高產(chǎn)香乳酸菌菌株的選育

杜磊　楊利玲　孔雪麗

摘要：以從市售酸奶花花牛中分離出的10株保加利亞乳桿菌和10株嗜熱鏈球菌為研究對(duì)象，通過紫外誘變后，采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法，篩選出高產(chǎn)乙醛和高產(chǎn)雙乙酰的菌株，最終確定最佳誘變參數(shù)為紫外照射波長 365 nm、垂直照射距離15cm、照射時(shí)間為120 s。篩選出的高產(chǎn)乙醛菌株為L-22、L-2a、L-2D 菌株，產(chǎn)乙醛量分別為1351、1652 、1446 μgmL，相比出發(fā)菌株（1265 μgmL）分別增加了68%、306%、143%。篩選出的高產(chǎn)雙乙酰菌株為S-14、S-1d菌株，產(chǎn)雙乙酰量分別為336、416 μgmL，相比出發(fā)菌株（296 μgmL）分別增加了135%、405%。通過對(duì)酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這2株主要產(chǎn)香菌株產(chǎn)香特性的研究，為高產(chǎn)香酸奶的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；紫外誘變；乙醛；雙乙酰

中圖分類號(hào)： TS252文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0285-04

HJ14mm]

收稿日期：2016-06-20

基金項(xiàng)目：安陽工學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目。

作者簡介：杜磊（1980—），男，河南安陽人，碩士，講師，主要從事乳制品研究。E-mail：ayspwswx@163com。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)和人民生活水平的提高，人們對(duì)酸奶營養(yǎng)成分的關(guān)注意識(shí)逐步增強(qiáng)，對(duì)酸奶的外觀特性（風(fēng)味、口感、品質(zhì)）也是越來越重視。但是酸奶具有良好的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值，這無疑使其在快節(jié)奏的生活中占據(jù)了越來越重要的地位。各種各樣的添加劑賦予了酸奶良好的風(fēng)味，但是人們更為擔(dān)心的是這些添加劑會(huì)給人帶來的負(fù)面影響，于是對(duì)乳酸菌的品質(zhì)提出了更高要求。菌株的發(fā)酵性能直接影響到酸奶的發(fā)酵質(zhì)量，對(duì)酸奶的產(chǎn)香也有很大的影響。應(yīng)用于乳制品加工的發(fā)酵微生物主要是乳酸菌，構(gòu)成牛乳主體香味的物質(zhì)主要是雙乙酰、乙醛、二甲硫醇、脂肪酸、酮類、內(nèi)酯等。其中，對(duì)乳制品香味起到主要調(diào)節(jié)作用的是雙乙酰和乙醛。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別為雙乙酰和乙醛的主要產(chǎn)生菌種1-2]。本研究選取從市售酸奶中分離篩選出的產(chǎn)香性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變，篩選出高產(chǎn)香菌株，并將其應(yīng)用于酸奶發(fā)酵中，提高酸奶的品質(zhì)。

1材料與方法

11材料與試劑

菌株：從市售花花牛酸奶中分離得到保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。主要試劑：脫脂乳粉，食品級(jí)，內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；花花牛酸奶，食品級(jí)，河南花花牛乳業(yè)有限公司；葡萄糖，分析純，天津北辰方正試劑廠；吐溫 80、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸氫二鉀、硫代硫酸鈉，分析純，天津市北方化玻購銷中心；乙酸鈉，分析純，北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司；硫酸鎂，分析純，北京57601化工廠；硫酸錳，分析純，河南焦作市化工三廠；鄰苯二胺，分析純，三遠(yuǎn)化工有限公司。

12 儀器與設(shè)備

DZKW-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-1C電子顯微鏡，浙江寧波市鎮(zhèn)海中華電子儀表廠；ZXGP-A2160電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1810DASPC分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；22331超高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；SW-CJ-2FD垂直流雙人單面超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CBIO-UV8C紫外線誘變箱，北京賽百奧科技有限公司。

13試驗(yàn)方法

該試驗(yàn)的具體技術(shù)路線如下：從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌3-5]，從中選出產(chǎn)雙乙酰和乙醛較好的菌株，經(jīng)過增菌培養(yǎng)富集菌體，再離心獲得菌體6]，通過不同條件的紫外線誘變7-14]得到誘變菌株，并對(duì)其產(chǎn)香性能進(jìn)行測(cè)定15-20]，選出優(yōu)良產(chǎn)香菌株。

131主要培養(yǎng)基

1311脫脂乳培養(yǎng)基配制方法按1 g ∶10 mL的比例將適量的脫脂乳粉加蒸餾水溶解，密封置于滅菌鍋中115 ℃蒸汽滅菌10～15 min，經(jīng)高壓滅菌后置于冰箱中備用。

1312MRS培養(yǎng)基固體MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏10 g，瓊脂20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂058 g，硫酸錳 025 g，蒸餾水 1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。液體MRS培養(yǎng)基的配制參照固體培養(yǎng)基，將上述固體MRS培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。

