穿心蓮內酯高壓液相色譜純化技術研究

孫寶勝　徐存寬　薛云才　吳本剛

摘要：以穿心蓮提取物為試驗原料，采用動態軸向壓縮制備色譜技術進行分離純化，以制備高純度穿心蓮內酯。制備柱裝填純化材料：硅膠基質C18 10 μm，裝填質量300 g，實測柱床規格50 mm×250 mm。以甲醇水為流動相進行純化工藝優化，結果表明，甲醇水體系下水相添加005 molL乙酸銨能促進穿心蓮內酯的溶解，該體系下穿心蓮內酯最佳純化工藝條件：流動相55%甲醇水+45% 005 molL乙酸銨緩沖液，流速600 mLmin；檢測波長254 nm，溫度為室溫。

關鍵詞：穿心蓮內酯；分離純化；制備色譜；工藝優化

中圖分類號： R2842文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0202-03

收稿日期：2016-05-25

基金項目：江蘇省自然科學基金青年基金（編號：20150500）；江蘇大學高級人才科研啟動基金（編號：15JDG070）。

作者簡介：孫寶勝（1983—），男，山東菏澤人，碩士，助理工程師，主要從事藥食同源植物活性成分提取分離技術以及功能活性評價研究。Tel：（0523）86086656；E-mail：s_baosheng@163com。

通信作者：吳本剛，博士研究生，講師，主要從事食品功能成分提取及其活性評價研究。Tel：（0511）88795305；E-mail：wubg@ujseducn。

穿心蓮Andrographis paniculata（Burm f） Nees]為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis Wall ex Nees）植物，別稱一見喜、苦草、四方草、印度草等1]，在中國、印度、馬來西亞等國具有悠久的民間藥用史，在國內主要分布在廣東省、廣西壯族自治區、福建省、四川省等省（區），以廣西壯族自治區種植面積最大2]。

穿心蓮植株所含穿心蓮內酯是目前穿心蓮制劑的主要活性成分3]，其分子式為C20H30O5，在穿心蓮葉中含量高達 184%。現代藥理研究表明，穿心蓮內酯具有抗炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、治療心腦血管疾病、保肝利膽、抗腫瘤等作用，具有毒性小、價格低的特點。穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫等功效，在臨床上用于治療呼吸道感染、急性菌痢、腸胃炎等疾病4-5]，還具有防治心血管疾病、抗腫瘤、保肝利膽、免疫調節等多重功效6-7]，在我國已作為穿虎寧、穿心蓮注射液等解熱鎮痛藥的原料大量生產8-9]。

穿心蓮內酯提取主要采用乙醇直接提取法、水提法、超聲波輔助提取法、酶解輔助提取法等方法，在此基礎上進一步采用大孔樹脂吸附和結晶等方法進一步純化10]。范云鴿等采用ADS-7樹脂對傳統的乙醇回流提取液進行純化，分離干燥后得到的浸膏中穿心蓮內酯含量達253%11]。本試驗原料為穿心蓮經乙醇水提取、大孔樹脂純化后粗品，在此基礎上采用反相高壓液相色譜對其進一步純化，優化工藝條件以獲得高純度的產品，旨在為穿心蓮內酯的精制提供工藝參考。

1材料與方法

11試劑

甲醇（AR），國藥集團化學試劑有限公司生產；娃哈哈牌飲用純凈水，自制去離子水；乙酸銨（AR），國藥集團化學試劑有限公司生產；9958%穿心蓮內酯對照品，46%穿心蓮內酯乙醇水粗提物。

12儀器及設備

Waters 2695—2998高效液相色譜儀；Waters Sunfire C18 5 μm 46 mm×250 mm色譜柱，柱恒溫箱；創新牌制備型50DAC液相色譜儀；裝填普通C18填料色譜柱300 g，實測柱床高度250 mm，柱床直徑50 mm；萬分之一分析天平（賽多利斯公司）；超聲波清洗機。

13試驗方法

131標準曲線建立

標準曲線測試液相方法：Waters 2695—2998高效液相色譜儀，Sunfire C18 46 mm×250 mm柱，流動相甲醇 ∶水=55 ∶45，水相中含有01%乙酸，進樣體積5 μL，柱溫度25 ℃，流速1 mLmin，以質量濃度為橫坐標和峰面積為縱坐標作標準曲線。

準確稱取0010 0 g純度9958%對照品，用甲醇定容至50 mL，超聲混勻，配制020 mgmL標準液，依次稀釋得到 020、010、006、004、002 mgmL梯度標準溶液，進Waters液相測試，鑒于該物質溶解度較低，故采取增大進樣體積方式增大進樣量，分別進樣10 μL和15 μL作為 04 mgmL 和06 mgmL濃度標準曲線點。

