高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝臟microRNA表達譜的變化分析

麥靜愔， 陳天陽， 成 揚

(1 上海浦東新區中醫醫院， 上海 201299； 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院， 上海 201203)

高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝臟microRNA表達譜的變化分析

麥靜愔1， 陳天陽2， 成 揚2

(1 上海浦東新區中醫醫院， 上海 201299； 2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院， 上海 201203)

目的研究microRNA(miRNA)-384的表達對高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝脂肪變性的影響。方法將30只雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養7 d，然后隨機分成2組，每組15只。對照組中的15只小鼠給予普通飲食，模型組15只小鼠給予HFD，喂養8周后獲取肝組織。進行HE和尼羅紅染色觀察肝組織病理改變。采用微陣序列測序肝組織的全基因組miRNA表達譜，PCR法測定miRNA-384的相對表達水平。計量資料2組間比較采用t檢驗。結果對照組小鼠肝臟呈紅色，邊緣銳利，肝小葉結構清晰，肝細胞無脂肪變性；模型組小鼠肝臟呈黃色，邊緣變鈍，肝細胞明顯腫脹，細胞質內可見大量脂肪空泡，脂滴相互融合導致細胞核偏位。與正常小鼠相比，在NAFLD小鼠的肝組織中發現了12個上調和18個下調的miRNA。篩查了對照組和模型組間的一些差異表達的miRNA，獲得同樣的聚類分析圖。在這8個明顯改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數變化。結論miRNA-384表達的上調與肝臟脂肪變性有著密切關系，但是其作用機制仍需進一步研究。

非酒精性脂肪性肝病； 微RNAs； 基因表達； 高脂飲食； 小鼠， 近交C57BL

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的，以彌漫性大細胞性脂肪變和肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1]。流行病學調查顯示，NAFLD在世界范圍內患病率為2%～4%，與人們的學習、工作壓力、不良的飲食及生活習慣有關，隨著肥胖及相關代謝紊亂發病逐漸低齡化，并且發病率呈逐漸上升的趨勢[2-3]，已經嚴重威脅到人類的健康。由于其發病原因及機制比較復雜，目前對于具體的發病機制仍然不太明確。

microRNA(miRNA)是一類長約18～25個核苷酸序列的內源性非編碼單鏈小分子RNA，研究[4-5]表明其調控人類超過1/3的基因，參與細胞的分化、生長、代謝、增殖、凋亡和病毒感染、腫瘤生成等方面。并且其表達譜分析研究已經確定了組織表達的miRNA可以在人肝臟疾病和多種疾病中進行差異調控，并影響肝臟的病理生理環境[6]。然而，miRNA在高脂肪飲食(high fat diet，HFD)誘導的NAFLD過程中脂肪變性的發生和機制尚不明確。本研究試圖觀察HFD喂養小鼠肝組織中miRNA譜的變化，初步探討其在脂肪肝發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠(體質量20～25 g)購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器 Trizol試劑(購自加拿大Invitrogen公司)、SYBR Green PCR Master Mix(購自美國Invitrogen公司)、TruSeq polyA(購自美國Illumina公司)、2100 Bioanalyzer(購自加拿大Agilent技術公司)、HiSeq 2000系統(購自美國Illumina公司)、光學顯微鏡(購自日本Olympus公司)、qPCR儀(購自美國Eppendorf公司)。

1.3 造模與給藥 30只雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養7 d，然后隨機分成2組，每組15只。對照組小鼠給予普通飲食：面粉25%，玉米面30%，麩皮15%，魚粉8%，骨粉3%，奶粉2%，豆粕11%，食鹽0.5%，魚肝油0.5%，雞蛋4%，維生素及無機鹽1%[7]。模型組小鼠給予HFD：79.5%玉米粉、0.5%膽固醇和20%豬油。喂養8周后收集肝組織。

