菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶催化制備短鏈低聚果糖

李 鑫， 周 瑾， 賴晨歡， 勇 強(qiáng)

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037;2. 南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院， 江蘇 南京 210037)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)化學(xué)品·

菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶催化制備短鏈低聚果糖

李 鑫1,2， 周 瑾2， 賴晨歡1,2， 勇 強(qiáng)1,2

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037;2. 南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院， 江蘇 南京 210037)

以菊粉加工廢棄物(菊芋渣)選擇性吸附黑曲霉產(chǎn)的天然菊粉酶提高菊粉酶活力(I)與轉(zhuǎn)化酶活力(S)的比值(即I/S比值)，并將此純化后的菊粉酶應(yīng)用于后續(xù)的短鏈低聚果糖(FOSs)的生產(chǎn)，考察了純化后菊粉酶對(duì)FOSs產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示：選擇的較佳吸附條件為：菊芋渣質(zhì)量濃度為100 g/L，吸附pH值為5.0，吸附溫度為4 ℃。經(jīng)菊芋渣的選擇性吸附，天然菊粉酶酶系中轉(zhuǎn)化酶活力降低80.84%，菊粉酶活力保留67.92%，I/S比值由原來(lái)的1.13上升至4.02。經(jīng)菊芋渣選擇性吸附后的天然菊粉酶用于制備短鏈低聚果糖，可顯著提高短鏈低聚果糖的濃度，酶解條件為：菊粉質(zhì)量濃度為40 g/L，酶解pH值為5.0，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質(zhì)量計(jì))，短鏈低聚果糖質(zhì)量濃度達(dá)到16.06g/L，是原酶液制備短鏈低聚果糖的2.55倍；短鏈低聚果糖得率為40.16%。

菊粉酶；選擇性吸附；菊芋渣；菊粉；短鏈低聚果糖

低聚果糖(FOSs)，是通過(guò)β-2,1-糖苷鍵在果糖殘基的C1位上連接1～3個(gè)果糖分子所形成的混合物，聚合度(Dp)在3～9范圍內(nèi)[1]。短鏈FOSs的聚合度為3～5，主要在近段結(jié)腸位置被利用[1]，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌如雙歧桿菌的增殖，還具有防止齲齒和降血糖、膽固醇等生理作用[2]。因此，F(xiàn)OSs作為一種可溶性膳食纖維，是重要的功能性食品原料之一[3]。FOSs的生產(chǎn)主要有兩種方法：一是以蔗糖為原料，在高濃度底物存在的條件下，蔗糖在β-果糖轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)，所得產(chǎn)物為GFn型FOSs(G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖，n為果糖分子數(shù))，但在制備過(guò)程中會(huì)積累大量的副產(chǎn)物葡萄糖，進(jìn)而抑制果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生[4]，并且 FOSs純度不高[5]，工藝繁雜，成本較高；二是以菊粉作為底物，內(nèi)切菊粉酶隨機(jī)切割長(zhǎng)鏈菊粉分子，所得產(chǎn)物為Fm型(F為果糖分子，m為果糖的分子數(shù))與GFn型的混合物，此法的產(chǎn)品純度較高，工藝簡(jiǎn)單，成本較低，是目前主流生產(chǎn)FOSs的方法[6]。國(guó)外以菊粉加工FOSs的公司主要有比利時(shí)的Orafti公司和Cosucra公司，以及美國(guó)的Jarrow Formulas公司[7]。其中Orafti公司所生產(chǎn)的低聚果糖純度達(dá)到93%～97%[8]，現(xiàn)有的研究報(bào)道中基于菊粉的酶法制備FOSs的得率達(dá)到60%～86%[1]。以菊粉為原料生產(chǎn)FOSs，關(guān)鍵在于內(nèi)切菊粉酶的制備。然而，天然菊粉酶是由內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶組成的復(fù)合酶系，菊粉在內(nèi)切菊粉酶的作用下主要產(chǎn)物為低聚果糖，而低聚果糖則在外切菊粉酶的作用下最終會(huì)水解成為果糖和葡萄糖[9]。因此，內(nèi)、外切菊粉酶的拆分對(duì)生產(chǎn)FOSs非常重要。天然菊粉酶酶系中內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶均表現(xiàn)一定的菊粉酶活力和轉(zhuǎn)化酶活力，多數(shù)外切菊粉酶比內(nèi)切菊粉酶表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)化酶活力[10]。因此，天然菊粉酶活力的高低常以菊粉酶活力(I)與轉(zhuǎn)化酶活力(S)的比值來(lái)表示，即I/S比值。拆分內(nèi)、外切菊粉酶的傳統(tǒng)方法主要有超濾、鹽析、柱層析、電泳等[11]，這些方法都存在效率低、成本高、不易于工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)。本研究以黑曲霉產(chǎn)的天然菊粉酶為研究對(duì)象，采用菊粉加工廢棄物(菊芋渣)為吸附劑來(lái)選擇性吸附天然菊粉酶，降低天然菊粉酶酶系中的轉(zhuǎn)化酶活力，保留較多的菊粉酶活力，即提高I/S比值，以期通過(guò)低成本的選擇性吸附方法改變天然菊粉酶的酶系結(jié)構(gòu)，提高低聚果糖的產(chǎn)率，為低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉NLX-H164，南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所提供。純菊粉，購(gòu)自Beneo Orafit公司，菊芋渣由青海威德生物技術(shù)有限公司提供。其他化學(xué)品均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1天然菊粉酶的制備 在250 mL錐形瓶中裝入50 mL 產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶培養(yǎng)基由20 g/L菊粉和10 g/L酵母粉構(gòu)成。接入5 mL黑曲霉NLX-H164，在170 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)。發(fā)酵72 h后取出發(fā)酵液，5 000 r/min下離心10 min，上清液即為天然菊粉酶酶液。

