丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E對軍曹魚的影響

丁兆坤，李偉峰，黃金華，許友卿

( 廣西大學，水產(chǎn)科學研究所，廣西 南寧 535004 )

丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E對軍曹魚的影響

丁兆坤，李偉峰，黃金華，許友卿

( 廣西大學，水產(chǎn)科學研究所，廣西 南寧 535004 )

本研究探討了添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E對軍曹魚幼魚相對質(zhì)量增加率、特定生長率和不同組織器官RNA/DNA比值的影響。在飼料中添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E，飼喂軍曹魚幼魚12周后，稱其體質(zhì)量，計算相對質(zhì)量增加率和特定生長率，測定肝臟、肌肉、腦、心臟、腎和血清的RNA和DNA含量，計算RNA/DNA比值。將魚特定生長率與各組織器官RNA/DNA比值做線性回歸方程分析，比較二者的相關(guān)性。結(jié)果顯示，添加丙氨酰—谷氨酰胺、維生素E可促進幼魚的特定生長率。試驗魚主要組織器官RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2的大小為肌肉>血清>肝臟>腎>心臟>腦。其中魚肉RNA/DNA比值與其特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.8422，血清RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.82705，均呈高度正相關(guān)。由此得出結(jié)論，在本試驗條件下，添加丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E可促進軍曹魚幼魚的相對質(zhì)量增加率和特定生長率，也增加其主要組織器官RNA/DNA比值；當每千克干飼料添加丙氨酰—谷氨酰胺 5 g 和維生素E 50 IU時，效果最佳。軍曹魚幼魚的特定生長率與其肌肉、血清的RNA/DNA比值高度正相關(guān)，可互為指示。

丙氨酰—谷氨酰胺；維生素E；生長率；RNA/DNA比值；軍曹魚

核酸分析法為研究幼魚對環(huán)境變化的反應(yīng)、近期生長和死亡率狀況提供了有價值的參考。魚組織RNA與DNA比值可指示仔、稚、幼魚的近期生長和營養(yǎng)條件[1-4]。維生素E是一種必需微量營養(yǎng)素，可以促進魚類生長等[5-7]。谷氨酰胺是一種條件必需氨基酸，在魚類和畜禽等動物的研究中已被證實具有促進腸道發(fā)育等功能[8-10]。有報道稱，聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和維生素E可協(xié)同提高細胞生存發(fā)育能力[11]，促進肉雞腸道發(fā)育等[12-13]。然而，目前尚未見在飼料中聯(lián)合添加谷氨酰胺和維生素E對魚類生長協(xié)同影響的報道。

由于谷氨酰胺的溶解度低和性質(zhì)不穩(wěn)定，故試驗和臨床均用丙氨酰—谷氨酰胺替代谷氨酰胺。丙氨酰—谷氨酰胺不但安全有效，與谷氨酰胺的生理作用無異，而且丙氨酰—谷氨酰胺于體內(nèi)經(jīng)二肽酶水解還可以同時釋放出谷氨酰胺和丙氨酸供組織利用[14]。

軍曹魚(Rachycentroncanadum)是我國南方重點養(yǎng)殖的魚類[15-17]。由于軍曹魚是熱帶、亞熱帶廣鹽性海水魚，生長快、營養(yǎng)高和味道美，已迅速發(fā)展為優(yōu)良的海水養(yǎng)殖品種，因此吸引了許多學者研究之[17-21]。本試驗添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺二肽、維生素E投喂軍曹魚幼魚12周，研究其對軍曹魚幼魚特定生長率及主要組織器官肝臟、肌肉、腦、心臟、腎和血清RNA/DNA比值的影響，以理解軍曹魚稚、幼魚的營養(yǎng)生理，丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的協(xié)同作用，為調(diào)控動物特別是魚類營養(yǎng)和配制高效合理的飼料提供科學依據(jù)，促進丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的聯(lián)合應(yīng)用，對促進軍曹魚及其他海洋性魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有理論和應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料主要成分

魚油和北太平洋白魚粉(蛋白質(zhì)>65%，美國海鮮公司)；維生素E(α-生育酚)(1000 IU/g Sigma T3634，美國Sigma-aldrich公司)；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和L-丙氨酸(純度>99%，中國青島福林生化有限公司)；維生素混合物、礦物質(zhì)混合物和大豆磷脂(中國廣州誠一生物技術(shù)有限公司)；酪蛋白(食品級，中國甘肅華玲牛奶公司廣州分公司)；其他飼料原料均為食品級，購自國內(nèi)不同的生物技術(shù)公司。