1.4 標本的采集與檢測

1.4.1 體質量與生活狀態 每日觀察小鼠體質量及生活狀態的變化。

1.4.2 肝組織病理觀察 實驗結束處死動物后，將小鼠的肝臟切除。先觀察肝臟大體標本的大小、色澤、質地、切面等情況；再將肝組織用10%的甲醛溶液固定，固定組織常規處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，根據標準流程進行脫蠟和水化。所有的組織切片進行HE和尼羅紅染色，光鏡下觀察肝脂肪變性情況。

1.4.3 miRNA表達譜的測定 使用Trizol試劑分離肝組織的總RNA，并根據說明書用DNase處理以除去潛在的基因組DNA污染物。用2100 Bioanalyzer分析RNA的質量。使用Illumina TruSeq polyA +樣品制備試劑盒制備RNA-seq的文庫。單次讀取測序(×100)在Illumina HiSeq 2000系統上進行。測序讀數的繪制由MapSplice2進行，并通過RSEM定量基因表達。與對照組相比，NAFLD小鼠肝臟中的差異表達基因通過單尾、未配對的Student′s-t檢驗進行鑒定。當P≤0.05時，如果它們的倍數變化≥2(或倍數變化≤0.5)，則基因被認為顯著上調或下調。

1.4.4 定量RT-PCR 在PCR反應管中加入如下反應混合物：10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix，特異性引物2 μl(miRNA-384，上游引物：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′，下游引物：5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′; U6內參，上游引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′)和cDNA模板1.45 μl，加入ddH2O補充體積至20 μl。反應條件為：95 ℃ 10 min，隨后40次循環，每次循環95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min和72 ℃延伸1 min。相對表達水平用2-ΔΔCt法測定。

2 結果

2.1 小鼠的生活狀態 經過8周喂養，2組小鼠均無死亡記錄。整個過程中對照組小鼠生活狀態正常；而模型組小鼠在后期逐漸出現反應遲鈍，體型增大，活動減少。

2.2 肝臟組織病理結果 對照組小鼠肝臟呈紅色，邊緣銳利，肝小葉結構清晰，肝細胞無脂肪變性；模型組小鼠肝臟呈黃色，邊緣變鈍，肝細胞明顯腫脹，細胞質內可見大量脂肪空泡，脂滴相互融合導致細胞核偏位(圖1)。

2.3 在NAFLD小鼠肝組織中的miRNA表達譜和qPCR驗證 在HFD喂養后8周分析對照組和模型組肝組織的全基因組miRNA表達譜。標準化后，與對照組小鼠相比，在模型組小鼠的肝組織中發現了12個上調和18個下調的miRNA。篩查了對照組和模型組間的一些差異表達的miRNA，獲得同樣的聚類分析圖(圖2)。在這8個明顯改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數變化(圖3)。

3 討論

NAFLD的發病原因與遺傳、環境、代謝等因素有著密切的關系，其病理類型主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，后者可進展為肝癌[8]。隨著發病率上升，并且發病逐漸低齡化，現成為最常見的慢性肝病，影響著人類的健康。其發病機制多數學者普遍認同“二次打擊”學說[9]，即脂類在肝臟細胞的細胞質內的聚集引發了一系列細胞毒素的釋放，導致了肝臟的炎癥反應。首次打擊主要是指脂肪在肝臟實質細胞內的過度聚集。這一過程已經被證實與胰島素抵抗有關，胰島素抵抗會導致細胞內甘油三酯的合成與轉運功能紊亂。第二次打擊為氧化應激反應，是在首次打擊的基礎上，由活性氧誘導的發生在肝臟實質細胞內的炎癥反應[10-11]。雖然該學說被廣泛接受，但是其具體的發病機制仍然不明確，所以非常有必要繼續對NAFLD 的發病機制進行深入的研究。

