2種綠藻的玻璃化凍存研究

劉紅全　袁莎　林小園　李潔瓊　龍寒　禤金彩　何秀苗

摘要：收集對數生長后期細胞，采用不同配方及濃度的玻璃化凍存液以及不同的凍存步驟對膠網藻HE01和小球藻HE07進行冷凍保存試驗，通過復蘇后的細胞存活率判斷適合的凍存液和凍存步驟。結果發現，不同的微藻所需的凍存液不同。對HE01和HE07海洋微藻分別使用5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液和15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液做為凍存劑，4 ℃條件下30 min后，轉入-20 ℃預凍存2 h，再-80 ℃過夜后投入液氮中保存，膠網藻HE01和小球藻HE07的凍存率分別為702%、7059%。復蘇后微藻生長狀況良好。

關鍵詞：膠網藻；小球藻；玻璃化凍存；抗凍保護劑

中圖分類號： S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0183-03

收稿日期：2016-05-31

基金項目：國家自然科學基金（編號：30960215）；廣西自然科學基金（編號：桂科青0728019）；廣西民族大學相思湖青年學者創新團隊資助項目。

作者簡介：劉紅全（1975—），男，黑龍江人，博士，副教授，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：lhongquan@163com。

微藻結構簡單、繁殖迅速、易于培養、能夠產生多種生物活性物質，具有很好的開發前景。藻類的長時間培養容易引起藻種污染，生命力減退以及藻種的基因漂變1-2]，給藻種的保存、研究以及大規模培養帶來眾多不便。目前，在微藻保存中的方法有固定化保存，繼代保存和超低溫凍存法3]。這些方法在實際應用中有其弊端，如繼代培養在多次接種過程中藻種容易污染和逐漸老化，生命力減退。固定化保種程序復雜，大多數微藻在培養后期常會從膠珠中溢出4-5]。自1985年Rall等首次將小鼠胚胎細胞運用玻璃化凍存的方式成功凍存6]以來，玻璃化凍存的應用越來越廣。玻璃化凍存技術不僅可以克服在藻種多次接種下導致的污染、基因漂變問題，還可以在超低溫條件下殺死有害細菌，實現藻種長期保存的目的7]。微藻玻璃化凍存的成功報道也越來越多8-10]。小球藻（Chlorella）具有很高的營養價值，膠網藻（Dictyosphaerium）產油脂量較高，對它們進行成功低溫保存將為進一步開發利用這2種綠藻奠定基礎。本試驗對膠網藻和小球藻的玻璃化凍存進行了研究。

1材料與方法

11藻種來源及其培養

膠網藻HE01與小球藻HE07分離于廣西沿海紅樹林的水樣中。2種綠藻培養于F2培養基中，在（24±1）℃、光照度（4×40 W日光照射）、光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養。取對數生長后期的藻液用于試驗。

12抗凍保護劑的選擇

JP3]在蔡小寧等的試驗方法11]上做出改進，選取10% DMSO+10%乙二醇+30%蔗糖+F2培養基為玻璃化凍存液配方。分別在此基礎上改變DMSO、乙二醇與蔗糖濃度。DMSO濃度梯度為5%、10%、15%、20%、25%；乙二醇濃度梯度為5%、10%、15%、20%、25%；蔗糖濃度梯度為10%、15%、20%、25%、30%。在單因素優化結果的基礎上進行3因素3水平的正交試驗，正交試驗選用濃度為單因素優化最佳值與左右相鄰值。

13玻璃化凍存

131預處理

將對數生長期的2種藻細胞置于4 ℃的環境下暗培養48 h。提高藻種的耐寒性。

132預平衡

取預培養后的藻細胞4 mL，經離心濃縮后分別加入稀釋2倍的玻璃化凍存液和培養基預平衡5 min，離心去除平衡液，迅速加入玻璃化凍存液或培養基分裝到2 mL的凍存管中，每管500 μL。

133凍存步驟對微藻凍存率的影響

分別將2種藻迅速放入到液氮罐中或者在4 ℃凍存30 min后，移到-20 ℃凍存2 h再移到-80 ℃條件下過夜后投入到液氮罐中。

134解凍和凍存液的去除

將在液氮中保存24 h后的藻種取出，立即放入40 ℃恒溫水浴鍋快速解凍。化凍后的微藻在無菌條件下室溫平衡20 min后加入3倍體積培養基離心去除溶液，用培養基重復洗滌2～3次。

