高產香乳酸菌菌株的選育

杜磊　楊利玲　孔雪麗

摘要：以從市售酸奶花花牛中分離出的10株保加利亞乳桿菌和10株嗜熱鏈球菌為研究對象，通過紫外誘變后，采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法，篩選出高產乙醛和高產雙乙酰的菌株，最終確定最佳誘變參數為紫外照射波長 365 nm、垂直照射距離15cm、照射時間為120 s。篩選出的高產乙醛菌株為L-22、L-2a、L-2D 菌株，產乙醛量分別為1351、1652 、1446 μgmL，相比出發菌株（1265 μgmL）分別增加了68%、306%、143%。篩選出的高產雙乙酰菌株為S-14、S-1d菌株，產雙乙酰量分別為336、416 μgmL，相比出發菌株（296 μgmL）分別增加了135%、405%。通過對酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這2株主要產香菌株產香特性的研究，為高產香酸奶的生產提供了理論依據。

關鍵詞：保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；紫外誘變；乙醛；雙乙酰

中圖分類號： TS252文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0285-04

HJ14mm]

收稿日期：2016-06-20

基金項目：安陽工學院農產品加工與貯藏重點學科項目。

作者簡介：杜磊（1980—），男，河南安陽人，碩士，講師，主要從事乳制品研究。E-mail：ayspwswx@163com。

近年來，隨著科學技術和人民生活水平的提高，人們對酸奶營養成分的關注意識逐步增強，對酸奶的外觀特性（風味、口感、品質）也是越來越重視。但是酸奶具有良好的風味和營養價值，這無疑使其在快節奏的生活中占據了越來越重要的地位。各種各樣的添加劑賦予了酸奶良好的風味，但是人們更為擔心的是這些添加劑會給人帶來的負面影響，于是對乳酸菌的品質提出了更高要求。菌株的發酵性能直接影響到酸奶的發酵質量，對酸奶的產香也有很大的影響。應用于乳制品加工的發酵微生物主要是乳酸菌，構成牛乳主體香味的物質主要是雙乙酰、乙醛、二甲硫醇、脂肪酸、酮類、內酯等。其中，對乳制品香味起到主要調節作用的是雙乙酰和乙醛。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別為雙乙酰和乙醛的主要產生菌種1-2]。本研究選取從市售酸奶中分離篩選出的產香性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為出發菌株，通過紫外誘變，篩選出高產香菌株，并將其應用于酸奶發酵中，提高酸奶的品質。

1材料與方法

11材料與試劑

菌株：從市售花花牛酸奶中分離得到保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。主要試劑：脫脂乳粉，食品級，內蒙古伊利實業集團股份有限公司；花花牛酸奶，食品級，河南花花牛乳業有限公司；葡萄糖，分析純，天津北辰方正試劑廠；吐溫 80、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏，生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸氫二鉀、硫代硫酸鈉，分析純，天津市北方化玻購銷中心；乙酸鈉，分析純，北京北化化學品有限責任公司；硫酸鎂，分析純，北京57601化工廠；硫酸錳，分析純，河南焦作市化工三廠；鄰苯二胺，分析純，三遠化工有限公司。

12 儀器與設備

DZKW-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；XSP-1C電子顯微鏡，浙江寧波市鎮海中華電子儀表廠；ZXGP-A2160電熱恒溫培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1810DASPC分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；22331超高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；SW-CJ-2FD垂直流雙人單面超凈工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司；CBIO-UV8C紫外線誘變箱，北京賽百奧科技有限公司。

13試驗方法

該試驗的具體技術路線如下：從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌3-5]，從中選出產雙乙酰和乙醛較好的菌株，經過增菌培養富集菌體，再離心獲得菌體6]，通過不同條件的紫外線誘變7-14]得到誘變菌株，并對其產香性能進行測定15-20]，選出優良產香菌株。

131主要培養基

1311脫脂乳培養基配制方法按1 g ∶10 mL的比例將適量的脫脂乳粉加蒸餾水溶解，密封置于滅菌鍋中115 ℃蒸汽滅菌10～15 min，經高壓滅菌后置于冰箱中備用。

1312MRS培養基固體MRS培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏10 g，瓊脂20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂058 g，硫酸錳 025 g，蒸餾水 1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。液體MRS培養基的配制參照固體培養基，將上述固體MRS培養基中的瓊脂去掉。

