堿處理中溫度對不同底物特性木質纖維素結構及酶解的影響

何士成　彭太兵　孫曼鈺　賈士儒　鐘成

摘要：為研究堿法預處理中溫度對不同底物特性的木質纖維素結構及酶解效率的影響，選用檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom，簡稱CKK，以下簡稱檸條）、水稻秸稈、小麥秸稈為原料，用NaOH溶液分別在常溫和高溫條件下進行預處理；通過掃描電鏡（簡稱SEM）分析、傅立葉轉換紅外光譜（簡稱FTIR）分析、X-射線衍射（簡稱XRD）分析等分析預處理后木質纖維素的表面形態、化學成分及結晶度的變化，并用纖維素酶對預處理后的木質纖維素原料進行酶解糖化試驗。SEM和成分分析結果表明，NaOH溶液堿處理能有效去除木質纖維素的木質素成分，破壞致密的物理結構；FTIR圖譜表明，經NaOH溶液處理后，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的木質素結構受到一定程度的破壞，羥基、亞甲基、甲氧基和酯鍵等部分官能團發生斷裂；XRD分析和酶解結果顯示，堿處理能破壞木質纖維素原料中的結晶區，增大原料的孔隙率和內表面積，從而增加纖維素酶的可及性和酶解轉化率，經過24 h酶解后，高溫下堿處理能使水稻秸稈葡聚糖的轉化率高達9487%；其中，溫度又作為一個重要的因素影響NaOH溶液堿處理的效果，當溫度升高時，NaOH溶液堿處理對木質素的去除效果更好，對底物的物理結構破壞更嚴重，因此升高溫度會促進NaOH溶液堿處理的作用效果。

關鍵詞：堿法預處理；溫度；木質纖維素；檸條；水稻秸稈；小麥秸稈；成分分析；酶解糖化

中圖分類號： TQ3513；TQ91文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0292-05

收稿日期：2016-06-15

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（編號：201503135-15）。

作者簡介：何士成（1991—），男，山東棗莊人，碩士，主要從事木質纖維素生物質降解研究。E-mail：hsctust@163com。

通信作者：鐘成，博士，教授，主要從事纖維素的生物合成代謝與降解機制研究。E-mail：czhong@tusteducn。

能源危機與環境壓力一直迫使人們尋求一種可代替現有化石能源的新能源，木質纖維素是地球上大量存在的一種極具開發潛力的可再生能源。中國木質纖維素資源豐富，僅農作物秸稈年產生量就有約7億t，林木枝葉和林業廢棄物約 9億t1]。木質纖維素是一種具有高度結晶區、結構非常穩定的超分子，主要由40%～50%纖維素、15%～30%半纖維素以及15%～30%木質素3種化學物質組成2-3]。在植物細胞壁中，木質素填充于纖維素和半纖維素之間，通過氫鍵和共價鍵與糖類聚合物連接在一起。這種結構嚴重阻礙了纖維素酶對它的降解，合適的預處理是打破這種抗性的有效手段。常用的預處理方法有物理法、化學法和物理化學法等，其中堿法預處理是一種備受關注的化學預處理方法，堿法預處理可去除原料中的部分木質素，提高剩余多聚糖的酶可及性。但由于不同原料間底物分子結構存在差異，同一種預處理方法在相同預處理條件下對不同底物產生的預處理效果具有一定的差異。

本研究選用檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom，簡稱CKK，以下簡稱檸條，木本植物）、水稻秸稈、小麥秸稈（草本植物）作底物，采用NaOH溶液分別在常溫和高溫條件下對這3種原料進行預處理，研究堿在同一預處理條件下對不同底物的預處理效果及預處理后木質纖維素底物酶解規律的差異，為生物質能源開發利用過程中木質纖維素原料預處理參數的選擇提供理論依據。

1材料與方法

11生物質材料

檸條錦雞兒采自內蒙古自治區烏蘭察布市涼城縣，水稻秸稈采自湖南省永州市新田縣，小麥秸稈采自山東省棗莊市，以上原料自然風干，剪成2～3 cm小段，用FZ102微型植物試驗粉碎機（河北省黃驊市齊家務科學儀器廠）粉碎，過20目篩。

12預處理

檸條、水稻秸稈和小麥秸稈分別與01 molL NaOH溶液按料液比1 g ∶20 mL混合，分別在室溫條件下，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃預處理1 h，4 000 rmin離心15 min，棄去上清液，固體殘渣水洗至中性。

