鐵皮石斛共生真菌對不同碳源的適應(yīng)性

徐超　張紅巖　楊鶴同　席剛俊

摘要：以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、淀粉作為培養(yǎng)基中的碳源，探索鐵皮石斛共生真菌對不同碳源的適應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以蔗糖、葡萄糖作為碳源時，各種共生真菌的生長速度較快、菌絲干質(zhì)量較高。蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源，考慮到成本，使用蔗糖更為適宜。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；共生真菌；碳源

中圖分類號： S56723+901文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0147-02

收稿日期：2016-06-01

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2014385）；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2015kj036）。

作者簡介：徐超（1979—），男，博士，副研究員，長期從事鐵皮石斛等植物共生菌的相關(guān)研究。E-mail：cxu8888@126com。

通信作者：席剛俊，男，助理研究員，主要從事鐵皮石斛栽培技術(shù)研究。E-mail：xigangjun@163com。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物1]，具有很好的滋陰潤肺、抗腫瘤等功效2]，被譽為“中華九大仙草”之首3-4]。作為典型菌根共生植物，共生真菌主要寄生于鐵皮石斛的種子及根系上5-6]。碳源是生物細胞骨架構(gòu)建的主要物質(zhì)，也是細胞生命活動所需能源的主要提供者，因此微生物的正常生長和代謝離不開碳源。由于不同菌種代謝能力不同，對碳源的利用存在差異，導(dǎo)致不同菌種對各種外源碳源的適應(yīng)性可能有所區(qū)別7]。目前，關(guān)于鐵皮石斛專用生物菌肥的相關(guān)報道較少。本研究通過探索鐵皮石斛共生真菌對不同外源碳源的適應(yīng)性，進而篩選出適宜的外源碳源，為制備鐵皮石斛菌根菌劑提供參考。

1材料與方法

11試驗材料

供試碳源：蔗糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖。

供試菌種：鐵皮石斛共生真菌001、002、003，保存于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)中心。

12培養(yǎng)基制備

121固體培養(yǎng)基固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g，酸堿度自然，水1 000 mL8]。將供試外源碳源蔗糖、葡萄糖、淀粉和麥芽糖分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成添加不同外源碳源的培養(yǎng)基。其中，每種碳源設(shè)5個濃度梯度：依次為1%、2%、3%、4%、5%；同時，每個梯度各設(shè)3次重復(fù)9]。將制備好的培養(yǎng)基分裝于150 mL三角瓶中，然后進行濕熱滅菌（121 ℃，20 min）。

122液體培養(yǎng)基液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g、酸堿度自然，水1 000 mL8]。不同外源碳源的添加方式和濃度梯度設(shè)置與以上固體培養(yǎng)基的制備方法相同。

13鐵皮石斛共生真菌的人工接種及培養(yǎng)

將制備好的添加不同外源碳源的培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿內(nèi)（直徑90 mm），約15 mL皿；用滅菌的打孔器（直徑4 mm）將預(yù)先在PDA上培養(yǎng)好的菌種打成菌餅，接種到PDA平板中央和液體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)7 d（27 ℃，PRX-250A智能人工氣候箱）。

14測量方法

141菌落生長速度根據(jù)“13”節(jié)的操作步驟，黑暗培養(yǎng) 7 d 后，測量共生真菌在固體培養(yǎng)基上的菌落直徑，作為衡量菌落生長速度的參考指標。每種處理設(shè)5個重復(fù)。

142菌絲體干質(zhì)量根據(jù)“13”節(jié)的操作步驟，黑暗培養(yǎng)7 d后，將液體培養(yǎng)基中的菌絲體取出，烘干后稱質(zhì)量，作為衡量菌絲干質(zhì)量的參考指標（60 ℃，24 h，DGG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱）。