1313M17培養基固體M17培養基：胰蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母浸膏5 g，硫酸鎂025 g，甘油10 g，乳糖3 g，磷酸氫二鉀5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L。液體M17培養基只需將上述固體M17培養基中的瓊脂去掉。

132菌種分離

將菌種稀釋成不同稀釋梯度的菌懸液。用移液槍分別吸取10-4、10-5、10-6 3個試管中的菌懸液 01 mL 滴在MRS、M17 2種固體培養基表面中央位置，用無菌玻璃涂布棒將菌液均勻涂開，靜置數分鐘，使菌液浸入培養基。將平板倒置，放入恒溫培養箱中37 ℃培養2 d。

133保加利亞乳桿菌的誘變前準備

用上步中得到的保加利亞乳桿菌菌株制作發酵劑，并活化3代，以2%接種量將菌種接入滅菌脫脂乳中，37 ℃培養16 h20]，通過檢測脫脂乳的酸度、產乙醛的量，確定產香性能好的菌株作為出發菌株。將純化的出發保加利亞乳桿菌菌種接種至配制的MRS液體培養基。37 ℃培養24 h后每隔4 h取出2個試管作為平行組，滴定檢測其酸度，繪制保加利亞乳桿菌的生長曲線。根據上述繪制的生長曲線，選取對數生長之后的保加利亞乳桿菌培養液，在4 ℃下4 000 rmin離心 20 min，棄去上清液，用無菌水洗滌菌體，收集菌體并倒入平板，為誘變做準備。endprint

134保加利亞乳桿菌的紫外誘變

（1）將倒入平板的菌液于垂直距離紫外燈20 cm處下開蓋照射120 s，紫外線波長分別為254、365 nm。

（2）將倒入平板的菌液在波長為365 nm的情況下，豎直距離紫外燈15、20 cm處照射120 s誘變。

（3）將倒入平板的菌液于波長為365 nm，距離紫外燈20 cm處，分別照射60、120、180 s。

將未經照射的和經過紫外照射的菌液分別計數，計算致死率。致死率=（未照射菌數-照射后菌數）未照射菌數]×100%。從致死率90%左右的平板中，挑選5個單菌落，接種至脫脂乳中培養至凝乳，測定產乙醛性能。

135嗜熱鏈球菌的產香性能測定

將分離純化得到的嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，接種至脫脂乳，42 ℃培養 14 h 后1]，檢測產雙乙酰的量，確定產雙乙酰量最多的作為出發菌株。

136嗜熱鏈球菌的誘變前準備及誘變

嗜熱鏈球菌的誘變前準備方法與保加利亞乳桿菌相同，只是將MRS培養基改為M17培養基。嗜熱鏈球菌接下來的操作參照保加利亞乳桿菌的處理。

14評價指標測定方法

保加利亞乳桿菌乙醛產量的檢測參照劉鵬等的檢測方法20]。嗜熱鏈球菌雙乙酰產量的檢測參照王丹等的檢測方法17]。用吉爾涅爾度（°T）來表示滴定酸度。采用MRS培養基、M17培養基測定酸奶中乳酸菌總菌數。吸光度的測量采用分光光度計，波長335 nm。

2結果與分析

21菌種分離

通過菌種分離，得到了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。分離效果見圖1、圖2。

FK（W12]TPDL1tif]

22保加利亞乳桿菌的誘變與檢測

221保加利亞乳桿菌產香菌株的初步篩選

從純化后的平板上取10個疑似目標菌落，活化3代以后，分別接種至脫脂乳培養基中，37 ℃培養16 h，檢測其產乙醛的情況（表1）。

從表1可以看出，2號菌株的產乙醛量明顯優于其他菌株，為（1265±017） μgmL，確定2號菌株為出發菌株。

222保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長曲線的繪制

保加利亞乳桿菌的生長曲線見圖3。從圖3可以看出，單個菌種的生長曲線都呈現先增加后平緩的趨勢，并且2個菌種都是在32 h左右滴定酸度的變化不再明顯，可以確定32 h為菌種繁殖量最大的時間點。選取32 h作為制備菌懸液的最佳時間。

223保加利亞乳桿菌的紫外誘變

按照前述的誘變方法，保加利亞乳桿菌的誘變結果見表2。隨著紫外波長的增大，致死率逐漸增大，因此選擇致死率最大的365 nm為最佳誘變劑量；垂直誘變距離為15 cm時的致死率相對較高，為935%，因此選擇15 cm為最佳誘變劑量；誘變時間為120 s時致死率相對較高，為984%，而且菌株生長更好，因此選擇120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，保加利亞乳桿菌的最佳誘變參數為紫外波長365 nm、垂直誘變距離 15 cm、誘變時間120 s。