132甲醇水流動相體系下保留時間優化

為考察穿心蓮內酯在該C18柱甲醇水體系下的保留性能，用穿心蓮對照品做試驗樣品考察合適該物質的甲醇比例。試驗初始條件：流速600 mLmin，定量環進樣300 μL，波長254 nm，溫度為室溫。

穿心蓮內酯溶解較差，相對其他有機試劑，其在甲醇、乙醇中溶解性相對較好。從可行性和經濟方面考慮，本試驗有機相優先考慮甲醇。因該部分試驗主要考察穿心蓮內酯保留時間，故試驗樣品采用對照品，可以有效節約色譜系統凈化時間和保護色譜系統。

根據文獻資料和該物質理化性質，選用70%、60%、52%、50%甲醇水流動相比例進行試驗。考察穿心蓮內酯在試驗條件下的保留時間參數，得出在該純化填料下較為合理的保留時間。

133穿心蓮內酯溶解量優化

由前期試驗可知，制備時甲醇比例50%～60%為宜，該條件下穿心蓮內酯保留時間在 12～28 min。色譜純化過程工藝中，樣品的溶解性決定制備效率，因而有必要對穿心蓮內酯的溶解性進一步優化。本試驗中，樣品采用50%甲醇水溶解，在水相中加入005 molL乙酸銨改變溶液理化性質，以期增大其溶解度。endprint

配制50%甲醇、50%乙酸銨水溶液，取7支規格50 mL離心管，標號0、1、2、3、4、5、6，0號加入20 mL 50%甲醇水和 400 mg 原料藥，1～6號分別加入50%乙酸銨水混合溶液 20 mL，依次加入46%粗品原料100、200、300、400、600、1 200 mg，充分搖勻并超聲促溶3 min，取出密閉靜置過夜。次日以8 400 rmin離心10 min，取上清液，過 022 μm 有機濾膜，分別上Waters液相測試，每組做3個平行，根據標準曲線計算溶解度。

134制備優化試驗

以純度46%穿心蓮為原料，以甲醇+乙酸銨水溶液（005 molL）為流動相，根據雜質分離情況對流動相甲醇比例進行適當再優化。

46%粗品溶解液：根據“133”節試驗結果，采用最大溶解方式溶解，過045 μm濾膜過濾備用。

2結果與分析

21標準曲線

以穿心蓮內酯質量濃度為橫坐標，以對應濃度條件下色譜峰面積為縱坐標作標準曲線。

由圖1可知，穿心蓮內酯在002～060 mgmL濃度范圍內線性關系良好，相關系數r2為0999 9。

22流動相中有機相甲醇比例優化

根據已知文獻以及穿心蓮內酯在C18柱上的保留性質，在優化流動相時，優先使用70%甲醇水流動相作為洗脫條件。

由圖2可知，70%甲醇水條件下保留時間為83 min，保留時間較短，若作為粗品的純化方法則易出現目標物與雜質分離度小的情況，故有必要進一步降低甲醇比例，增大保留時間。60%、52%、50%甲醇流動相條件下的色譜分別如圖3、圖4、圖5所示。

分析色譜圖（圖3至圖6）可知，60%、52%、50%甲醇流動相條件下，穿心蓮內酯的保留時間分別為1303、2300、2760 min。由此可知，甲醇比例在50%～60%時，穿心蓮內酯保留時間為 12～28 min，保留時間適中。該甲醇比例條件下，制備周期較短且有可能獲得較好的分離度。綜合分析各條件下穿心蓮內酯保留時間，暫將52%甲醇水流動相作為進一步優化的基礎條件，并在此基礎上進行后續試驗。

23穿心蓮內酯溶解量試驗

根據“133”節溶解量試驗方案，得出各物料比條件下穿心蓮內酯的濃度。由表1可知，20 mL混合溶液加入 600 mg 原料時，穿心蓮內酯溶解度達416 mgmL。

以50%甲醇、50%乙酸銨水溶液為溶劑，加入1200 g 46%的原料藥和20 mL溶劑，常溫下得到530 mgmL穿心蓮內酯溶液。乙酸銨、甲醇水溶液溶解樣品后得到澄清色液體，甲醇水溶液條件下得到的溶液渾濁，呈現青黃色且透光度較差，說明在甲醇水溶液基礎上，加入乙酸銨能有效提高物質的溶解性。

24制備條件下甲醇乙酸銨水優化試驗

根據“22”節試驗，初步確立52%甲醇水基礎流動相；由“23”節試驗結果可知，在甲醇水乙酸銨體系下，穿心蓮內酯粗溶解濃度較好。以該溶液作為色譜制備工藝進樣原料，在此流動相和溶解量基礎上進一步對工藝進行優化。

