2種綠藻的玻璃化凍存研究

劉紅全　袁莎　林小園　李潔瓊　龍寒　禤金彩　何秀苗

摘要：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期細(xì)胞，采用不同配方及濃度的玻璃化凍存液以及不同的凍存步驟對(duì)膠網(wǎng)藻HE01和小球藻HE07進(jìn)行冷凍保存試驗(yàn)，通過(guò)復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率判斷適合的凍存液和凍存步驟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的微藻所需的凍存液不同。對(duì)HE01和HE07海洋微藻分別使用5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液和15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖溶液做為凍存劑，4 ℃條件下30 min后，轉(zhuǎn)入-20 ℃預(yù)凍存2 h，再-80 ℃過(guò)夜后投入液氮中保存，膠網(wǎng)藻HE01和小球藻HE07的凍存率分別為702%、7059%。復(fù)蘇后微藻生長(zhǎng)狀況良好。

關(guān)鍵詞：膠網(wǎng)藻；小球藻；玻璃化凍存；抗凍保護(hù)劑

中圖分類號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0183-03

收稿日期：2016-05-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30960215）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：桂科青0728019）；廣西民族大學(xué)相思湖青年學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：劉紅全（1975—），男，黑龍江人，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：lhongquan@163com。

微藻結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖迅速、易于培養(yǎng)、能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。藻類的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)容易引起藻種污染，生命力減退以及藻種的基因漂變1-2]，給藻種的保存、研究以及大規(guī)模培養(yǎng)帶來(lái)眾多不便。目前，在微藻保存中的方法有固定化保存，繼代保存和超低溫凍存法3]。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中有其弊端，如繼代培養(yǎng)在多次接種過(guò)程中藻種容易污染和逐漸老化，生命力減退。固定化保種程序復(fù)雜，大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會(huì)從膠珠中溢出4-5]。自1985年Rall等首次將小鼠胚胎細(xì)胞運(yùn)用玻璃化凍存的方式成功凍存6]以來(lái)，玻璃化凍存的應(yīng)用越來(lái)越廣。玻璃化凍存技術(shù)不僅可以克服在藻種多次接種下導(dǎo)致的污染、基因漂變問(wèn)題，還可以在超低溫條件下殺死有害細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)藻種長(zhǎng)期保存的目的7]。微藻玻璃化凍存的成功報(bào)道也越來(lái)越多8-10]。小球藻（Chlorella）具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，膠網(wǎng)藻（Dictyosphaerium）產(chǎn)油脂量較高，對(duì)它們進(jìn)行成功低溫保存將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用這2種綠藻奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對(duì)膠網(wǎng)藻和小球藻的玻璃化凍存進(jìn)行了研究。

1材料與方法

11藻種來(lái)源及其培養(yǎng)

膠網(wǎng)藻HE01與小球藻HE07分離于廣西沿海紅樹(shù)林的水樣中。2種綠藻培養(yǎng)于F2培養(yǎng)基中，在（24±1）℃、光照度（4×40 W日光照射）、光—暗周期為12 h—12 h的條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的藻液用于試驗(yàn)。

12抗凍保護(hù)劑的選擇

JP3]在蔡小寧等的試驗(yàn)方法11]上做出改進(jìn)，選取10% DMSO+10%乙二醇+30%蔗糖+F2培養(yǎng)基為玻璃化凍存液配方。分別在此基礎(chǔ)上改變DMSO、乙二醇與蔗糖濃度。DMSO濃度梯度為5%、10%、15%、20%、25%；乙二醇濃度梯度為5%、10%、15%、20%、25%；蔗糖濃度梯度為10%、15%、20%、25%、30%。在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)選用濃度為單因素優(yōu)化最佳值與左右相鄰值。

13玻璃化凍存

131預(yù)處理

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2種藻細(xì)胞置于4 ℃的環(huán)境下暗培養(yǎng)48 h。提高藻種的耐寒性。