13木質纖維素的特征分析

131掃描電鏡（簡稱SEM）分析

用掃描電鏡觀察預處理前后木質纖維素的表面結構。樣品觀察前先噴金處理，電壓5～15 kV。

132傅立葉轉換紅外光譜（簡稱FTIR）分析

用傅立葉紅外光譜測定堿法預處理前后木質纖維素化學成分的變化，儀器分辨率為4 cm-1，波數范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數為16次，樣品處理采用KBr壓片法，2 mg樣品與300 mg KBr混合，壓片，使樣品粒徑降低，分散均勻。

133X-射線衍射（簡稱XRD）分析

用X-射線衍射方法分析NaOH溶液預處理前后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈纖維素結晶度的變化，在 2θ=10°～40°范圍內掃描，變化速率為 2 °min。結晶度計算公式為

結晶度（簡稱CrI）=（I002-I180°）I002×100%

式中：I002為002衍射晶面2θ=228°的強度，I180°為2θ=180°散射峰的強度。

134預處理前后木質纖維素的成分分析

預處理前后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的葡聚糖、木聚糖和酸不溶性木質素的含量參照美國可再生能源實驗室（簡稱NREL）的試驗方法進行測定4]。

葡聚糖、木聚糖含量的測定方法：原料用72%硫酸在 30 ℃ 下水解1 h，再加入84 mL去離子水，在121 ℃下水解 1 h。水解液用022 μm水相濾膜過濾，用高效液相色譜（簡稱HPLC）測定水解液中的糖分含量。D（+）-葡萄糖、D-（+）-木糖和L-（+）-阿拉伯糖作為混合標品，采用外標法進行定量分析。葡聚糖、木聚糖含量的計算公式為endprint

葡聚糖含量=SX（]Cg×8673×09生物質干質量×1 000SX）]×100%；

HS2]木聚糖含量=SX（]Cx×8673×088生物質干質量×1 000SX）]×100%。

式中：Cg、Cx分別表示水解液中葡萄糖、木糖的濃度，gL；生物質干質量的單位為g。

酸不溶性木質素和灰分含量的測定方法：取濾紙于 105 ℃ 烘箱烘干至恒質量，精確稱量并記錄濾紙質量。水解液殘渣真空抽濾，抽濾后的殘渣于105 ℃烘箱中烘干至恒質量，用馬弗爐測定樣品灰分。酸不溶性木質素含量的計算方法為

HS2]AIL=SX（]m1×m2×m3m4SX）]×100%。

式中：AIL表示酸不溶性木質素的含量；m1、m2、m3、m4分別表示濾紙和固體的質量（g）、濾紙的質量（g）、灰分質量（g）、生物質干質量（g）。

135酶解試驗方法

酶解反應的總體積為20 mL，在 100 mL 的三角瓶中進行。葡聚糖負荷為1%，其中葡聚糖負荷定義為葡聚糖的質量占酶解混合物總體積的百分比（木質纖維素材料的密度近似為1 gmL）。酶解反應所用的酶為纖維素酶Celluclast 15 L和β-葡萄糖苷酶，其中纖維素酶Celluclast 15 L按15 FPUg葡聚糖的負荷添加（Celluclast 15 L的濾紙酶活性為3776 FPUmL），β-葡萄糖苷酶的添加體積和纖維素酶的相同。酶解溫度為50 ℃，轉速為 180 rmin。分別在酶解反應進行3、6、24、48、72 h時取樣，所取樣品12 000 rmin離心10 min后取上清，用022 μm水相注射器濾膜過濾，用HPLC測定酶解液中的糖濃度，計算葡聚糖和木聚糖的轉化率。

HS2]葡聚糖轉化率=SX（]cg×V×09mgSX）]×100%；

HS2]木聚糖轉化率=SX（]cx×V×088mxSX）]×100%。

式中：V為酶解液體積，mL；mg、mx分別為酶解初始條件下葡聚糖和木聚糖的質量，g。

2結果與分析

21NaOH溶液預處理對檸條、水稻秸稈和小麥秸稈表觀形態的影響

從圖1可以看出，和未處理水稻秸稈相比，常溫堿處理的水稻秸稈表面出現了一些孔洞，可能是秸稈中木質素溶出的結果，升高預處理溫度后，堿液對水稻秸稈表觀結構的破壞程度更為明顯，秸稈表面雜亂無序，部分纖維斷裂，纖維的排列也變得疏松。同水稻秸稈一樣，小麥秸稈也來源于草本植物，常溫堿處理后小麥秸稈致密有序的結構受到了一定程度的破壞，導管結構出現了一定程度的皺縮，升高處理溫度后，小麥秸稈的纖維束變得松軟，部分表面坍塌。和小麥秸稈、水稻秸稈不同的是，檸條屬于木本植物，從各自未處理的SEM照片上也可明顯看出，檸條的整體結構更為致密，但是經過常溫和高溫堿處理后樣品表觀結構同樣變化很大，升高堿處理溫度后，對樣品的破壞程度更加突出。