1313M17培養(yǎng)基固體M17培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母浸膏5 g，硫酸鎂025 g，甘油10 g，乳糖3 g，磷酸氫二鉀5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L。液體M17培養(yǎng)基只需將上述固體M17培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。

132菌種分離

將菌種稀釋成不同稀釋梯度的菌懸液。用移液槍分別吸取10-4、10-5、10-6 3個(gè)試管中的菌懸液 01 mL 滴在MRS、M17 2種固體培養(yǎng)基表面中央位置，用無菌玻璃涂布棒將菌液均勻涂開，靜置數(shù)分鐘，使菌液浸入培養(yǎng)基。將平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 d。

133保加利亞乳桿菌的誘變前準(zhǔn)備

用上步中得到的保加利亞乳桿菌菌株制作發(fā)酵劑，并活化3代，以2%接種量將菌種接入滅菌脫脂乳中，37 ℃培養(yǎng)16 h20]，通過檢測(cè)脫脂乳的酸度、產(chǎn)乙醛的量，確定產(chǎn)香性能好的菌株作為出發(fā)菌株。將純化的出發(fā)保加利亞乳桿菌菌種接種至配制的MRS液體培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后每隔4 h取出2個(gè)試管作為平行組，滴定檢測(cè)其酸度，繪制保加利亞乳桿菌的生長曲線。根據(jù)上述繪制的生長曲線，選取對(duì)數(shù)生長之后的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)液，在4 ℃下4 000 rmin離心 20 min，棄去上清液，用無菌水洗滌菌體，收集菌體并倒入平板，為誘變做準(zhǔn)備。endprint

134保加利亞乳桿菌的紫外誘變

（1）將倒入平板的菌液于垂直距離紫外燈20 cm處下開蓋照射120 s，紫外線波長分別為254、365 nm。

（2）將倒入平板的菌液在波長為365 nm的情況下，豎直距離紫外燈15、20 cm處照射120 s誘變。

（3）將倒入平板的菌液于波長為365 nm，距離紫外燈20 cm處，分別照射60、120、180 s。

將未經(jīng)照射的和經(jīng)過紫外照射的菌液分別計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。致死率=（未照射菌數(shù)-照射后菌數(shù)）未照射菌數(shù)]×100%。從致死率90%左右的平板中，挑選5個(gè)單菌落，接種至脫脂乳中培養(yǎng)至凝乳，測(cè)定產(chǎn)乙醛性能。

135嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香性能測(cè)定

將分離純化得到的嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，接種至脫脂乳，42 ℃培養(yǎng) 14 h 后1]，檢測(cè)產(chǎn)雙乙酰的量，確定產(chǎn)雙乙酰量最多的作為出發(fā)菌株。

136嗜熱鏈球菌的誘變前準(zhǔn)備及誘變

嗜熱鏈球菌的誘變前準(zhǔn)備方法與保加利亞乳桿菌相同，只是將MRS培養(yǎng)基改為M17培養(yǎng)基。嗜熱鏈球菌接下來的操作參照保加利亞乳桿菌的處理。

14評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定方法

保加利亞乳桿菌乙醛產(chǎn)量的檢測(cè)參照劉鵬等的檢測(cè)方法20]。嗜熱鏈球菌雙乙酰產(chǎn)量的檢測(cè)參照王丹等的檢測(cè)方法17]。用吉爾涅爾度（°T）來表示滴定酸度。采用MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基測(cè)定酸奶中乳酸菌總菌數(shù)。吸光度的測(cè)量采用分光光度計(jì)，波長335 nm。

2結(jié)果與分析

21菌種分離

通過菌種分離，得到了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。分離效果見圖1、圖2。

FK（W12]TPDL1tif]

22保加利亞乳桿菌的誘變與檢測(cè)

221保加利亞乳桿菌產(chǎn)香菌株的初步篩選

從純化后的平板上取10個(gè)疑似目標(biāo)菌落，活化3代以后，分別接種至脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，檢測(cè)其產(chǎn)乙醛的情況（表1）。

從表1可以看出，2號(hào)菌株的產(chǎn)乙醛量明顯優(yōu)于其他菌株，為（1265±017） μgmL，確定2號(hào)菌株為出發(fā)菌株。

222保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長曲線的繪制

保加利亞乳桿菌的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，單個(gè)菌種的生長曲線都呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢(shì)，并且2個(gè)菌種都是在32 h左右滴定酸度的變化不再明顯，可以確定32 h為菌種繁殖量最大的時(shí)間點(diǎn)。選取32 h作為制備菌懸液的最佳時(shí)間。

223保加利亞乳桿菌的紫外誘變

按照前述的誘變方法，保加利亞乳桿菌的誘變結(jié)果見表2。隨著紫外波長的增大，致死率逐漸增大，因此選擇致死率最大的365 nm為最佳誘變劑量；垂直誘變距離為15 cm時(shí)的致死率相對(duì)較高，為935%，因此選擇15 cm為最佳誘變劑量；誘變時(shí)間為120 s時(shí)致死率相對(duì)較高，為984%，而且菌株生長更好，因此選擇120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，保加利亞乳桿菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長365 nm、垂直誘變距離 15 cm、誘變時(shí)間120 s。