132預(yù)平衡

取預(yù)培養(yǎng)后的藻細(xì)胞4 mL，經(jīng)離心濃縮后分別加入稀釋2倍的玻璃化凍存液和培養(yǎng)基預(yù)平衡5 min，離心去除平衡液，迅速加入玻璃化凍存液或培養(yǎng)基分裝到2 mL的凍存管中，每管500 μL。

133凍存步驟對(duì)微藻凍存率的影響

分別將2種藻迅速放入到液氮罐中或者在4 ℃凍存30 min后，移到-20 ℃凍存2 h再移到-80 ℃條件下過(guò)夜后投入到液氮罐中。

134解凍和凍存液的去除

將在液氮中保存24 h后的藻種取出，立即放入40 ℃恒溫水浴鍋快速解凍。化凍后的微藻在無(wú)菌條件下室溫平衡20 min后加入3倍體積培養(yǎng)基離心去除溶液，用培養(yǎng)基重復(fù)洗滌2～3次。

135凍存后的恢復(fù)培養(yǎng)

將去除凍存液的藻細(xì)胞接種到新鮮培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)入到光照培養(yǎng)。

14藻細(xì)胞存活率的測(cè)定

參照Canavate等的方法12]，取恢復(fù)培養(yǎng)后的藻細(xì)胞接入F2培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后，采用752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定藻液的D680 nm值。并以未凍存的藻細(xì)胞作對(duì)照。

存活率=解凍后藻液的D680 nm值未凍存藻液的D680 nm值×100%。

2結(jié)果

21蔗糖濃度對(duì)凍存率的影響

未加入凍存液的2種藻的存活率均為0，可以看出2種微藻對(duì)超低溫均沒(méi)有耐受性。隨著蔗糖的濃度增加，2種海洋綠藻的存活率顯著增加。當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到25%的時(shí)候存活率最高，HE01為6375%，HE07為6036%（圖1）。

22DMSO濃度對(duì)凍存率的影響

當(dāng)DMSO濃度為10%的時(shí)候2種綠藻凍存率最高，HE01和HE07凍存率分別為616%、5526%（圖2）。這一結(jié)果與蔡小寧等的研究11]相符。一般認(rèn)為，DMSO的高極性使其易于透過(guò)細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)外形成高滲透壓，因此DMSO穿透能力較強(qiáng)并且具有更好的保護(hù)效果，防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞13]。

23乙二醇濃度對(duì)凍存率的影響

乙二醇可迅速滲入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙二醇在濃度為10%的時(shí)候海洋微藻凍存率最高，HE01和HE07凍存率分別為6127%、6144%（圖3）。endprint

24正交試驗(yàn)結(jié)果

玻璃化凍存液試驗(yàn)因子對(duì)2種海洋微藻的的存活率有明顯影響（表2、表3、表4）。影響存活率的因素主次順序是：DMSO濃度>蔗糖濃度>乙二醇濃度。根據(jù)k值可以得到適合HE01的最佳玻璃化凍存條件為5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培養(yǎng)基。通過(guò)凍存試驗(yàn)HE01的存活率為702%，高于正交試驗(yàn)中的存活率。適合HE07最佳玻璃化凍存的條件為15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖+F2培養(yǎng)基，由正交試驗(yàn)可以看出存活率為7059%。因此，綜合考慮HE01的玻璃化液最優(yōu)組合水平為5% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖，HE07的玻璃化液最優(yōu)組合條件為15% DMSO+15%乙二醇+25%蔗糖。

25凍存步驟對(duì)冷凍保存存活率的影響

相較于未分步凍存的HE01存活率為556%， 分步凍存的HE01存活率提高為672%（圖4）；經(jīng)過(guò)分步凍存的HE07存活率為689%，高于未分步凍存414%的存活率（圖5）。反映出充分的預(yù)凍處理是保證玻璃化凍存的成功條件之一。

FK（W11]TPLHQ4tif]