1.2 試驗飼料的配制

以白魚粉、酪蛋白、豆粕為蛋白源，魚油、大豆磷脂為脂肪源，淀粉作為主要糖源配制基礎(chǔ)飼料，其組分是基于本團隊的研究結(jié)果[20-21]。丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的添加量參考了其他學者的研究[17, 22-24]，每千克干飼料分別添加丙氨酰—谷氨酰胺0、10、0、10、5、2.5 g和維生素E(α-生育酚)0、0、100、100、50、25 IU，共6個飼料組，依次為D0、D1、D2、D3、D4、D5，其中D0組為對照組，未添加丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E。經(jīng)高效液相色譜分析，各飼料組丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E實際含量分別為0.00、9.70、0.00、9.80、4.70、2.40 g/kg和27.30、26.70、128.20、127.80、78.50、50.90 IU/kg。試驗飼料配方和干飼料營養(yǎng)成分見表1。

所有原料粉碎后過60目網(wǎng)篩。先以表1中各組數(shù)據(jù)比例將維生素E(α-生育酚)和魚油分組調(diào)配均勻，丙氨酰—谷氨酰胺與礦物質(zhì)混合物分組調(diào)配均勻，再按各組數(shù)據(jù)比例稱量各組其他飼料成分，全部混合一起，充分攪拌均勻。投喂前每千克干飼料加養(yǎng)殖用海水0.7 kg，充分混合，揉成飼料面團，再手工制成適合魚口徑的小圓顆粒，投喂。為便于飼料的保存和保持飼料的新鮮，每次手工制作飼料量不超過3 d的投喂量，于冰箱-20 ℃保存，用前充分解凍放涼至室溫。

1.3 試驗魚的馴化、養(yǎng)殖與取樣

軍曹魚2100尾，魚齡24 d，體質(zhì)量約3 g，體長(4.05±0.32) cm，購自廣東省湛江市流沙鎮(zhèn)海水魚種育苗場。先在廣西水產(chǎn)科學研究所防城港海水養(yǎng)殖中試基地標準化養(yǎng)殖車間的養(yǎng)殖池內(nèi)馴化，馴化養(yǎng)殖池為9 m×7 m×1.7 m，水深0.8 m。用過濾充氧的海水馴化養(yǎng)殖，海水鹽度27～30，溫度26～32 ℃，pH 7.8～8.0，溶解氧≥6 mg/L。每日于8:00和 17:00投喂2次，投喂量為當時魚體質(zhì)量的5%(每周稱量體質(zhì)量1次，調(diào)整投喂量)。馴化1月后，隨機選取390尾體質(zhì)量為(14.87±0.51) g，體長(12.86±0.24) cm的軍曹魚幼魚，其中30尾用于0周解剖取組織器官樣品，其余360尾隨機分為6組，每組3個平行，養(yǎng)于18個400 L的養(yǎng)殖桶，水質(zhì)條件與馴化相同，每桶流水量2～3 L/min，用氣石充氣。飼喂12周后結(jié)束養(yǎng)殖試驗，在停止投喂24 h后抽取樣品。先以76.92 μg/g含量的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽逐尾魚麻醉，測量所有魚體長、體質(zhì)量，隨機取每桶3尾全魚樣品，另3尾魚尾靜脈采血，4000 r/min離心12 min取血清，然后解剖取肝臟、背側(cè)肌、腎、腦、心臟等組織器官，分別稱量樣品、裝樣品袋、標記固定，用液氮速凍保存，運回廣西大學水產(chǎn)研究所實驗室，用于RNA和DNA測定。

1.4 試驗魚主要組織器官DNA、RNA含量的測定

1.4.1 DNA的測定

用上海生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，抽提試驗魚主要組織器官樣品的DNA。用核酸蛋白分析儀檢測樣品DNA含量。

DNA含量計算公式：

CDNA/μg·mg-1=CA×50/1000/m

式中，CDNA為樣品DNA的含量(μg/mg)，CA為測定質(zhì)量濃度(ng/μL)，50(μL)為樣品DNA被稀釋體積，1000為ng和μg的換算倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(mg)。

表1 養(yǎng)魚試驗飼料配方(g/kg 干飼料)和營養(yǎng)組成(% 干物質(zhì))