135凍存后的恢復培養

將去除凍存液的藻細胞接種到新鮮培養基中，暗培養1 d后轉入到光照培養。

14藻細胞存活率的測定

參照Canavate等的方法12]，取恢復培養后的藻細胞接入F2培養基，培養4 d后，采用752型紫外分光光度計測定藻液的D680 nm值。并以未凍存的藻細胞作對照。

存活率=解凍后藻液的D680 nm值未凍存藻液的D680 nm值×100%。

2結果

21蔗糖濃度對凍存率的影響

未加入凍存液的2種藻的存活率均為0，可以看出2種微藻對超低溫均沒有耐受性。隨著蔗糖的濃度增加，2種海洋綠藻的存活率顯著增加。當蔗糖濃度達到25%的時候存活率最高，HE01為6375%，HE07為6036%（圖1）。

22DMSO濃度對凍存率的影響

當DMSO濃度為10%的時候2種綠藻凍存率最高，HE01和HE07凍存率分別為616%、5526%（圖2）。這一結果與蔡小寧等的研究11]相符。一般認為，DMSO的高極性使其易于透過細胞膜，并在細胞內外形成高滲透壓，因此DMSO穿透能力較強并且具有更好的保護效果，防止細胞內形成冰晶導致細胞膜被破壞13]。

23乙二醇濃度對凍存率的影響

乙二醇可迅速滲入細胞內，降低細胞膜對水的通透性。試驗結果表明，乙二醇在濃度為10%的時候海洋微藻凍存率最高，HE01和HE07凍存率分別為6127%、6144%（圖3）。endprint

24正交試驗結果

玻璃化凍存液試驗因子對2種海洋微藻的的存活率有明顯影響（表2、表3、表4）。影響存活率的因素主次順序是：DMSO濃度>蔗糖濃度>乙二醇濃度。根據k值可以得到適合HE01的最佳玻璃化凍存條件為5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培養基。通過凍存試驗HE01的存活率為702%，高于正交試驗中的存活率。適合HE07最佳玻璃化凍存的條件為15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培養基，由正交試驗可以看出存活率為7059%。因此，綜合考慮HE01的玻璃化液最優組合水平為5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖，HE07的玻璃化液最優組合條件為15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖。

25凍存步驟對冷凍保存存活率的影響

相較于未分步凍存的HE01存活率為556%， 分步凍存的HE01存活率提高為672%（圖4）；經過分步凍存的HE07存活率為689%，高于未分步凍存414%的存活率（圖5）。反映出充分的預凍處理是保證玻璃化凍存的成功條件之一。

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26凍存后2種綠藻的生長情況

凍存后恢復培養的2種綠藻細胞其生長曲線測定結果（圖6、圖7）表明，冷凍組與對照組的生長規律一致，在生長前期，凍存的細胞生長較慢，但在對數后期，凍存組的活性恢復，生長速度和對照組差別不大。

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3討論

影響微藻低溫冷凍存活率的因素有很多，包括冷凍劑、藻種、冷凍步驟等等14]。針對不同的藻種，也要對其玻璃化凍存液進行特定的優化。將不同的凍存保護劑聯合使用進行玻璃化凍存，可以使防凍劑的液體黏滯度升高，液體分子的彌散運CM（25]動被抑制，從而加強冷凍效果和減輕毒性。DMSO、蔗糖、

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乙二醇是最常用的抗凍保護劑。蔗糖可以限制水分過快進入細胞，為細胞提供一個高滲環境，增加抗動力的同時又充分脫水，避免凍存時冰晶形成造成傷害，也避免解凍時發生滲透性休克，起到特異性保護作用15]。結果表明在所示的濃度范圍內，蔗糖濃度越低導致微藻存活率越低。乙二醇與DMSO都是常見的滲透性冷凍保護劑。乙二醇可迅速滲入細胞內，降低細胞膜對水的通透性。DMSO的高度水溶性使其易于透過細胞膜并形成高滲透壓，補償了細胞內外存在的鹽梯度，因此可防止細胞內的冰晶形成和細胞膜的破壞。但DMSO具有一定的毒性，能導致部分細胞死亡。閆立強等發現，DMSO對微藻的毒性大小既與微藻種類有關，也與DMSO濃度有關16]。如圖2所示，隨著DMSO濃度由10%逐漸增加，2種微藻的凍存率也越來越低。這是因為高濃度的DMSO對微藻有較大毒性，導致了微藻細胞的死亡。10%濃度的DMSO是介于微藻細胞毒性與細胞保護之間的一個臨界點。不同的微藻由于細胞壁的不同對凍存劑的耐受力不同，導致每種微藻的抗凍保護劑不同。在冷凍過程中，常將幾種保護劑混合起來使用，既保證了抗凍性也降低了單一保護劑高濃度的毒性。