22NaOH預處理后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的FTIR光譜

CM（24]檸條、水稻秸稈和小麥秸稈經NaOH溶液在不同溫度條

FK（W25]TPHSC1tif]

件下預處理后的FTIR光譜如圖2所示。經NaOH溶液預處理后，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的特征峰變化較明顯，特征峰透光率強度整體呈現減弱趨勢，其中，表征羥基伸縮振動的峰在波數3 425 cm-1處強度明顯減弱，表明NaOH溶液預處理破壞了木質纖維素中的部分氫鍵，而且隨著預處理溫度的提高，對氫鍵的破壞程度增強，從而對纖維素結晶區的破壞程度也增大5]。波數2 918 cm-1處表征纖維素中—CH、—CH2伸縮振動的特征峰強度明顯減弱，表明NaOH溶液預處理使纖維素大分子中甲基、亞甲基發生了部分斷裂，進一步表明纖維素的含量增加6]。波數1 166 cm-1處表征酯鍵中C—O—C鍵伸縮振動的吸收峰強度明顯減弱，表明堿處理打破了糖聚合物和木質素間的重要酯鍵7]。波數1 045 cm-1峰強度的減弱表征愈創木基的羥基被破壞8]。1 245 cm-1表征乙酰基中CFY=，1]O的伸縮振動，NaOH溶液處理后該吸收峰強度明顯降低，表明木質纖維素生物質經NaOH溶液處理后，大部分乙酰基被去除，這與朱圓圓等得出的結論8]一致。波數 1 730 cm-1 處表征羰基CFY=，1]O伸縮振動的吸收峰消失，波數1 636 cm-1表征吸附水H—O—H彎曲振動的吸收峰，1 034 cm-1 表征C—O—H的變形，1 112、1 051 cm-1峰強度的變化與纖維素和半纖維素相關基團的變化有關。綜上所述，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈經NaOH溶液處理后，木質素結構受到一定程度的破壞，部分官能團，如羥基、亞甲基、甲氧基和酯鍵等發生斷裂。

由圖2可以看出，對于草本植物水稻秸稈和小麥秸稈，相較于常溫堿處理，高溫堿處理后樣品中木質素特征峰減弱程度更大，表明升高溫度對水稻秸稈和小麥秸稈中木質素的破壞作用較大，這與成分分析得出的結果一致。而對于木本植物檸條，從檸條預處理前后的紅外圖譜中可看出，升高預處理

FK（W12]TPHSC2tif；S+4mm]

溫度對檸條木質素相關基團的特征峰影響程度并不大，可能是由于相較于草本植物，木本植物細胞壁中木質素、半纖維素和纖維素的交聯程度更為致密，從而使木質素更難去除。這也表明在同一預處理條件下，NaOH溶液對木本植物和草本植物的處理效果有較大的差異。

23NaOH溶液預處理對檸條、水稻秸稈和小麥秸稈纖維素結晶度的影響

由表1可以得出，經NaOH溶液預處理后，水稻秸稈、小麥秸稈和檸條的結晶度都有所降低，這是因為OH—能皂化半纖維素和木質素之間的酯鍵以及削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵，破壞木質纖維素原料中的結晶區，使木質纖維素發生潤脹，增大原料的孔隙率和比表面積，從而增加酶對木質纖維素的可及度。由結晶度結果可以看出，升高堿處理溫度，3種底物結晶度都明顯降低，其中，水稻秸稈的結晶度變化最大，結晶度降低至560%，小麥秸稈和檸條經高溫堿處理后結晶度大致相當，分別為569%和541%。endprint

