過氧乙酸對中華絨螯蟹及池塘生物的毒性研究

鄭 串，潘連德

( 上海海洋大學，省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306 )

過氧乙酸對中華絨螯蟹及池塘生物的毒性研究

鄭 串，潘連德

( 上海海洋大學，省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306 )

水溫(20±1) ℃下， 采用靜態生物毒性試驗的方法，研究了過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹、幼蟹、日本沼蝦及伊樂藻、金魚藻和苦草的毒性。試驗結果表明，過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為39.36、34.36、30.55 mg/L和28.05 mg/L，安全質量濃度為7.86 mg/L；對中華絨螯蟹幼蟹的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為43.55、40.70、36.53 mg/L和31.60 mg/L，安全質量濃度為10.67 mg/L，過氧乙酸對日本沼蝦的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為17.14、14.98、12.02 mg/L和9.50 mg/L，安全質量濃度為3.43 mg/L。根據安全質量濃度可知，對過氧乙酸的耐受性順序為中華絨螯蟹幼蟹>Ⅲ期仔蟹>日本沼蝦。過氧乙酸對伊樂藻、金魚藻和苦草的96 h半有效質量濃度分別為20.13、39.78 mg/L和33.67 mg/L，因此，在蟹塘使用過氧乙酸消毒時，用量需控制在3.43 mg/L以下，防止過氧乙酸的藥害。

急性毒性；過氧乙酸；安全質量濃度

過氧乙酸，別名過醋酸、過氧化乙酸，是過氧有機酸中結構簡單，容易合成，相對穩定性較好的高活性、強氧化性有機酸，廣泛用作高效消毒劑[1-2]。過氧乙酸體積分數不低于0.005%時，在1 min內能殺滅細菌繁殖體，0.05%的過氧乙酸，可在10 s內殺死葡萄球菌(Staphylococcus)噬菌體，對多種細菌、病毒和真菌都有較強的抑殺效果[3-5]。比傳統消毒劑更高效、廣譜、快速殺滅各種微生物，且無有害殘留物[6-8]，廣泛應用于醫藥、食品、畜牧等領域[9-10]，如醫療設備消毒[11-12]、食品包裝消毒[13]、殺滅多種畜禽病毒[14-15]等。近年來，在水產養殖業中也開始推廣應用過氧乙酸[16-17]防治魚苗鰓霉病、多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)、有害單胞藻和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等水產致病菌[1,18]。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國淡水養殖的優勢蟹種[19]。近年來，在主養中華絨螯蟹的池塘中套養日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)已成為一種發展趨勢，可以顯著提高產量[20]。但隨著養殖產量的提高，病害防控尤為重要。在蟹塘病害防治過程中，經驗性、隨意性、過量用藥等不合理用藥致死現象時有發生[21]，過氧乙酸作為一種綠色環保的水產消毒劑，在進行中華絨螯蟹養殖水體消毒時不僅要注重消毒效果，還要考慮對中華絨螯蟹、日本沼蝦和池塘水草的影響。目前，尚未見過氧乙酸對中華絨螯蟹、日本沼蝦和池塘水草影響的研究報道，為此，本試驗研究了過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹、幼蟹、日本沼蝦及伊樂藻(Elodeanuttallii)、金魚藻(Ceratophyllumdemersum)和苦草(Vallisnerianatans)的毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹、幼蟹、日本沼蝦、伊樂藻、金魚藻和苦草均取自上海市崇明縣某中華絨螯蟹養殖場。中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹和幼蟹的體質量分別為(0.06±0.01) g和(3.26±0.11) g，日本沼蝦為(1.44±0.11) g，暫養7 d后用于試驗，試驗前2 d停食。

試驗用水為蟹場養殖用水，水溫(20±1) ℃，pH 7.30±0.10，溶解氧(5.00±0.30) mg/L，總氨氮(0.08±0.01) mg/L，試驗容器均為25 cm×30 cm×30 cm的玻璃缸。

過氧乙酸(15%)由索爾維有限公司提供，丙酮(分析純)和碳酸鎂(分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司。試驗開始前,配制過氧乙酸母液，再根據需要配制成不同的質量濃度，所添加母液體積不超過試驗用水的5‰[22],過氧乙酸需現配現用。

1.2 方法

根據預試驗結果，按等對數間距設定質量濃度梯度，每組設3個重復。采用靜態生物毒性試驗方法[23]，在玻璃缸中加入18 L試驗用水，加入母液配制成試驗藥液，對照組加入等體積的試驗用水，每個試驗缸中放入健康的試驗對象8只(尾),并放置消毒過的瓦片作為遮蔽物，置于陰涼通風處進行試驗，每24 h更換一次相同質量濃度的藥液，試驗周期為96 h。前24 h進行連續觀察，試驗過程中每隔4 h測量一次水體溶解氧和水溫[23],以后記錄每組的24、48、72 h和96 h死亡數,及時撈出死亡個體。以玻璃棒輕觸腹部不產生應激反應為死亡標準[24]。