在做預處理時冷凍保護劑與細胞接觸的溫度和時間需要進行嚴格控制，試驗結果表明進行預凍存處理效果好于將藻種直接投入到液氮當中。因為低溫環境可以降低DMSO的毒性17]，同時細胞與冷凍保護劑預先接觸可提高細胞對滲透壓突變的耐受性。通過控制海洋微藻凍存的內外條件，本試驗凍存的2種海洋綠藻，存活率都達到了66%以上。

玻璃化凍存法研究雖然取得了一定的進展，但是適合于一種藻種的方法對另一種藻可能并不適用。針對這一領域，還有許多問題需要做進一步的探討與研究。如微藻化凍后的材料處理，活化復蘇培養所需的條件18]，抗凍性與細胞年齡等，有待更深入的研究。

參考文獻：

1]ZK（#]Gwo J C，Chiu J Y，Chou C C，et al Cryopreservation of a marine microalga，Nannochloropsis oculata （Eustigmatophyceae）J] Cryobiology，2005，50（3）：338-343

2]Rhodes L，Smith J，Tervit R，et al Cryopreservation of economically valuable marine micro-algae in the classes Bacillariophyceae，Chlorophyceae，Cyanophyceae，Dinophyceae，Haptophyceae，Prasinophyceae，and RhodophyceaeJ] Cryobiology，2006，52（1）：152-156LM]

3]ZK（#]潘克厚，朱葆華 微藻的保種技術及其應用J] 青島海洋大學學報（自然科學版），2002，32（3）：403-408

4]馬志珍，張繼紅 海產餌用微藻固定化保種技術J] 中國水產科學，1998（2）：57-61

5]馬志珍 微藻固定化培養技術及其應用前景J] 國外水產，1993（3）：1-4

6]Rall W F，Fahy G M Lce-free cryopreservation of mouse embryos at -196 ℃ by vitrificationJ] Nature，1985，313（6003）：573-575

7]Müller J，Day J G，Harding K，et al Assessing genetic stability of a range of terrestrial microalgae after cryopreservation using amplified fragment length polymorphism（AFLP）J] American Journal of Botany，2007，94（5）：799-808endprint

8]Day J G Cryo-conservation of microalgae and cyanobacteriaJ] Cryo Letters，1998，1：7-14

9]Morris G J Cryopreservation of 250 strains of chlorococcales by the methods of two-step coolingJ] British Phycological Journal，1978，13（1）：15-24

10]ZK（#]Day J G Cryopreservation of microalgae and cyanobacteriaJ] Methods in Molecular Biology，2007，368（368）：141-151

11]蔡小寧，陳舒泛，陳俊，等 小球藻的玻璃化超低溫保存法J] 植物生理學通訊，2004，40（5）：599-601

12]Canavate J P，Lubinn L M Some aspects on the cryopreservation of microalgae used as food for marine speciesJ] Aquaculture，1995，136（34）：277-290

13]Gorlin J Stem cell cryopreservationJ] The Journal of Infusional Chemotherapy，1996，6（1）：23-27

14]王起華，石若夫，程愛華 3種餌料金藻的超低溫保存研究J] 中國水產科學，1999，6（2）：89-92

15]林小園，劉紅全，袁衛生 海洋微藻的玻璃化凍存技術研究進展J] 江蘇農業科學，2014，42（1）：190-194

16]閆立強，趙樹仁，程愛華，等 兩種藍藻超低溫保存抗凍保護劑的研究J] 遼寧師范大學學報（自然科學版），1993（2）：153-155

17]Wusteman M C，Pegg D E Differences in the requirements for cryopreservation of porcine aortic smooth muscle and endothelial cellsJ] Tissue Engineering，2001，7（5）：507-518

18]王起華，張恩棟，周春影 藻類種質超低溫保存研究概況J] 植物學通報，2002，19（1）：21-29endprint