溶出型抗菌紡織品的體外細胞毒性評價

周曉芳

摘要

目的：探究溶出型抗菌紡織品的體外細胞毒性。方法：用MTT比色法檢測溶出型抗菌紡織品浸提液濃度對小鼠成纖維細胞L929細胞相對增殖率的影響，并評價其細胞毒性。結論：細胞存活率隨著溶出型抗菌織物浸提液濃度的提高有所下降，但均高于空白對照組的70%，不認為被測試樣有潛在細胞毒性。

關鍵詞：抗菌；紡織品；溶出型；細胞毒性；MTT比色法

1 引言

據國內外學者研究，人體皮膚表層存在三類菌群：（1）常駐菌群（是保護人體免受有害微生物侵襲的屏障）；（2）過路菌群（往往是致病菌或條件致病菌）；（3）共生菌群（對常駐菌群有支持作用，對過路菌群有拮抗作用）。這三類菌群與皮膚共同構成一個動態平衡的微生態系統，一旦平衡被打破，即可能導致皮膚感染或其他疾病[1]。抗菌紡織品具有抗菌衛生自潔功能，一般為內衣、鞋襪等直接接觸皮膚的紡織品，所以對其生物安全性提出很高要求，需在抗菌的同時又不會對人體造成傷害[2]。行業標準FZ/T 73023—2012中規定了用暈圈法評價抗菌紡織品所用抗菌劑的溶出安全性。一方面可對抗菌劑的溶出性進行判斷，另一方面為抗菌紡織品的安全性提供判定依據。其中規定：按照標準程序洗滌一次后測試，若抑菌圈寬度D>1mm，可判定為溶出型抗菌織物；經洗滌一次后，用暈圈法測試溶出性，要求D<5mm。非溶出型抗菌劑與纖維上的羥基、氨基起反應后與纖維結合，穩定性強、緩釋速度均勻，故只觸及織物纖維被污染的微生物，絕少接觸到皮膚黏膜，具有較高的耐久性與安全性。溶出型的抗菌劑則用交聯樹脂固著在纖維上，抗菌物質緩釋但不均勻，此類產品抗菌效果雖好，但會影響到皮膚層的菌群，所以無論從安全性還是從織物抗菌作用的耐久性考慮，這類抗菌劑不是最佳選擇[1]。本文將主要探究溶出型抗菌紡織品的體外細胞毒性。

2 試驗原理、試劑和材料

MTT細胞毒性檢測（參照國家標準GB/T 16886.5—2003《醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》進行）。

原理：該檢測方法是建立在通過細胞的代謝活性衡量細胞活性的基礎上，黃色水溶性MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑藍]在活細胞內會轉化為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚。在甲瓚溶解于乙醇后，通過分光光度計可以測出顏色強度的變化從而推算出活細胞數。

試驗材料：細胞系，小鼠成纖維結締組織細胞（L929細胞），由中國科學院細胞庫提供。

設備和試劑：培養箱、超凈工作臺、水浴鍋、倒置相差顯微鏡、酒精燈、離心機、電子天平、96孔板分光光度計（配備570nm濾光片，參照650nm）、微板振蕩器、細胞計數器或血球計數器、移液器、8道移液器（批量稀釋用）、組織培養瓶、96孔組織培養微孔板、注射過濾器。化學試劑、培養基、MEM培養基（不含酚紅指示劑）、谷氨酰胺和碳酸氫鈉、胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑藍]、異丙醇（分析純）。

3 試驗部分

3.1 試驗準備工作

培養基：準備DMEM （含碳酸氫鈉緩沖體系）用于日常培養。10% 胎牛血清、4mM/L 谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素完全培養基置于4℃保存，且保存時間不超過兩周。

MTT溶液：將MTT溶解于無添加物、無酚紅的MEM培養基，濃度為1mg/mL。配好的溶液用注射過濾器過濾除菌（孔徑≤0.22?m）。MTT溶液應在配制當天使用。

樣品及其浸提準備工作：準備10份日常檢測中收集的來自不同公司生產的溶出型抗菌織物，厚度均小于0.5mm。樣品按ISO 10993-12：2012進行浸提。試樣大小：6cm×10cm；陰性對照：2g高密度聚乙烯；萃取液：10mL不含血清的DMEM培養基。振蕩24h浸提所有溶液，玻璃器皿等應消毒處理，且所有操作應在超凈工作臺中的無菌條件和環境下進行。