1.2.2菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶 菊芋渣于60 ℃烘干至質(zhì)量恒定，再經(jīng)粉碎至粒徑≤0.85 mm，所得固形物于4℃冷藏待用。取一定質(zhì)量的菊芋渣于錐形瓶中，加入0.1 mL的天然菊粉酶酶液，用不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至20 mL。攪拌至均勻后，在80 r/min條件下恒溫吸附。吸附30 min后取樣，樣品于5 000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定上清液中菊粉酶活力(I)和轉(zhuǎn)化酶活力(S)，計(jì)算I/S比值。菊芋渣對(duì)菊粉酶活力或轉(zhuǎn)化酶活力的選擇性吸附效果，以酶活力回收率表示，酶活力回收率=上清液中的酶活力(U)/起始加入的酶活力(U)×100 %。其中，酶活力單位(U)的定義為每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.3菊粉酶活力(I)的測(cè)定 用0.1 mol/L、pH值4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制5 %菊粉溶液450 μL，加入50 μL的天然菊粉酶酶液，混勻后，60 ℃水浴中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，即刻取出并用沸水浴滅活5 min，從反應(yīng)液中取出200 μL，加入1.5 mL DNS試劑和1.8 mL水，混勻后，沸水浴反應(yīng)5 min，冷水冷卻后，用蒸餾水在試管中定容至25 mL，測(cè)定520 nm處的吸光度值。根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品溶液中的還原糖質(zhì)量(mg)，進(jìn)而計(jì)算酶活力。

1.2.4轉(zhuǎn)化酶活力(S)的測(cè)定 用0.1 mol/L、pH值4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制5 %蔗糖溶液450 μL，取50 μL酶液加入混勻后，60 ℃水浴中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，即刻取出并用沸水浴滅活5 min，從反應(yīng)液中取出200 μL，加入1.5 mL DNS試劑和1.8 mL水，混勻后，沸水浴反應(yīng)5 min，冷水冷卻后，用蒸餾水在試管中定容至25 mL，測(cè)定520 nm處的吸光值。根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品溶液中的還原糖質(zhì)量(mg)，進(jìn)而計(jì)算酶活力。

1.2.5酶法制備短鏈低聚果糖 稱取2.0 g菊粉于100 mL酶解瓶中，加入適量吸附處理的天然菊粉酶酶液，補(bǔ)加乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值5.0)至50 mL，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質(zhì)量計(jì))在150 r/min條件下進(jìn)行酶水解。間隔2 h取樣，樣品于10 000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定上清液中短鏈FOSs的質(zhì)量濃度。酶解效果以短鏈FOSs得率表示，短鏈FOSs得率=總短鏈FOSs質(zhì)量/底物菊粉質(zhì)量×100%。