每個試驗缸底鋪入池塘取回的泥沙5 cm，植入鮮質量為(10.00±0.10) g，根系完整、長勢良好的水草，光暗比為12 h∶12 h ，光照度2000 lx，加入母液配制成試驗藥液，對照組加入等體積的試驗用水，試驗組每24 h更換一次相同質量濃度的藥液。測水草葉綠素a的含量和質量損失率,水草葉綠素a含量測定采用丙酮法[25]。

1.3 數據處理

試驗數據采用寇氏法[24]計算半致死質量濃度(LC50)、安全質量濃度(SC)和半致死質量濃度的95%的置信區間，并做試驗質量濃度對數(x)和死亡率(y)的回歸方程。計算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

LogLC50的95%置信限=LogLC50±1.96×d[∑(p×g/n)]1/2

式中，Xm為最大劑量的對數，d為相鄰劑量組比值的對數，p為死亡率，∑p為各組死亡率之和，g為存活率，n為每組受試對象數目。

折損率/%=(起始質量-終末質量)/起始質量×100%

葉綠素a含量的計算參照國家標準[26]進行。

試驗數據用SPSS 17.0進行單因素方差分析，Duncans法進行多重比較，顯著性水平為0.05[27]。

2 結 果

2.1 過氧乙酸對中華絨螯蟹的毒性

試驗過程中，前24 h的連續觀察發現，中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹和幼蟹在不同質量濃度的過氧乙酸環境中分別表現出了不同程度的中毒癥狀(圖1a～b)。當處于低質量濃度過氧乙酸條件下時，活動情況與對照組無明顯差異。自23.70 mg/L用量開始，中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹開始表現出不適，狂躁不安，向四周亂爬，個別停止運動，安靜地死去，在藥物質量濃度達到35.56 mg/L時，中華絨螯蟹幼蟹表現出相同的中毒癥狀，隨著藥物質量濃度不斷提高，中毒癥狀愈發明顯，死亡的中華絨螯蟹仔蟹和幼蟹背甲發黃，沉入水底。用玻璃棒輕觸腹部沒有應激反應。

2.1.1 過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹的毒性

24 h時過氧乙酸質量濃度23.70 mg/L組的中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹開始死亡，在80.00 mg/L的質量濃度條件下脅迫72 h全部致死，隨著過氧乙酸質量濃度的增加，Ⅲ期仔蟹的死亡率明顯上升，脅迫時間越長，死亡率越高(表1)。過氧乙酸對Ⅲ期仔蟹脅迫24 h的半致死質量濃度為39.36 mg/L，當脅迫時間延長到48、72 h和96 h時，半致死質量濃度分別為24 h的87.30%、77.62%和71.27%，表明隨著過氧乙酸脅迫時間的延長，對Ⅲ期仔蟹的毒性也越大(表2)。統計結果表明，過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹的安全質量濃度為7.86 mg/L。

2.1.2 過氧乙酸對中華絨螯蟹幼蟹的毒性

24 h時過氧乙酸質量濃度23.70 mg/L組的中華絨螯蟹幼蟹開始死亡，在80.00 mg/L的質量濃度條件下脅迫96 h全部致死，隨著過氧乙酸質量濃度的增加，幼蟹的死亡率明顯上升，脅迫時間越長，死亡率越高(表1)。過氧乙酸對中華絨螯蟹幼蟹脅迫24 h的半致死質量濃度為 43.55 mg/L，當脅迫時間延長至48、72 h和96 h時，半致死質量濃度分別為24 h的93.46%、83.89%和72.56%。隨著過氧乙酸脅迫時間的延長，對中華絨螯蟹幼蟹產生的毒性也越大(表2)。統計結果表明，過氧乙酸對幼蟹的安全質量濃度為10.67 mg/L。

2.2 過氧乙酸對日本沼蝦的毒性

日本沼蝦對過氧乙酸的刺激反應較大。開始時日本沼蝦急躁狂游，游動毫無方向，四處亂撞，隨著脅迫時間的延長，漸漸平靜下來，逐漸變成仰游或側游, 頭胸甲與肌肉易分離，體色發白(圖1c～d)，身體失去平衡沉底死亡[28]。