注：a.維生素預混料：維生素A 80 000 IU/kg, 維生素D340 000 IU/kg, 維生素K3120 mg/kg, 維生素B1150 mg/kg, 維生素B2320 mg/kg, 鹽酸吡哆300 mg/kg, 維生素B122 mg/kg, 煙酸15 mg/kg, 泛酸鉀720 mg/kg, 葉酸40 mg/kg, 生物素2 mg/kg, 肌醇2000 mg/kg, 維生素C 100 mg/kg, 氯化膽堿10 000 mg/kg.b.礦物質(zhì)預混料(mg/kg)：Fe 160, Zn 600, Mn 40, Cu 200, I 10, Mg 200, Co 20, Mo 20，等.

1.4.2 RNA的測定

稱量約100 mg組織，于液氮條件下研磨成粉末，用Trizol勻漿，加入氯仿，振蕩離心后取上清液；加入異丙醇，振蕩離心后去除上清液；加入乙醇，振蕩離心后去除上清液；加入100 μL 無RNase的H2O，待RNA溶解后，用核酸蛋白分析儀檢測樣品RNA含量。

RNA含量計算公式：

CRNA/μg·mg-1=CA×100/1000/m

式中，CRNA為樣品RNA的含量(μg/mg)，CA為測定質(zhì)量濃度(ng/μL)，100(μL)為樣品RNA被稀釋體積，1000為ng和μg的換算倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(mg)。

1.5 計算公式與數(shù)理統(tǒng)計

相對質(zhì)量增加率/%= (mt-mi)/mi×100%

特定生長率/%·d-1=(lnmt-lnmi)/t×100%

飼料系數(shù)=mf/(mt-mi)

式中，mt為最終體質(zhì)量 (g)，mi為最初體質(zhì)量 (g)，mf為飼料投喂量(g)，t為養(yǎng)殖天數(shù)(d)。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析模塊，對試驗魚各項測定指標進行統(tǒng)計分析，若差異顯著(P<0.05)，則進行Duncans多重比較。數(shù)據(jù)全部以平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E對軍曹魚幼魚生長指標的影響

添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E投喂軍曹魚幼魚12周后，總平均體質(zhì)量由起始的(14.87±0.51) g增至212.14 g。各試驗組魚相對質(zhì)量增加率均分別高于對照組，依次為D4>D3>D5>D2>D1>D0。其中D4組相對質(zhì)量增加率顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組與對照組無顯著性差異(P>0.05)(圖1a)。

各組魚的特定生長率均分別高于對照組，其中D4組魚的特定生長率最高并顯著高于對照組(P<0.05)。聯(lián)合添加丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的D3、D4、D5組魚的特定生長率均高于單獨添加丙氨酰—谷氨酰胺的D1組和單獨添加維生素E的D2組，但差異不顯著(P>0.05)(圖1b)。

聯(lián)合添加丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的D3、D4、D5組魚的飼料系數(shù)均分別顯著低于對照組(P<0.05)，其中D4組魚的飼料系數(shù)最低，并顯著低于單獨添加丙氨酰—谷氨酰胺的D1組和單獨添加維生素E的D2組(P<0.05)(圖1c)。

圖1 丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E對軍曹魚幼魚生長指標的影響圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，柱上不同的字母表示顯著性差異(P<0.05).

2.2 丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E對軍曹魚幼魚組織器官RNA/DNA比值及其與特定生長率關(guān)系的影響

除腦外，各試驗組魚肝臟、肌肉、腎、心臟、血清RNA/DNA比值均分別高于對照組，其中D3、D4、D5組魚肌肉RNA/DNA比值均顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。試驗魚肝臟、肌肉、腦、腎、心臟、血清RNA/DNA比值與其特定生長率的線性回歸關(guān)系中，其相關(guān)系數(shù)r2大小為肌肉>血清>肝臟>腎>心臟>腦。其中肌肉RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.8422(圖2b)，血清RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.82705(圖2f)，均顯示高度正相關(guān)；肝臟RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.61722(圖2a)，顯著相關(guān)；腎RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.47954(圖2d)，心臟RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.3252(圖2e)，均顯示低度相關(guān)；腦RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.02696(圖2c)，無直線相關(guān)。

此外，添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E飼喂12周后，軍曹魚幼魚血清RNA/DNA比值高于第0周(表2)。

表2 丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E對軍曹魚幼魚組織器官RNA/DNA比值的影響

注：表中數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，橫排中標有不同字母的數(shù)據(jù)，表示試驗組間有顯著差異(P<0.05)，n=3×3.