1.2.6分析方法 短鏈FOSs質(zhì)量濃度分析參考文獻(xiàn)[12]，并有一定的改進(jìn)。短鏈FOSs的聚合度一般為3～5[1]。采用戴安離子色譜系統(tǒng)測(cè)定上清液中的短鏈FOSs質(zhì)量濃度，離子色譜條件為：色譜柱為CarboPac PA10，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min。以超純水、200 mmol/L NaOH 和 500 mmol/L NaAc為流動(dòng)相，洗脫梯度：0～13 min，80 %水和20 % 200 mmol/L NaOH；13～30 min，90 %～85 % 200 mmol/L NaOH 和10 %～15 % 500 mmol/L NaAc；30～55 min，80 %水和 20 % 200 mmol/L NaOH。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊芋渣吸附條件對(duì)菊粉酶活力的影響

2.1.1菊芋渣質(zhì)量濃度 菊芋渣作為吸附劑，其濃度的高低會(huì)影響天然菊粉酶酶系的選擇性吸附。隨著菊芋渣質(zhì)量濃度的增加，體系中的固形物含量隨之提高，能夠增加吸附底物與酶組分的接觸，提高吸附效率。在吸附溫度4 ℃、pH值4.6條件下，研究菊芋渣質(zhì)量濃度對(duì)菊芋渣選擇性吸附菊粉酶的影響，如圖1(a)所示。

圖1 菊芋渣吸附條件對(duì)菊芋渣吸附菊粉酶的影響Fig. 1 Effect of adsorption conditions on the adsorption of inulinase by Jerusalem artichoke residue

由圖1(a)可知，隨著菊芋渣質(zhì)量濃度由10 g/L上升至200 g/L，菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率變化趨勢(shì)一致，即隨著吸附劑質(zhì)量濃度的增加，酶活力回收率也逐漸降低，并趨于平衡。當(dāng)菊芋渣質(zhì)量濃度由10 g/L上升至100 g/L時(shí)，菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶酶活力回收率下降較快，I/S比值隨菊芋渣質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)菊芋渣質(zhì)量濃度大于100 g/L時(shí)，菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率趨于平穩(wěn)，I/S比值也趨于平穩(wěn)。在體系內(nèi)酶蛋白一定的條件下，增加吸附劑用量，酶蛋白吸附量增加，當(dāng)酶蛋白吸附飽和后，進(jìn)一步增加吸附劑用量，酶蛋白吸附量不再增加[13]。同時(shí)，菊粉酶酶活力回收率明顯高于轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率，說(shuō)明菊芋渣對(duì)菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶具有選擇性吸附，菊芋渣優(yōu)先吸附轉(zhuǎn)化酶。當(dāng)菊芋渣質(zhì)量濃度達(dá)100 g/L時(shí)，I/S比值達(dá)到最大值，為3.06。因此，選擇的最佳吸附劑質(zhì)量濃度為100 g/L。

2.1.2pH值 pH值不僅影響吸附劑的表面性質(zhì)，也影響吸附質(zhì)所帶電荷，特別是蛋白質(zhì)等吸附質(zhì)所帶電荷受pH值影響較大，過(guò)高和過(guò)低的pH值均對(duì)吸附不利[12]。因此，選擇合適的吸附pH值對(duì)菊芋渣吸附菊粉酶具有重要的作用。文獻(xiàn)表明黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的最適pH值在4.0～5.0之間[11]。因此，在吸附溫度4 ℃、菊芋渣質(zhì)量濃度100 g/L條件下，研究pH值對(duì)菊芋渣吸附菊粉酶的影響，如圖1(b)所示。由圖1(b)可知，在pH值3.8～5.4范圍內(nèi)，菊粉酶與轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，菊粉酶的酶活力回收率表現(xiàn)為先降低后升高再降低的趨勢(shì)，而轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，說(shuō)明菊粉酶與轉(zhuǎn)化酶因蛋白質(zhì)組成的不同，在不同的pH值條件下，所帶電荷存在差異，進(jìn)而影響吸附效果，表現(xiàn)為選擇性吸附。在pH值為5.0時(shí)，菊粉酶的酶活力回收率達(dá)到最高為67.62 %，而轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率最低為21.69 %，I/S比值達(dá)到最大值為3.53。因此，菊芋渣吸附菊粉酶的最佳pH 值為5.0，此時(shí)菊粉酶中的轉(zhuǎn)化酶活力被最大限度的去除。