圖1 小鼠肝臟病理學變化 a、b分別為正常組、模型組，HE

圖2 miRNA芯片篩選小鼠肝臟miRNA差異表達的熱圖

圖3 miRNA-384在具有倍數變化的miRNA熱圖中的表達量

近幾年來，miRNA作為科學研究的重要工具，為疾病的診治提供了全新的手段[12]。同時miRNA在許多肝臟疾病中可以出現特異性改變，反映肝臟組織的病理改變，也可作為肝癌診斷的生物標志物[13-15]。在脂類代謝中，miRNA作用于脂類合成、分解及轉運相關的靶基因，調控體內脂類代謝[16]。不僅如此，miRNA數量或功能異常還通過干擾胰島素信號轉導，誘導胰島素抵抗的發生，從而影響機體正常脂質代謝, 促進脂肪性肝病的形成[17]。

肝臟是動物體內重要的代謝器官，在生長發育過程中，肝細胞中的miRNA表達變化能夠在一定程度上影響肝臟的代謝功能[18]。為了研究miRNA-384與NAFLD肝脂肪變性的關系，本課題組通過HFD構建小鼠的NAFLD疾病模型，在造模成功后，觀察小鼠肝組織學變化。并且由微陣序列測序分析30種miRNA在NAFLD小鼠肝組織中的顯著變化。在這8個改變的miRNA中，miRNA-384具有顯著的倍數變化。同時，在小鼠給予HFD過程中，通過qPCR測量小鼠肝臟miRNA-384的表達水平，觀察到miRNA-384表達隨著時間推移而顯著上調。說明miRNA-384在NAFLD中表達上調可導致肝脂肪變性。同時有相關研究[19-20]表明，miRNA的異常表達可能是通過參與調控脂質的合成、脂質細胞分化的調節以及改變肝星狀細胞相關的信號轉導通路而促進脂肪肝、肝纖維化的形成，但是具體的調控機制仍然不明確。

綜上所述，本研究表明miRNA-384表達的上調與肝脂肪變性有著密切關系，但是其作用機制仍需進一步研究加以證實。

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ChangesinmicroRNAexpressionprofileintheliverofmicewithnonalcoholicfattyliverdiseaseinducedbyhigh-fatdiet

MAIJingyin,CHENTianyang,CHENGYang.

(PudongNewAreaHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201299,China)

ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-384 (miR-384) expression on hepatic steatosis in mice with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high-fat diet (HFD).MethodsA total of 30 male C57BL/6J mice were fed for 7 days to adapt to the environment and then randomly divided into 2 groups, with 15 mice in each group. The mice in the control group were given normal diet, and those in the model group were given HFD for 8 weeks and then the liver tissue was harvested. HE and Nile red staining were used to observe the pathological changes of the liver. Microarray sequencing was performed to determine the whole-genome miRNA expression profile of liver tissue, and PCR was used to measure the relative expression of miR-384. Thet-test was used for the comparison of continuous data between groups.ResultsIn the control group, the liver was red with sharp edges, the lobular structure was clear, and there was no hepatic steatosis; in the model group, the liver was yellow with blunt edges, and the hepatocytes were swollen with a large number of fat vacuoles in the cytoplasm and nuclear deviation caused by the fusion of lipid droplets. Compared with the normal mice, the NAFLD mice had 12 upregulated miRNAs and 18 downregulated miRNAs in liver tissue. Some of the differentially expressed miRNAs between the control group and the model group were screened to obtain the same cluster diagram. Among the 8 miRNAs with significant changes, miR-384 showed a significant fold change.ConclusionThe upregulation of miR-384 is closely associated with hepatic steatosis, but its mechanism still needs further study.

nonalcoholic fatty liver disease; microRNAs; gene expression; high fat diet; mice, inbred C578BL

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2372-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.023

2017-08-18；修回日期：2017-09-26。 基金項目：上海浦東新區衛生系統學科帶頭人培養計劃(PWRd2016-01)；上海市衛生和計劃生育委員會項目(201540181) 作者簡介：麥靜愔(1979-)，女，副主任醫師，博士，從事中西醫結合臨床和基礎研究。

引證本文：MAI JY, CHEN TY, CHENG Y. Changes in microRNA expression profile in the liver of mice with nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2372-2375. (in Chinese)

麥靜愔， 陳天陽， 成揚. 高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝臟microRNA表達譜的變化分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2372-2375.

(本文編輯：王 瑩)