圖2 丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E對軍曹魚幼魚肝組織器官RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸關(guān)系的影響

3 討 論

3.1 丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E對軍曹魚幼魚生長的影響

維生素E是必需微量營養(yǎng)素，具有多種重要的生化和生理作用，包括促進魚的生長。維生素E可能通過阻止脂質(zhì)氧化，促進對日糧中不可或缺營養(yǎng)素的吸收而刺激生長[23]。研究表明，日糧添加維生素E促進了雜交羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[30]、大鰉魚(H.huso)[31、鱘魚(A.naccarii)[32]、雜交條紋鱸[33]、金頭鯛[34]、南亞野鯪(Labeorohita)[35]、麥瑞加拉野鯪(Cirrhinusmrigala)[36]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[23]、虹鱒(Onchorynchusmykiss)[37]的生長。然而，維生素E對金頭鯛[38]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)[34]、白鱘魚(A.transmontanus)[39]和銀鱒(O.kisutch)[40]等魚的生長影響不顯著。結(jié)果相異可能是由于飼料配方，比如所用油脂的的類型和劑量，還有魚種和規(guī)格不同等原因所致。

聯(lián)合添加丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的D3、D4、D5組魚相對質(zhì)量增加率、特定生長率均高于單獨添加丙氨酰—谷氨酰胺的D1組和單獨添加維生素E的D2組(圖1)。這表明在促魚類生長方面，丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E具有一定協(xié)同作用。由于谷氨酰胺是谷胱甘肽的前體物質(zhì)[41]，增加谷氨酰胺可顯著提高胞內(nèi)谷胱甘肽含量[42]，而谷胱甘肽可還原和再生維生素E，使維生素E發(fā)揮作用[43]；谷氨酰胺和維生素E可協(xié)同刺激上皮細胞的生長和再生[11]；谷氨酰胺和維生素E均可促進魚類的生長等，因此二者能協(xié)同增效[9]。本試驗結(jié)果與Ayazi[44]的報道一致。

3.2 丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E對軍曹魚幼魚主要組織器官的RNA/DNA比值的影響

添加不同劑量和比例丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E，對軍曹魚幼魚主要組織器官的RNA/DNA比值的影響因劑量和組織器官而異，特定生長率與RNA/DNA比值線性回歸分析顯示，回歸系數(shù)依次為肌肉>血清>肝臟>腎>心臟>腦。當丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E的添加量分別為5 g/kg和50 IU/kg(D4)時，軍曹魚幼魚肌肉RNA/DNA比值最高，且顯著高于對照組(P<0.05)。這與D4組魚特定生長率最高，并顯著高于對照組(P<0.05)的結(jié)果一致。當對各組魚肌肉RNA/DNA比值與其特定生長率進行線性回歸分析時，r2=0.8422(圖2)，顯示高度正相關(guān)，它們可以互為指示。然而，D3、D4、D5組魚肌肉RNA/DNA比值均顯著高于對照組(P<0.05)，而只有D4組魚特定生長率顯著高于對照組(P<0.05)。如此結(jié)果一方面表明RNA/DNA比值比特定生長率更靈敏地反映生長狀況；另一方面表明丙氨酰—谷氨酰胺和維生素E協(xié)同作用有劑量依賴性，只有D4最優(yōu)配合，才能發(fā)揮最佳的效果。魚的生長主要通過合成蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，而蛋白質(zhì)是由rRNA翻譯合成的。蛋白質(zhì)的含量可以通過RNA的水平來檢測，因此蛋白質(zhì)的合成和魚的生長可通過檢測RNA含量來預測[45]。即使在魚的初始生長階段，通過RNA/DNA比值也可以估算魚的生長速度。由于魚細胞內(nèi)DNA的含量是固定的，而且魚DNA的總量與魚細胞的數(shù)量相關(guān)[46]；通過魚細胞中RNA的含量可以得到RNA/DNA比值[47]。因此，RNA/DNA比值是魚RNA含量的一個較好的指標，而且能準確指示正處于生長過程中的魚的代謝[21]。換言之，在正常生理條件下，細胞DNA含量穩(wěn)定，而RNA含量與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)[48]，RNA/DNA比值或RNA總量可作為蛋白質(zhì)合成的指標之一。相對于其他組織，肌肉RNA/DNA能更敏感[49]地反映魚類生長及健康狀況[50-51]，是海洋生物研究中的重要指標之一[52-54]。通過研究RNA/DNA比值、RNA總量，可以直觀、深入地了解營養(yǎng)因子或環(huán)境變化對魚體的影響[21]。本研究結(jié)果相似于其他學者的報道：肌肉RNA/DNA比值與相對質(zhì)量增加率呈正相關(guān)，肌肉相關(guān)系數(shù)r2=0.958。紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)肌肉RNA/DNA比值能非常靈敏地反映魚體的生長[55]。