2.1.3溫度 吸附溫度對(duì)于吸附的影響和吸附過(guò)程的熱效應(yīng)相關(guān)[14]。同時(shí)，溫度也對(duì)酶活力產(chǎn)生影響。在菊芋渣質(zhì)量濃度100 g/L、pH值5.0條件下，研究溫度對(duì)菊芋渣吸附菊粉酶的影響，如圖1(c)所示。由圖1(c)可以看出，在4～50 ℃范圍內(nèi)，吸附溫度的升高對(duì)菊粉酶與轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率影響較小。在4℃時(shí)，菊粉酶的酶活力回收率為67.91 %，轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率為21.33 %，I/S比值為3.61；而在30 ℃時(shí)，菊粉酶的酶活力回收率為65.32 %，轉(zhuǎn)化酶的酶活力回收率為23.19 %，I/S比值為3.18。吸附過(guò)程一般為放熱過(guò)程，溫度對(duì)吸附的影響為負(fù)效應(yīng)，即低溫有利于吸附[15]。同時(shí)，溫度過(guò)高影響菊粉酶的生物活性。因此，選擇吸附溫度為4 ℃。

2.2 菊芋渣選擇性吸附前后菊粉酶酶活力的變化

經(jīng)優(yōu)化后確定菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶的較佳吸附條件為：菊芋渣質(zhì)量濃度100 g/L，吸附pH值5.0，吸附溫度4 ℃。在此條件下，對(duì)天然菊粉酶吸附前后的性質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。

表 1 菊芋渣選擇性吸附前后天然菊粉酶性質(zhì)的對(duì)比Table 1 Changes of native inulinase by the selective adsorption of Jerusalem artichoke residue

由表1可知，經(jīng)菊芋渣吸附后，菊粉酶活力由11.78 U/mL下降至8.00 U/mL，而轉(zhuǎn)化酶活力從10.39 U/mL降至1.99 U/mL；相應(yīng)，I/S比值由1.13上升至4.02，增加了255.75 %。菊芋渣吸附天然菊粉酶表現(xiàn)為選擇性吸附，優(yōu)先吸附轉(zhuǎn)化酶活力，吸附80.84 %的轉(zhuǎn)化酶活力，對(duì)應(yīng)的菊粉酶活力僅被吸附32.08 %，使得吸附后的天然菊粉酶酶系中的轉(zhuǎn)化酶活力顯著降低，保留了較多的菊粉酶活力。

2.3 酶法制備短鏈低聚果糖

利用菊芋渣選擇性吸附處理前后的天然菊粉酶來(lái)水解菊粉制備短鏈低聚果糖(FOSs)，按1.2.5節(jié)操作，如圖2所示。由圖2可知，40 g/L菊粉溶液本身含有少量的短鏈FOSs，質(zhì)量濃度為5.77 g/L。吸附后的天然菊粉酶水解菊粉過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生成的短鏈FOSs不斷增加，酶解10 h后，短鏈FOSs質(zhì)量濃度和得率達(dá)到最大值，分別為16.06 g/L和40.16 %；進(jìn)一步增加酶解時(shí)間，短鏈FOSs質(zhì)量濃度和得率開(kāi)始下降。原酶液的酶水解過(guò)程中，酶解10 h，短鏈FOSs質(zhì)量濃度從5.77 g/L增加至6.31 g/L，僅增加9.36 %，選擇性吸附的天然菊粉酶制備的短鏈FOSs質(zhì)量濃度是原酶液的2.55倍。天然菊粉酶經(jīng)菊芋渣選擇性吸附后，多數(shù)轉(zhuǎn)化酶活力被吸附，說(shuō)明從天然菊粉酶酶系中去除較多的外切菊粉酶，而內(nèi)切菊粉酶保留較多。利用菊芋渣吸附的天然菊粉酶制備短鏈FOSs的結(jié)果進(jìn)一步證明吸附后的天然菊粉酶酶系中存在較多的內(nèi)切菊粉酶，能夠隨機(jī)切割長(zhǎng)鏈菊粉分子，生成短鏈FOSs，增加了短鏈FOSs質(zhì)量濃度，提高了短鏈FOSs的得率。因此，采用菊粉加工產(chǎn)生的廢棄物(菊芋渣)，經(jīng)一步法選擇性吸附天然菊粉酶，用以制備短鏈FOSs，具有步驟少、成本低、食品安全性高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，短鏈FOSs得率仍然存在較大的提升空間，可通過(guò)對(duì)菊芋渣修飾提高對(duì)天然菊粉酶的選擇性吸附，或結(jié)合蛋白質(zhì)沉淀方法，進(jìn)一步處理吸附后的天然菊粉酶，提高I/S比值，從而提高短鏈FOSs質(zhì)量濃度和得率。