2結(jié)果與分析

21不同外源碳源對鐵皮石斛共生真菌菌落的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)過程中，鐵皮石斛共生真菌對4種供試外源碳源都可利用，但菌落的生長速度不同。其中，001菌株在添加蔗糖、葡萄糖的培養(yǎng)基中，生長較好，菌落最大直徑分別為718、727 cm；在添加淀粉的培養(yǎng)基中生長最差，最大菌落直徑僅為571 cm；002菌株在添加蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉的培養(yǎng)基中均生長較好，菌落最大直徑均為 900 cm；003菌株在添加蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)基中生長較好，最大菌落直徑均超過880 cm，而在添加淀粉的培養(yǎng)基中生長稍差，最大菌落直徑僅為810 cm（表1）。

綜合以上結(jié)果，3種鐵皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培養(yǎng)基上生長狀況均較好，菌落直徑較大。因此，蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源。

22不同外源碳源對鐵皮石斛共生真菌菌絲干質(zhì)量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在液體振蕩培養(yǎng)過程中，鐵皮石斛共生真菌對4種供試碳源都可利用，但碳源差異對鐵皮石斛共生真菌菌絲干質(zhì)量的影響較大。在添加蔗糖、麥芽糖的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，3種供試真菌的菌絲體干質(zhì)量均有一定優(yōu)勢；而在添加葡萄糖、淀粉的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，各供試共生真菌的菌絲體干質(zhì)量明顯較低。其中，001菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，生長狀況均較良好，菌絲體的最大干質(zhì)量均在 050 g皿左右， 最適濃度為5%， 而在添加葡萄糖、淀粉的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，菌絲體的最大干質(zhì)量均低于040 g皿；002菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，菌絲體最大干質(zhì)量均超過 025 g皿，最適濃度為1%。003菌株在添加蔗糖、麥芽糖的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，菌絲體的最大干質(zhì)量均接近 07 g皿，最適濃度為4%，而在添加葡萄糖、淀粉的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，最大干質(zhì)量均不足05 g皿（表2）。

綜上可見，3種鐵皮石斛共生真菌在添加蔗糖、葡萄糖的培養(yǎng)基中進行人工培養(yǎng)時，共生真菌的菌絲干質(zhì)量均較大。因此，蔗糖、葡萄糖為適用于鐵皮石斛共生真菌生長的碳源。

3結(jié)論與討論endprint

通過對鐵皮石斛共生真菌的菌落生長速度和菌絲體干質(zhì)量進行測定，發(fā)現(xiàn)在以蔗糖作為碳源時，鐵皮石斛共生真菌的生長速度和菌絲干質(zhì)量均較優(yōu)；當以葡萄糖作為碳源時，雖然菌落生長較快，但生長勢較弱，菌絲干質(zhì)量相對較低，這可能和菌種間的差異性有關(guān)。此外，與蔗糖相比，麥芽糖、葡萄糖的價格相對較高。綜合以上因素，確定蔗糖為適用于鐵皮石斛共生真菌的外源碳源。

目前，鐵皮石斛的組培技術(shù)基本成熟，但其組培苗移栽成活率低、生長緩慢，可能與缺少共生真菌有關(guān)10-11]。在鐵皮石斛人工栽培過程中，優(yōu)良菌根菌劑的使用不僅對鐵皮石斛存活率具有顯著影響，對其產(chǎn)量的提高、抗旱性的增強也具有至關(guān)重要的作用12]；同時，共生真菌形成優(yōu)勢菌群后，釋放的拮抗物質(zhì)可阻止其他病原菌侵入植物體內(nèi)，大大減輕植物感染病害的風(fēng)險13]。陳海榮等研究發(fā)現(xiàn)，在紫云英根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化過程中，無機碳源中蔗糖和甘露醇為比較理想的碳源，表明不同真菌的培養(yǎng)條件既有共性，也有菌株個性，對相同碳源的吸收和利用率不盡相同，對不同碳源的吸收效果也存在較大差異14]。因此，在鐵皮石斛的人工栽培過程中，使用優(yōu)良的菌根菌劑是有益的；但在進行菌根真菌擴繁和菌劑制備時，為了提高菌劑生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，預(yù)先進行菌根真菌培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化10]，逐步篩選經(jīng)濟、實用、高效的基質(zhì)配方是十分必要的，也是必不可少的試驗內(nèi)容。

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