26凍存后2種綠藻的生長(zhǎng)情況

凍存后恢復(fù)培養(yǎng)的2種綠藻細(xì)胞其生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果（圖6、圖7）表明，冷凍組與對(duì)照組的生長(zhǎng)規(guī)律一致，在生長(zhǎng)前期，凍存的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，但在對(duì)數(shù)后期，凍存組的活性恢復(fù)，生長(zhǎng)速度和對(duì)照組差別不大。

FK（W11]TPLHQ6tif]

3討論

影響微藻低溫冷凍存活率的因素有很多，包括冷凍劑、藻種、冷凍步驟等等14]。針對(duì)不同的藻種，也要對(duì)其玻璃化凍存液進(jìn)行特定的優(yōu)化。將不同的凍存保護(hù)劑聯(lián)合使用進(jìn)行玻璃化凍存，可以使防凍劑的液體黏滯度升高，液體分子的彌散運(yùn)CM（25]動(dòng)被抑制，從而加強(qiáng)冷凍效果和減輕毒性。DMSO、蔗糖、

FK（W11]TPLHQ7tif]

乙二醇是最常用的抗凍保護(hù)劑。蔗糖可以限制水分過(guò)快進(jìn)入細(xì)胞，為細(xì)胞提供一個(gè)高滲環(huán)境，增加抗動(dòng)力的同時(shí)又充分脫水，避免凍存時(shí)冰晶形成造成傷害，也避免解凍時(shí)發(fā)生滲透性休克，起到特異性保護(hù)作用15]。結(jié)果表明在所示的濃度范圍內(nèi)，蔗糖濃度越低導(dǎo)致微藻存活率越低。乙二醇與DMSO都是常見(jiàn)的滲透性冷凍保護(hù)劑。乙二醇可迅速滲入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。DMSO的高度水溶性使其易于透過(guò)細(xì)胞膜并形成高滲透壓，補(bǔ)償了細(xì)胞內(nèi)外存在的鹽梯度，因此可防止細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成和細(xì)胞膜的破壞。但DMSO具有一定的毒性，能導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。閆立強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)，DMSO對(duì)微藻的毒性大小既與微藻種類有關(guān)，也與DMSO濃度有關(guān)16]。如圖2所示，隨著DMSO濃度由10%逐漸增加，2種微藻的凍存率也越來(lái)越低。這是因?yàn)楦邼舛鹊腄MSO對(duì)微藻有較大毒性，導(dǎo)致了微藻細(xì)胞的死亡。10%濃度的DMSO是介于微藻細(xì)胞毒性與細(xì)胞保護(hù)之間的一個(gè)臨界點(diǎn)。不同的微藻由于細(xì)胞壁的不同對(duì)凍存劑的耐受力不同，導(dǎo)致每種微藻的抗凍保護(hù)劑不同。在冷凍過(guò)程中，常將幾種保護(hù)劑混合起來(lái)使用，既保證了抗凍性也降低了單一保護(hù)劑高濃度的毒性。

在做預(yù)處理時(shí)冷凍保護(hù)劑與細(xì)胞接觸的溫度和時(shí)間需要進(jìn)行嚴(yán)格控制，試驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)行預(yù)凍存處理效果好于將藻種直接投入到液氮當(dāng)中。因?yàn)榈蜏丨h(huán)境可以降低DMSO的毒性17]，同時(shí)細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑預(yù)先接觸可提高細(xì)胞對(duì)滲透壓突變的耐受性。通過(guò)控制海洋微藻凍存的內(nèi)外條件，本試驗(yàn)凍存的2種海洋綠藻，存活率都達(dá)到了66%以上。

玻璃化凍存法研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但是適合于一種藻種的方法對(duì)另一種藻可能并不適用。針對(duì)這一領(lǐng)域，還有許多問(wèn)題需要做進(jìn)一步的探討與研究。如微藻化凍后的材料處理，活化復(fù)蘇培養(yǎng)所需的條件18]，抗凍性與細(xì)胞年齡等，有待更深入的研究。

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