添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E飼喂12周后，各組軍曹魚幼魚血清RNA/DNA比值均高于第0周，表明軍曹魚幼魚血清RNA/DNA比值隨著魚體的生長而增加，而且魚血清RNA/DNA比值與特定生長率的線性回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.82705，顯示高度正相關(guān)。表明魚血清RNA/DNA比值也可以準確地指示生物新陳代謝和蛋白質(zhì)合成狀況。而蛋白質(zhì)的合成使組織不斷地修補和更新，并增生新的組織，促進生長，增加體質(zhì)量[56]。王桂芹等[57]在飼料中維生素B6與蛋白質(zhì)的交互作用研究中發(fā)現(xiàn)，烏鱧(Channaargus)血清RNA/DNA比值與烏鱧特定生長率顯著正相關(guān)，這與本研究結(jié)果相似。

總之，在本試驗條件下，添加不同劑量和比例的丙氨酰—谷氨酰胺和/或維生素E可促進軍曹魚幼魚的相對質(zhì)量增加率和特定生長率，也增加其主要組織器官RNA/DNA比值；當每千克干飼料添加丙氨酰—谷氨酰胺 5 g 和維生素E 50 IU時，效果最佳。軍曹魚幼魚的特定生長率與其肌肉、血清的RNA/DNA比值高度正相關(guān)，可互為指示。

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EffectsofDietaryAlanyl-GlutamineandVitaminESupplementsonCobiaRachycentroncanadum

DING Zhaokun, LI Weifeng, HUANG Jinhua, XU Youqing

( Institute for Fishery Sciences, Guangxi University, Nanning 530004, China )

This experiment was performed to study the effects of dietary alanyl-glutamine (AGD) and vitamin E (VE) on the relative weight gain (RWG), specific growth rate (SGR) and RNA/DNA ratio in different tissues/organs of cobia (Rachycentroncanadum) juveniles. Different AGD and/or VE supplements were used to feed the juveniles for 12 weeks. The RWG, SGR, and RNA and DNA content in the liver, muscle, brain, heart, kidney, and serum of the juveniles were measured; their RNA/DNA ratio was calculated, respectively. The SGR and the RNA/DNA ratio of the tissues/organs were analyzed by linear regression. The results showed that dietary AGD and/or VE supplements promoted the SGR of the juveniles. RNA/DNA ratios were exoressed as linear regression against SGR and their orders of r2were: muscle r2> serum r2> liver r2> kidney r2> heart r2> brain r2. In these r2,muscle r2was 0.8422 and serum r2was 0.82705, with highly positive correlations. It was concluded that dietary AGD and/or VE supplements promoted SGR of the juveniles and increased the RNA/DNA ratio in above tissues/organs. The best supplementation was found to be 5 g of AGD and 50 IU of VE per kg dried feed under our experiment conditions.

alanyl-glutamine; vitamin E; specific growth rate; RNA/DNA;Rachycentroncanadum

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.001

S965.389

A

1003-1111(2017)04-0395-08

2016-08-20；

2016-10-26.

國家自然科學基金資助項目(31360639)；廣西生物學博士點建設(shè)項目(P11900116, P11900117)；廣西自然科學基金資助項目(2014GXNSFAA118286, 2014GXNSFAA118292).

丁兆坤(1956—)，男，教授，博士生導師；研究方向：環(huán)境生物學，魚類營養(yǎng)、生理生化與分子生物學.E-mail: zhaokun.ding@hotmail.com. 通訊作者：許友卿(1958—)，女，教授，博士生導師；研究方向：環(huán)境生物學，魚類營養(yǎng)、生理生化與分子生物學. E-mail: youqing.xu@hotmail.com.