高壓氧治療對大鼠創傷性腦損傷后Nogo—A及NgR表達的影響

涂杳然+牛凡+洪德全+胡勇

[摘要]目的 探討高壓氧治療對大鼠創傷性腦損傷后Nogo-A及NgR表達的影響。方法 選取SPF級SD大鼠100只，利用Feeney自由落體撞擊法制成急性中度創傷性腦損傷模型，將模型隨機分為治療組（n=20）和損傷組（n=80）。損傷組不做特殊處理、治療組建模成功后進行高壓氧治療。觀察兩組大鼠創傷后第1、3、5、7、10天時間段內大鼠腦內Nogo-A及NgR的表達差異。結果 治療組、損傷組大鼠均在創傷后第3天的Nogo-A及NgR表達最高，治療組大鼠的Nogo-A及NgR的表達在創傷后第1、3、5、7、10天的Nogo-A及NgR表達均低于損傷組，差異均有統計學意義（P<0.01）。結論 高壓氧治療對下調Nogo-A及NgR表達是促進中樞神經再生的機制之一。

[關鍵詞]高壓氧治療；創傷性腦損傷；Nogo-A及NgR表達；大鼠

[中圖分類號] R749.16 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）11（c）-0007-03

Influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats

TU Yao-ran NIU Fan HONG De-quan HU Yong

Trauma Center，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330008，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats.Methods One hundred SD rats （SPF grade） were selected and established as acute moderate traumatic brain injury models using Feeney′s method.The models were randomly divided into treatment group （n=20） and injury group （n=80）.In the injury group，no special treatment was applied，while in the treatment group，hyperbaric oxygen was adopted after successful modeling.The differences in the expression of Nogo-A and NgR in rats 1，3，5，7 and 10 days after the trauma of rats in two groups were observed.Results The expression of Nogo-A and NgR were highest in the third day after trauma in both the treatment and injury groups.The Nogo-A and NgR expression in the treatment group were all lower than those in the injury group 1，3，5，7 and 10 days after the trauma，and the differences were statistically significant （P<0.01）.Conclusion Down-regulation of Nogo-A and NgR expression by hyperbaric oxygen is one of the mechanisms of promoting central nerve regeneration.

[Key words]Hyperbaric oxygen therapy；Traumatic brain injury；Nogo-A and NgR expression；Rats

中樞神經系統內神經軸突生長抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A）與其受體（nogo receptor，NgR）結合后可抑制軸突生長，主要通過激活細胞內炎癥信號核轉錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路引或改變胞內鈣離子濃度實現[1]。研究發現，運用高壓氧治療創傷性腦損傷（TBI），可對神經系統功能有不同程度的改善，但其機制并不明確[2]。因此本研究考察高壓氧治療對大鼠中度創傷性腦損傷后不同時間段腦內Nogo-A和NgR受體表達的影響，探討高壓氧治療對大鼠創傷性腦損傷后神經功能的影響及創傷時間與Nogo-A、NgR表達的相關性，現報道如下。

1材料

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠100只，體重（250±30）g，20～25℃室溫下培養，標準飼養、自由進食、進水，自然光照。

1.2試劑

sABC試劑盒，DAB顯色試劑盒，兔抗Nogo-A IgG，兔抗NgR，以上試劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3儀器

大型高壓氧艙，由解放軍九四醫院提供；動物飼養設備，手術器械，麻醉藥品，熒光顯微鏡，免疫熒光分析儀，Feeney撞擊裝置，組織切片機等儀器均由南昌市第一醫院中心實驗室及病理科提供。endprint

1.4方法

1.4.1腦損傷大鼠模型的制備 將損傷組、治療組的大鼠制成急性中度創傷性腦損傷模型，用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠；麻醉滿意后將大鼠固定于操作臺上，剪掉頭頂毛發，用7%酒精消毒皮膚，沿矢狀縫切開2 cm切口，剝離皮下組織及顱骨骨膜，用電鉆在硬膜外、冠狀縫后1.5 mm，矢狀縫右側2.5 mm處開一個直徑5 mm骨窗，去除骨殘片，生理鹽水沖洗。采用自由落體致傷撞擊裝置，根據Feeney法，將撞擊桿頭端至于骨窗內，保持撞擊桿與地面垂直，于30 cm高度處將20 g撞擊錘釋放，沖擊撞桿，撞擊鼠腦。撞擊完成后迅速抬起撞擊桿。若發生出血，用棉球輕按至止血。清理術野，間斷縫合切口。先將大鼠轉移至保暖墊上，待出現身體活動后，再移回鼠籠。將模型隨機分為治療組（n=20）和損傷組（n=80），損傷組又隨機分為創傷后第1天（n=16）、第3天（n=16）、第5天（n=16）、第7天（n=16）和第10天（n=16）5個小組。