“22”節試驗已經研究了甲醇比例對穿心蓮內酯溶解度的影響，因而本次試驗只在原來基礎上進行細微優化。首先考察52%甲醇水乙酸銨體系下穿心蓮內酯粗品分析圖譜，進樣體積和檢測波長等參數不變。

由圖6分析可知，穿心蓮內酯保留時間2250 min，但目標峰后存在一明顯雜質峰且分離度較差，不利于制備分離純化。

前期試驗結果表明，提高流動相中甲醇的比例，穿心蓮內酯保留時間變短。由圖6可知，目標物質峰和前雜質峰分離度較好，因此將流動相中甲醇比例提高到55%，乙酸銨水溶液比例為45%，其他條件不變，進樣分析。

由圖7可知，該制備條件下主峰與雜質峰分離效果較好，雜質峰4和峰6與目標物質分離度大，且目標峰保留時間為175 min，故該流動相條件下目標物質有效分離且縮短了制備時間。

25制備工藝放大試驗

使用“23”節中6號溶解液，穿心蓮內酯含量約為 530 mgmL；流動相：55%甲醇、45% 005 molL乙酸銨緩沖液；模擬制備色譜柱：某公司C18 10 μm 46 mm×250 mm。穿心蓮內酯溶解量不高，故放大試驗采取增大上樣體積的方式。進樣120 mL，得制備色譜如圖8所示。

收集穿心蓮整峰，進樣測定，按峰面積歸一化法計算，穿心蓮內酯含量9990%，因收集整個主峰，故而回收率接近100%。

當進樣120 mL時，制備回收率和目標物質純度均較高，為提高制備效率，需進一步增大上樣體積，以提高上樣量。其他參數不變條件下進樣1200 mL，得圖9所示色譜圖。

如圖9所示，制備時按下述方法收集：收集峰1峰起至后峰肩餾分并標號為F1；收集峰1后峰肩至峰尾餾分并標號為F2。

按峰面積歸一化法計，餾分F1穿心蓮內酯含量為 9927%，有效回收率占8600%（圖10）。F2餾分內酯含量為8900%，后雜質含量為1084%，根據峰面積粗略計算，該段餾分中穿心蓮內酯占總內酯的2%。

3結論

穿心蓮內酯在002～060 mgmL濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0999，可用于穿心蓮內酯定量分析。

經甲醇乙酸銨水體系優化，穿心蓮內酯溶解度有效提高，溶解量達到530 mgmL。

常溫制備條件下，純穿心蓮內酯上樣體積1200 mL，上樣量為6360 mg，上樣量占柱填料質量百分比約為02%。餾分中穿心蓮內酯純度9927%，回收率為8600%。

參考文獻：

1]ZK（#]靳鑫，時圣明，張東方，等 穿心蓮化學成分的研究J] 中草藥，2012，43（1）：47-50

2]邵艷華 穿心蓮種質資源及其質量評價研究D] 廣州：廣州中醫藥大學，2015

3]李志亨，路新華，龍曉英，等 穿心蓮內酯的研究進展J] 時珍國醫國藥，2012（11）：2854-2857

4]管晨，李敏，任慶杰，等 穿心蓮內酯通過抗炎和調節免疫提高EV71感染小鼠的生存率J] 免疫學雜志，2013，29（9）：737-744

5]程慧娟，劉江，張庚 穿心蓮內酯抗銅綠假單胞菌生物被膜及與阿奇霉素協同抗菌作用J] 中國微生態學雜志，2012，24（2）：120-123

6]Sheeja K，Guruvayoorappan C，Kuttan G Antiangiogenic activity of Andrographis paniculata extract and andrographolideJ] International Immunopharmacology，2007，7（2）：211-221

7]Chao W W，Kuo Y H，Lin B F Anti-inflammatory activity of new compounds from Andrographis paniculata by NF-kappaB transactivation inhibitionJ] Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（4）：2505-2512

8]李曙光，葉再元 穿心蓮內酯的藥理活性作用J] 中華中醫藥學刊，2008，26（5）：984-986

9]王艷輝，王伽伯，郝慶秀，等 不同產地穿心蓮的含量測定，化學指紋圖譜及抑菌活性評價J] 中國實驗方劑學雜志，2014，20（9）：77-82

10]ZK（#]徐靚 穿心蓮內酯的提取及純化工藝研究D] 成都：成都理工大學，2007

11]范云鴿，張秀莉，史作清，等 大孔吸附樹脂提取穿心蓮總內酯的研究J] 離子交換與吸附，2002，18（1）：30-35endprint