224誘變之后保加利亞乳桿菌的產香檢測

從誘變后篩選出的高死亡率的平板中分別挑出5個保加利亞乳桿菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養基，37 ℃下培養16 h，菌株的產香情況見表3。

從表3可以看出， 誘變波長為365 nm時， 菌株的產乙醛量有升高也有降低，其中L-21、L-24的產乙醛量較出發菌株均下降；菌株L-22的產乙醛量相對較高，為最佳菌株。誘變距離為15 cm時，保加利亞乳桿菌的產乙醛量均有上升，其中菌株L-2a的產乙醛量最高，確定為最佳菌株。誘變時間為120 s時，保加利亞乳桿菌的產乙醛量有升高也有降低，其中菌株L-2D的產乙醛量最高，菌株L-2C的產乙醛量下降，確定L-2D為最佳菌株。

23嗜熱鏈球菌的誘變與檢測

231嗜熱鏈球菌產香菌株的初步篩選

從純化的平板上挑取10個嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，按2%的接種量接種至脫脂乳中42 ℃培養14 h，檢測其產雙乙酰的情況（表4）。

從表4可以看出，1號菌株的產雙乙酰量相對較高，為（296±016） μgmL，因此確定S-1為出發菌株。

232嗜熱鏈球菌的紫外誘變

參照保加利亞乳桿菌的紫外誘變方法，嗜熱鏈球菌的誘變情況見表5。

從表5可以看出，紫外波長為365 nm的時候，菌株的致死率相對較高，為955%，因此確定波長365 nm為最佳誘變劑CM（25]量。當垂直照射距離為15 cm時，紫外誘變的致死率相對較高，為953%，因此選取垂直照射距離15 cm為最佳誘變劑量。誘變時間為120 s時，紫外誘變致死率高，為961%，因為選取120 s為最佳誘變劑量。綜上所述，嗜熱鏈球菌的最佳誘變參數為紫外波長365 nm、垂直照射距離15 cm、誘變時間120 s。

233誘變之后嗜熱鏈球菌的產香檢測

從誘變后致死率高的平板中分別挑出5個疑似嗜熱鏈球菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養基，42 ℃下培養14 h，菌株的產香情況見表6。

從表6可以看出，紫外誘變波長為365 nm時，各個菌株的產雙乙酰量均有所增加，其中S-14的產雙乙酰量最高，所以選取S-14作為最佳菌株。垂直照射距離為15 cm時，各個菌株的產雙乙酰量均有所增加，其中菌株S-1d的產雙乙酰量明顯最高，所以選取S-1d為最佳菌株。誘變時間為120 s時，各個菌株的產雙乙酰量均有所下降，特別是S-1C菌株，產雙乙酰量最少。

3結論endprint

（1）從市售花花牛酸奶中通過菌種分離和產香檢測，篩選出高產乙醛的L-2菌株和高產雙乙酰的S-1菌株作為出發菌株，其中L-2的產乙醛量為1265 μgmL，S-1的產雙乙酰量為296 μgmL。

（2）通過確定最佳誘變參數（紫外照射波長365 nm、垂直照射距離15 cm、紫外照射時間120 s），篩選出了保加利亞乳桿菌L-22、L-2a、L-2D為3個誘變情況下產乙醛量最高的菌株，產量分別為1351、1652、1446 μgmL，相比出發菌株L-2，分別增加了68%、306%、143%。

（3）與保加利亞乳桿菌同樣的誘變劑量，篩選出了嗜熱鏈球菌S-14、S-1d的產雙乙酰量分別為336、416 μgmL，較出發菌株分別增加了135%、405%。在產量出現降低的菌株中，S-1C的產雙乙酰量最少，為 188 μgmL，相比出發菌株降低了365%，表明紫外誘變存在不定向性，有些菌株經過紫外誘變后，會出現產香性能下降的現象。

（4）本試驗通過對分離得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行誘變和產香檢測，并與出發菌株進行比較，得到了產香增加的菌株，為生產更具優良風味和營養價值的酸奶提供了依據。

（5）本試驗采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法檢測乙醛和雙乙酰，避免了制作標準曲線的繁瑣，通過前后量的對比，使結果更直觀明了。

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