1.4.2高壓氧治療 建模成功后，將治療組大鼠放入高壓氧治療箱的高壓氧艙行高壓氧治療。

1.4.3免疫組織化學檢測 ①腦組織切片制作：用10%水合氯醛將大鼠過量麻醉，確定大鼠無痛覺反應后，用室溫生理鹽水和4℃的4%多聚甲醛行心臟灌流。灌流完成后打開顱腔取下大腦，運用鋒利薄刀片切取大小約為1 mm的腦組織，切片時注意切勿擠壓與用力。將所取腦組織浸入3%戊二醛溶液中進行固定。固定后用磷酸鹽緩慢沖洗3次，每次10 min，緩慢沖洗后運用四氧化鋨進行再次固定2 h，然后再次運用磷酸鹽緩慢沖洗3次，每次10 min；后脫水，在丙酮與包埋劑1：1的條件下進行浸透，然后進行包埋聚合，運用硝酸鉛與醋酸鈾染色，染色后裱于膠質包被的載玻片上，烘干后于常溫陰暗干燥處保存備用。②免疫組化測定大鼠創傷灶邊緣Nogo-A及NgR蛋白：取所制腦組織切片，運用二甲苯、乙醇脫蠟，在3%雙氧水中孵育15 min，蒸餾水沖洗3 min；PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，每次3 min。在高壓熱下進行抗原修復；修復后再次PBS洗滌3次。配置并滴加一抗40～50 μl置入37℃烤箱內孵育1 h，然后室溫下放置30 min并PBS洗滌3次。滴加二抗，同樣于37℃烤箱內孵育1 h，再次PBS洗滌3次。BAB顯色，自來水洗滌，脫水、封片。在普通顯微鏡下觀察結果，利用熒光顯微鏡成像攝片，用Image J軟件將結果量化。

1.5統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠創傷灶邊緣不同時間段Nogo-A表達的比較

在創傷后第3天，兩組大鼠腦內Nogo-A表達最高，治療組大鼠的Nogo-A表達在創傷后第1、3、5、7、10天均明顯低于損傷組，差異有統計學意義（P<0.01）（表1）。

2.2兩組大鼠創傷灶邊緣不同時間段NgR表達的比較

創傷后第3天，兩組大鼠腦內NgR表達最高，治療組大鼠在創傷后第1、3、5、7、10天的腦內NgR表達均明顯低于損傷組，差異有統計學意義（P<0.01）（表2）。

3討論

Nogo-A蛋白是存在于髓鞘中的一種軸突再生抑制因子[3]。研究證明，Nogo蛋白的編碼基因為nogo，屬于網狀蛋白質家族，主要分布于中樞神經系統少突膠質細胞內。Nogo-A由1個Nogo蛋白共有的188個氨基酸羧基末端以及2個跨膜結構域和一個巨大的氨基末端組成。Nogo-A具有2個抑制性功能結構域，一個是跨膜環狀Nogo-66，位于細胞，另一個是較長的氨基端區（amino-Nogo），定位于胞質內[4-5]。

NgR是Nogo-A的特異性受體，廣泛分布于中樞神經系統中，在灰質中含量最高[6-7]。NgR由1個肽信號、8個富含亮氨酸的重復序列、1個富含半胱氨酸的重復序列羧基端和1個糖基磷脂酰肌醇偶聯跨膜區組成[8]。

多種造模研究發現，Nogo-A抗體或NgR拮抗劑后，可明顯下調Nogo-A和NgR的表達，可促使中樞神經軸突再生，對神經功能恢復有重要意義[9-10]。研究表明，成年恒河猴單側頸髓損傷后運用Nogo-A抗體可明顯使其運動功能得到恢復。也有研究證明，Nogo-66拮抗劑可治療大鼠脊髓損傷，促進大鼠中樞神經軸突生長，恢復大鼠功能。此外，還有相關實驗證明，運用NgR疫苗法，使大鼠體內產生NgR抗體，可對受損的中樞神經其明顯恢復作用[11-13]。大量實驗表明，在創傷性腦損傷中，Nogo-A及NgR的異常表達貫穿整個過程[14]。

隨著科技發展，高壓氧療法已被廣泛運用與腦外傷治療中，且受廣大學者關注，因其療效明確，目前已成為腦外傷后重要的輔助治療手段[15]。本研究中，運用高壓氧對腦損傷后大鼠進行治療，明顯降低了大鼠腦內Nogo-A及NgR的表達水平，從而減輕腦水腫，促進中樞神經細胞恢復。研究結果提示，兩組大鼠在腦損傷后第3天的Nogo-A及NgR表達最高，而后逐漸降低，且治療組所有時間段內Nogo-A及NgR的表達水平均低于損傷組，差異有統計學意義（P<0.01）。

綜上所述，高壓氧治療下調Nogo-A及NgR的表達水平，是促進中樞神經系統再生的機制之一，因實驗所選研究樣本數量較少，研究結論仍需擴大樣本數量進一步研究探討。

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（收稿日期：2017-09-19 本文編輯：孟慶卿）endprint