24 h時過氧乙酸質量濃度為7.50 mg/L時日本沼蝦開始死亡，在25.31 mg/L的質量濃度條件下脅迫96 h日本沼蝦全部死亡。隨著過氧乙酸脅迫質量濃度的增加，日本沼蝦的死亡率明顯上升，脅迫時間越長，死亡率越高(表1)。過氧乙酸對日本沼蝦脅迫24 h的半致死質量濃度為17.14 mg/L，當脅迫時間延長到48、72 h和96 h時，半致死質量濃度分別為24 h的87.40%、70.13%和55.43%。隨著過氧乙酸脅迫時間的延長，對日本沼蝦產生的毒性也越大(表2)。統計結果表明，過氧乙酸對日本沼蝦的安全質量濃度為3.43 mg/L。

圖1 中華絨螯蟹和日本沼蝦在過氧乙酸脅迫下的形態變化a為對照組的中華絨螯蟹；b為中毒死亡的中華絨螯蟹；c為對照組的日本沼蝦；d為中毒死亡的日本沼蝦.

試驗對象質量濃度mg/L死亡率/%24h48h72h96h中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹對照組15.8023.7035.5653.3380.00120.000020.8341.6775.0087.50100.0004.1729.1750.0083.3391.67100.0008.3333.3362.5083.33100.00100.00012.5033.3366.6795.83100.00100.00中華絨螯蟹幼蟹對照組15.8023.7035.5653.3380.00120.000012.5033.3366.6787.50100.000016.6741.6766.6791.67100.0004.1716.6750.0079.1791.67100.0008.3329.1750.0091.67100.00100.00日本沼蝦對照組5.007.5011.2516.8825.3137.97008.3325.0045.8366.67100.000016.6729.1758.3375.00100.0008.3329.1737.5070.8387.50100.00012.5037.5050.0091.67100.00100.00

2.3 過氧乙酸對水草的毒性

2.3.1 水草形態顏色的變化

試驗過程中，隨著過氧乙酸含量的增加和脅迫時間的延長，3種水草的形態和顏色均發生了一定的變化(圖2)。在35.56 mg/L 的質量濃度下脅迫24 h，伊樂藻的葉片開始由綠變為淺黃色。隨著脅迫質量濃度的增加和時間的延長，水草莖也開始由綠變黃，繼而轉變為白色，葉片則由黃變白，直至全部變白死亡。金魚藻則在15.80 mg/L的質量濃度下脅迫24 h，就開始由綠變黃?？嗖萑~片則在23.70 mg/L的質量濃度下脅迫24 h，開始發黃，隨著脅迫時間和質量濃度的增加，全部變白死亡。試驗結束時，120.00 mg/L質量濃度下，3種水草葉片發白，莖易折斷失去韌性，可以認定水草死亡[29]。

2.3.2 水草質量的變化

在過氧乙酸脅迫作用下，3種水草的質量均發生了顯著性改變。在15.80 mg/L的質量濃度條件下，伊樂藻和苦草質量損失率開始出現顯著性變化，最大質量損失率分別達21.54%和30.72%。金魚藻的質量損失率則在23.70 mg/L的質量濃度條件下才開始出現顯著性變化，最大質量損失率可達41.41%。3種水草隨著過氧乙酸脅迫質量濃度的增加和脅迫時間的延長，質量損失率均上升(表3)。

試驗對象試驗時間h半致死質量濃度mg/L95%置信區間mg/L回歸方程相關系數安全質量濃度mg/L中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹2448729639.3634.3630.5528.0531.09～49.8227.11～43.5424.27～38.4622.60～34.83y=0.5168x-1.4094y=0.4933x-1.2651y=0.4785x-1.1606y=0.4697x-1.09280.980.980.970.957.86中華絨螯蟹幼蟹2448729643.5540.7036.5331.6034.65～54.7432.29～51.3129.02～45.9625.38～39.35y=0.5344x-1.5172y=0.5284x-1.4670y=0.5167x-1.3810y=0.5021x-1.26360.990.990.980.9610.67日本沼蝦2448729617.1414.9812.029.5013.47～21.8011.70～19.189.30～15.537.55～11.95y=0.4895x-0.8743y=0.4953x-0.8339y=0.4688x-0.6743y=0.4689x-0.57720.980.990.990.963.43

表3 過氧乙酸對水草質量的影響

注: 表中同一列上標不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，標相同字母的平均值間差異不顯著(P>0.05)，下同.

