1一致，且POD活性始終高于CK2，這是由于當病原菌在植株體內活動時，過氧化物酶對病原菌極為敏感，很可能與其他代謝系統協同作用，使體內活性氧物質保持在一個正常的動態水平，同時，其還可以氧化枝條組織中的酚類化合物，相應產物阻止病原物的擴展，提高了其抗性水平。107 CFUmL 高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發POD活性的能力。endprint

22P-L菌株不同濃度發酵液對多酚氧化酶（PPO）活性的影響

由圖2可知，處理組和對照組在接種前的PPO活性差異不明顯；處理B、處理C、CK1的PPO活性在接種后2～10 d明顯上升且達到峰值，后下降較快，接種后20 d仍高于CK2；處理A的PPO活性在接種后2～6 d緩慢升高，在接種后6～10 d的PPO活性明顯上升且達到峰值，后有所下降，接種后20 d時，處理A的PPO活性高于處理B、CK2；CK2的PPO活性在20 d內變化不大；處理C的PPO活性明顯高于其他2個處理；處理組的PPO活性變化趨勢與CK1基本一致，且其PPO活性始終高于CK2，這可能是由于植物在對病原菌侵染的防衛反應中，需要更多的多酚氧化酶參與，而多酚氧化酶不僅參與酚類物質的氧化，同時也參與木質素的形成，木質素一方CM（25]面增加了細胞壁抗病原物的穿透壓力，另一方面限制了真菌酶和毒素的擴散，阻礙了病原菌從寄主獲得水和營養物質10]。107 CFUmL高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發PPO活性的能力。

23P-L菌株不同濃度發酵液對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖3可知，處理組和對照組在接種前的SOD活性差異不明顯；處理組和CK1的SOD活性在接種后2 d呈下降趨勢，處理B、處理C、CK1在接種后2～10 d的SOD活性明顯上升并達到峰值，后下降較快，接種后20 d時，處理組和CK1的SOD活性仍高于CK2；處理A的SOD酶活性在接種后2～15 d緩慢上升且達到峰值，接種后20 d時的SOD活性高于處理B、CK2；CK2的SOD活性在20 d內變化不大；處理C的SOD酶活性高于其他2個處理；處理組的SOD活性變化趨勢與CK1一致，且其SOD活性始終高于CK2，這可能是當病原菌侵染時SOD活性上升，以清除病原菌刺激產生的自由基，防止氧自由基傷害細胞膜系統，使細胞內保持一個穩定、有利于生長的環境11]。107 CFUmL高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發SOD活性的能力。

24P-L菌株不同濃度發酵液對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由圖4可知，處理組和對照組在接種前的CAT活性差異不明顯；處理組和CK1的CAT活性在接種后6 d達到第1個峰值，這可能是在病菌侵染初期，細胞經SOD過程產生H2O2，使胞內活性氧的數量迅速增加，CAT活性也隨之上升；后CAT活性值下降，并在接種10 d后又上升，在接種后15 d CAT活性達到第2個峰值，這可能是獼猴桃接種病菌，其枝條細胞有新的代謝產物產生，從而進一步刺激CAT活性上升；處理組的CAT活性變化趨勢與CK1一致，且CAT活始值高于CK2。107 CFUmL高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發CAT活性的能力。

25P-L菌株不同濃度發酵液對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

由圖5可知，處理組和對照組在接種前的PAL活性差異不明顯；處理組和CK1的PAL活性在接種后2～6 d明顯升高，接種后6 d PAL活性達到峰值，后又緩慢下降，接種10 d后趨于平穩；接種后20 d時，處理組和CK1的PAL活性仍高于CK2，CK2的PAL活性在20 d內活性變化不大；處理組的PAL活性變化趨勢與CK1一致，且PAL活性始終高于CK2，這可能是由于病原菌攻擊引起植物體合成大量新的PAL，以抵抗病原菌侵入對植物的傷害。107 CFUmL高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發PAL活性的能力。

3結論與討論

植物病害生物防治機制包括抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、競爭作用、交互保護作用及促生作用12-13]，誘導系統抗性也被認為是生防菌的一種重要防病機制。植物的誘導抗病包括木質化、防御酶活性、病程相關蛋白、植保素等多種生理生化因子的合成。有大量研究表明，參與植物體內多種防衛反應的PAL、PPO、POD等酶系與植物抗病性密切相關14]，這些酶的活性與植株抗病性呈正相關，在植物的抗病反應中起到非常重要的作用。

接種獼猴桃潰瘍病不同致病力菌株會導致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高，而接種強致病力菌株會使獼猴桃的5種防御酶活性變化劇烈，尤其是POD活性急劇上升后又迅速下降，這種變化可能與強致病力菌株對植物具有致病性，能導致植物發病及生理功能紊亂等有關15]；與接種無菌水相比，接種P-L菌株不同濃度發酵液可導致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高，其中接種濃度為107 CFUmL P-L菌株發酵液的獼猴桃植株的5種酶活性明顯高于接種106、105 CFUmL的，且與P-H菌株侵染后的酶活性變化趨勢相同，107 CFUmL高濃度P-L菌株發酵液具有更強激發植株體內防御酶活性的能力。

不論是弱致病菌還是強致病菌，在一定程度上都可導致與抗病反應相關的一些生理生化指標的變化，而且有時植株對強致病力潰瘍病菌的反應更加敏感。因此，在誘導植物提高抗病能力時，須選擇合適的誘導菌株和接種強度，以達到預期的生防目的。

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