圖 2 菊芋渣吸附前(a)和吸附后(b)的天然菊粉酶制備短鏈低聚果糖(FOSs)Fig. 2 Preparation of short-chain fructooligosaccharides(FOSs) by the native inulinase before(a) and after(b) adsorbed by Jerusalem artichoke residue

3 結(jié) 論

3.1利用菊粉加工廢棄物(菊芋渣)選擇性吸附黑曲霉產(chǎn)天然菊粉酶，制備低轉(zhuǎn)化酶活力的菊粉酶，較佳吸附條件為：菊芋渣質(zhì)量濃度為100 g/L，吸附pH值為5.0，吸附溫度為4 ℃。經(jīng)菊芋渣吸附后，天然菊粉酶酶系中的轉(zhuǎn)化酶活力顯著降低，菊粉酶活力保留較多。利用吸附的天然菊粉酶制備短鏈低聚果糖，酶解條件為菊粉質(zhì)量濃度為40 g/L,酶解pH值為5.0，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質(zhì)量計(jì))，短鏈低聚果糖質(zhì)量濃度較之原酶液高2.55倍，菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶，去除較多的外切菊粉酶活力，保留較多的內(nèi)切菊粉酶活力，大幅度提高短鏈低聚果糖質(zhì)量濃度和得率。

3.2利用菊粉加工廢棄物建立的選擇性吸附天然菊粉酶的方法，改變天然菊粉酶的酶系結(jié)構(gòu)，有效提高短鏈低聚果糖的質(zhì)量濃度，為高效、低成本生產(chǎn)短鏈低聚果糖提供一種綠色、安全的新思路。

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Selective Adsorption of Native Inulinase by Jerusalem Artichoke Residue andPreparation of Short-chain Fructooligosaccharides

LI Xin1, 2, ZHOU Jin2, LAI Chenhuan1, 2, YONG Qiang1, 2

(1. Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

A selective adsorption method was developed to adsorb native inulinase fromAspergillusnigerto reduce sucrase activity by Jerusalem artichoke residue. The inulinase activity(I)/sucrase activity(S) ratio was generally used to characterize the inulinases. Afterward, the native inulinase, selectively adsorbed by Jerusalem artichoke residue, was applied for production of short-chain fructooligosaccharides(FOSs). The results showed that the optimal conditions of the selective adsorption were as follows: Jerusalem artichoke residue loading 100 g/L, pH value 5.0, adsorption temperature 4 ℃. 67.92% Inulinase activity was retained and 80.84% sucrase activity was decreased in the native inulinase system after the selective adsorption. The I/S ratio increased from 1.13 to 4.02. The selective adsorption of native inulinase by Jerusalem artichoke residue improved the production of short-chain FOSs. The conditions of enzymatic hydrolysis were inulin 40 g/L, pH value 5.0, 50 ℃, inulinase loading 20 U/g(based on the mass of inulin) . The mass concentration of short-chain FOSs was 16.06 g/L, which was 2.55 times than that of the original inulinase. The yield of short-chain FOSs was 40.16%.

inulinase;selective adsorption;Jerusalem artichoke residue;inulin;short-chain fructooligosaccharides

TQ35；Q815

A

1673-5854(2017)06- 0033- 05

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.06.006

2017- 10-16

江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(BF2015007)；青海省重點(diǎn)研發(fā)與轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(2016-HZ-819)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(無(wú)編號(hào))

李 鑫 (1975— )，男，遼寧大連人，副教授，博士，主要從事生物質(zhì)資源生物利用研究工作；E-mailxli@njfu.edu.cn。