224誘變之后保加利亞乳桿菌的產(chǎn)香檢測(cè)

從誘變后篩選出的高死亡率的平板中分別挑出5個(gè)保加利亞乳桿菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)16 h，菌株的產(chǎn)香情況見表3。

從表3可以看出， 誘變波長為365 nm時(shí)， 菌株的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中L-21、L-24的產(chǎn)乙醛量較出發(fā)菌株均下降；菌株L-22的產(chǎn)乙醛量相對(duì)較高，為最佳菌株。誘變距離為15 cm時(shí)，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量均有上升，其中菌株L-2a的產(chǎn)乙醛量最高，確定為最佳菌株。誘變時(shí)間為120 s時(shí)，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中菌株L-2D的產(chǎn)乙醛量最高，菌株L-2C的產(chǎn)乙醛量下降，確定L-2D為最佳菌株。

23嗜熱鏈球菌的誘變與檢測(cè)

231嗜熱鏈球菌產(chǎn)香菌株的初步篩選

從純化的平板上挑取10個(gè)嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，按2%的接種量接種至脫脂乳中42 ℃培養(yǎng)14 h，檢測(cè)其產(chǎn)雙乙酰的情況（表4）。

從表4可以看出，1號(hào)菌株的產(chǎn)雙乙酰量相對(duì)較高，為（296±016） μgmL，因此確定S-1為出發(fā)菌株。

232嗜熱鏈球菌的紫外誘變

參照保加利亞乳桿菌的紫外誘變方法，嗜熱鏈球菌的誘變情況見表5。

從表5可以看出，紫外波長為365 nm的時(shí)候，菌株的致死率相對(duì)較高，為955%，因此確定波長365 nm為最佳誘變劑CM（25]量。當(dāng)垂直照射距離為15 cm時(shí)，紫外誘變的致死率相對(duì)較高，為953%，因此選取垂直照射距離15 cm為最佳誘變劑量。誘變時(shí)間為120 s時(shí)，紫外誘變致死率高，為961%，因?yàn)檫x取120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，嗜熱鏈球菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長365 nm、垂直照射距離15 cm、誘變時(shí)間120 s。

233誘變之后嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香檢測(cè)

從誘變后致死率高的平板中分別挑出5個(gè)疑似嗜熱鏈球菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，42 ℃下培養(yǎng)14 h，菌株的產(chǎn)香情況見表6。

從表6可以看出，紫外誘變波長為365 nm時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中S-14的產(chǎn)雙乙酰量最高，所以選取S-14作為最佳菌株。垂直照射距離為15 cm時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中菌株S-1d的產(chǎn)雙乙酰量明顯最高，所以選取S-1d為最佳菌株。誘變時(shí)間為120 s時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所下降，特別是S-1C菌株，產(chǎn)雙乙酰量最少。

3結(jié)論endprint

（1）從市售花花牛酸奶中通過菌種分離和產(chǎn)香檢測(cè)，篩選出高產(chǎn)乙醛的L-2菌株和高產(chǎn)雙乙酰的S-1菌株作為出發(fā)菌株，其中L-2的產(chǎn)乙醛量為1265 μgmL，S-1的產(chǎn)雙乙酰量為296 μgmL。

（2）通過確定最佳誘變參數(shù)（紫外照射波長365 nm、垂直照射距離15 cm、紫外照射時(shí)間120 s），篩選出了保加利亞乳桿菌L-22、L-2a、L-2D為3個(gè)誘變情況下產(chǎn)乙醛量最高的菌株，產(chǎn)量分別為1351、1652、1446 μgmL，相比出發(fā)菌株L-2，分別增加了68%、306%、143%。

（3）與保加利亞乳桿菌同樣的誘變劑量，篩選出了嗜熱鏈球菌S-14、S-1d的產(chǎn)雙乙酰量分別為336、416 μgmL，較出發(fā)菌株分別增加了135%、405%。在產(chǎn)量出現(xiàn)降低的菌株中，S-1C的產(chǎn)雙乙酰量最少，為 188 μgmL，相比出發(fā)菌株降低了365%，表明紫外誘變存在不定向性，有些菌株經(jīng)過紫外誘變后，會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)香性能下降的現(xiàn)象。

（4）本試驗(yàn)通過對(duì)分離得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行誘變和產(chǎn)香檢測(cè)，并與出發(fā)菌株進(jìn)行比較，得到了產(chǎn)香增加的菌株，為生產(chǎn)更具優(yōu)良風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值的酸奶提供了依據(jù)。

（5）本試驗(yàn)采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法檢測(cè)乙醛和雙乙酰，避免了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繁瑣，通過前后量的對(duì)比，使結(jié)果更直觀明了。

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