24堿處理前后各底物的成分分析

不同溫度條件下NaOH溶液預處理對檸條、水稻秸稈、小麥秸稈各成分含量的影響如圖3所示。NaOH溶液可以破壞木質素聚合體間的醚鍵，使木質素解聚為小片段的聚合體，從而溶解在NaOH溶液中。經過NaOH溶液預處理后，水稻秸稈和小麥秸稈中纖維素（葡聚糖）、半纖維素（木聚糖）含量明顯升高，木質素含量明顯降低，表明NaOH溶液預處理已經去除了秸稈中的大量木質素，從而使得纖維素和半纖維素比例相對升高。然而，經過NaOH溶液預處理后，檸條中半纖維素和木質素含量變化不大，纖維素含量卻有一定程度的升高。根據趙偉等的研究，檸條枝莖富含蛋白質和脂肪，在利用NaOH溶液對檸條預處理的過程中，一部分蛋白質和脂肪成分被提取出來9-11]。因此，預處理后檸條中纖維素的含量增加。另外，雖然NaOH溶液預處理對檸條中的木質素有一定程度地去除，但其與纖維素、半纖維素的緊密交聯結構使得檸條的木質素去除效果不如水稻秸稈和小麥秸稈明顯。從圖3中還可以明顯看出，溫度對堿處理后木質纖維素各成分含量的影響較大，與常溫堿處理相比，升高溫度使各木質纖維素底物的葡聚糖含量分別增加1904%（水稻秸稈）、1480%（小麥秸稈）、1059%（檸條），水稻秸稈和小麥秸稈木質素含量分別降低1346%、765%，說明溫度能有效地促進堿溶液對木質纖維素中木質素的破壞。同時，在同一預處理條件下，升高溫度對檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的纖維素含量影響程度并不一致，升高預處理的溫度，纖維素含量變化由大到小為水稻秸稈>小麥秸稈>檸條。這說明由于不同底物的分子結構有一定差異，同一種預處理方法對不同底物的影響也呈現出一定差異。

25堿處理對檸條、水稻和小麥秸稈酶解的影響

對經過NaOH溶液在不同溫度條件下預處理后的水稻秸稈、小麥秸稈和檸條進行酶解糖化。由圖4可知，堿處理可以有效提高底物中葡聚糖的轉化率，升高堿處理溫度后這種作用變得更為明顯。其中，經24 h酶解后，高溫堿處理水稻秸稈的葡聚糖絕大部分已被酶解轉化，轉化率高達9487%，是未處理水稻秸稈葡聚糖轉化率（3430%）的277倍，對應木聚糖轉化率是未處理的566倍（圖5）。因為經高溫堿處理后大部分的木質素溶解并轉移到溶液中，而木質素含量又是影響酶解轉化的關鍵因素，木質素含量降低，酶解體系中酶的無效吸附減少，從而使酶的利用率增加。高溫堿處理小麥秸稈最終的葡聚糖轉化率為8268%，是未處理小麥秸稈葡聚糖轉化率（1981%）的417倍，對應木聚糖轉化率是未處理的575倍。同為草本植物，堿處理的小麥秸稈酶解時表現出和水稻秸稈相類似的結果。

不同的預處理底物因結構之間的差異，在酶解糖化中表現出的結果也不相同。小麥秸稈和水稻秸稈酶解糖化的結果類似，但是和檸條樣品的酶解結果相差較大，高溫堿處理的檸條樣品葡聚糖和木聚糖的最終轉化率都并不高，主要受致密的物理結構和較高木質素含量的影響，從成分分析和SEM的結果也可以證明這一點。總的來說，同一預處理和酶解條件下，草本植物比木本植物更易酶解。

3結論與討論

NaOH溶液堿處理作為一種有效的預處理方式，能有效去除木質纖維素的木質素成分，破壞致密的物理結構，這一點在SEM照片中可以直觀地看出。FTIR圖譜、XRD分析和成分分析可以得到相同的結果，即預處理后木質纖維素的木質素結構受到一定程度的破壞，結晶度降低，酶解轉化率提高。其中溫度作為一個重要的因素影響NaOH溶液堿處理的效果，溫度升高時，NaOH溶液堿處理對木質素的去除效果更好，對底物的物理結構破壞更嚴重，因此升高溫度是促進NaOH溶液堿處理效果的一種有效方式。

本研究依托NaOH溶液預處理方法，選取小麥秸稈、水稻秸稈作為草本類木質纖維素的代表，選取檸條作為木本類木質纖維素的代表，研究表明同一預處理條件對不同底物預處理效果有一定影響。木本類木質纖維素由于致密的物理結構和更高的木質化程度，使得其對預處理和酶解糖化的阻抗作用更大。為了更好地利用木本類木質纖維素，須根據木本植物特殊的物理化學結構，尋找更有效的預處理方法。

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