3.2 試驗方法

第1天：細胞復蘇后，要經過2～3次傳代才能用于檢測。通過酶消化法（胰蛋白酶）將細胞培養物從培養瓶中轉移出來，離心細胞懸液（200g、3min），然后將細胞重懸且將細胞濃度調整到1×105 cells/mL。用多道排槍吸取100?L培養基加到96孔培養板的外圍孔（空白孔）。在剩余的孔中，加入100?L濃度為1×105cells/mL或1×104cells/mL細胞懸液，培養24h（5%CO2、37℃、濕度>90 %）至細胞形成半匯合單細胞層。這個培養期確保細胞恢復且趨向對數生長期，為了避免試驗誤差，在相差顯微鏡下觀察細胞培養板中細胞生長狀況。

第2天：培養24h之后，將孔中的培養基吸去。向每孔加入100?L含適當濃度（100%、50%）樣品浸提液的處理培養基，加入100?L陰性對照（高密度聚乙烯0.2g/mL浸提）、陽性對照（含10% DMSO的MEM培養基）、空白對照（含10%血清MEM培養基），各試樣均做5個平行孔。培養細胞24h（5%CO2、37℃、濕度>90 %）。

第3天：處理24h之后，在倒置相差顯微鏡下檢查確認接種細胞是否存在系統誤差，并觀察各試驗組和對照組細胞的生長特點。記錄下細胞由于檢測樣品浸提液的細胞毒性而產生的細胞形態學的變化。對照組細胞異常生長則說明試驗有錯誤，試驗需重做。在檢測完培養板后，小心棄去板中的培養基，因為浸提液中的還原劑同樣會降低MTT，從而導致假陰性結果。然后向各孔中加入50?L的MTT溶液，培養2h（5%CO2、37℃、濕度>90%）之后棄去MTT溶液，每孔加入100?L異丙醇，輕輕晃動培養板約30min，隨后將板放入裝配了570nm濾光片的酶標儀中讀取吸光度（參考波長650nm）。

3.3 試驗數據分析

計算細胞相對增殖率（RGR），RGR=試驗組吸光度平均值/空白對照組吸光度平均值×100%。將試驗組RGR轉化為0～4級材料毒性評級（CTS）。當RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%時，分別對應細胞毒性等級0、1、2、3、4級。如果細胞存活率低于空白對照組的70%，那么被測樣品有潛在細胞毒性。

加入MTT檢測前，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，可見陽性對照組細胞數明顯降低，細胞胞體圓縮，大量壞死、崩解；空白對照組細胞輪廓清晰，呈梭形或多角狀，胞質透明、較大，細胞數明顯增加；試驗組細胞形態無明顯異常，可見少量的細胞碎片和胞體圓縮（圖1）。

細胞毒性測定結果見表1。統計學分析表明，各試驗組、空白對照組的OD值與陽性對照組之間均有統計學差異（P<0.05）；而各試驗組的OD值與空白對照組之間均無統計學差異（P>0.05）。試驗組細胞毒性級別均為1級。

4 總結

MTT比色法是一種能快速檢測細胞增殖、細胞毒性的比色分析法，已被廣泛應用于免疫學、腫瘤學、藥物毒理學和醫用材料的生物相容性評價。本試驗結果顯示：細胞存活率隨著溶出型抗菌織物浸提液濃度的提高有所下降，但均高于空白對照組的70%，試驗組細胞毒性評級均為1級，不認為被測10份試樣有潛在細胞毒性。紡織品抗菌性能及安全性能的測試方法與實際穿著或其他應用尚有相當的距離，本試驗僅對10份溶出型抗菌紡織品進行了相關評價和分析，具有一定的局限性。如果想要全面了解溶出型抗菌紡織品的安全性能，還需對該類抗菌紡織品進行大量的試驗和考察，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]張復全， 郭金福. Cleancool?纖維的抗菌性能檢測及安全性評述[J].針織工業，2010（10）：27-31.

[2]張娟， 田新階， 龔?. RTCA技術對抗菌劑APP的體外細胞毒性評價[A]. 2014年（首屆）抗菌科學與技術論壇論文摘要集[C]. 2014：122-125.

（作者單位：廣州市纖維產品檢測研究院）endprint