2.3.3 水草葉綠素a含量的變化

在試驗過程中，3種水草都經歷了由綠變黃最后變白的過程，葉綠素a含量也發生了變化。由表4～6可見，金魚藻、苦草和伊樂藻分別在15.80、23.70 mg/L和35.56 mg/L條件下脅迫24 h，葉綠素a含量開始出現顯著性下降，在120.00 mg/L條件下脅迫24 h，葉綠素a含量分別降低為對照組的22.12%、5.53%和13.62%。脅迫質量濃度相同的條件下，隨著作用時間的延長，葉綠素a含量下降，3種水草的變化趨勢相似。

表4 過氧乙酸質量濃度對伊樂藻葉綠素a含量的影響 μg/g

表5 過氧乙酸質量濃度對金魚藻葉綠素a含量的影響 μg/g

表6 過氧乙酸質量濃度對苦草葉綠素a含量的影響 μg/g

3 討 論

3.1 過氧乙酸對中華絨螯蟹的毒性作用

由試驗結果可知，過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹、幼蟹的96 h半致死質量濃度分別為28.05 mg/L和31.60 mg/L，均屬于微毒性；幼蟹的半致死質量濃度大于Ⅲ期仔蟹，這可能與蟹的規格有關。本試驗中中華絨螯蟹幼蟹平均體質量(2.256 g)遠大于Ⅲ期仔蟹(0.055 g)。有報道指出，耐苯扎溴銨毒性能力中華絨螯蟹幼蟹>Ⅲ期仔蟹>Ⅰ期仔蟹>中華絨螯蟹大眼幼體，表明苯扎溴銨對中華絨螯蟹毒性大小與其個體大小成負相關[30-31]，還有研究表明，耐甲醛毒性能力中華絨螯蟹溞狀Ⅳ期>中華絨螯蟹溞狀Ⅲ期>中華絨螯蟹溞狀Ⅱ期>中華絨螯蟹溞狀Ⅰ期[32]，甲醛對中華絨螯蟹的毒性[32]也與本試驗結果相似。可見中華絨螯蟹對這些藥物的耐受性隨個體的增長而變強。

3.2 過氧乙酸對日本沼蝦的毒性作用

3.3 過氧乙酸對中華絨螯蟹和日本沼蝦的毒性比較

本試驗中,中華絨螯蟹和日本沼蝦對過氧乙酸表現出不同的耐受性。對過氧乙酸的耐受性為中華絨螯蟹幼蟹>中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹>日本沼蝦，中華絨螯蟹表現出更強的耐受性，這可能與生物骨質化程度有關。有研究指出，羅氏沼蝦(M.rosenbergii)和中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)對甲醛的耐受性為羅氏沼蝦>中國明對蝦[34]。通過與中華絨螯蟹進行比較得出，對甲醛的耐受性為中華絨螯蟹>羅氏沼蝦>中國明對蝦[32]，這與本試驗結論相似，由于蟹類身體骨質化程度較高，故表現出了較強的耐受性。

3.4 過氧乙酸對3種水草的毒性作用

本試驗對水草的抑制作用主要體現在質量損失率和葉綠素a含量上。比較相同作用時間下，葉綠素a含量最先出現顯著性差異的脅迫質量濃度可知，過氧乙酸對金魚藻的葉綠素a含量脅迫作用更明顯。在相同脅迫質量濃度作用下，比較質量損失率最先出現顯著性差異可知，過氧乙酸對伊樂藻和苦草的質量變化脅迫作用較金魚藻敏感。本試驗參照已有的研究方法[27],求出過氧乙酸對伊樂藻、金魚藻和苦草的96 h半有效質量濃度分別為20.13、39.78 mg/L和33.67 mg/L，因此，對過氧乙酸的耐受性順序為金魚藻>苦草>伊樂藻。

有研究表明，撲草凈對金魚藻的240 h半有效質量濃度僅為0.13 mg/L[27]。異噻唑啉酮類藥物在5 mg/L以上才開始對伊樂藻產生明顯的毒害作用[35]，當四環素質量濃度達到4 mg/L時嚴重破壞了苦草細胞的結構[36]。不同藥物對水草毒性作用差異較大，可能與藥物作用機理有關。用檸檬酸和乙酸抑制黃絲藻(Tribonemasp.)，通過酸性來破壞葉綠素的結構，藻體顏色由綠變黃再變為白色[37]，這與本試驗水草顏色變化相似，表明過氧乙酸可能存在相似的作用機制。3種水草在過氧乙酸的脅迫作用下葉片最先開始變化，可能是過氧乙酸同撲草凈作用部位相似，主要作用于植物葉片[38]。

過氧乙酸作為一種綠色環保的消毒劑,今后在水產養殖中應用會越來越廣泛[39]。通常認為，水體中有機物含量、溫度和酸堿度等均可影響過氧乙酸的消毒效果，降低毒性[40-42]，為全面了解過氧乙酸對其他水生生物的影響及作用機制，還應進行更深入的研究。

4 結 論

過氧乙酸對中華絨螯蟹Ⅲ期仔蟹的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為39.36、34.36、30.55 mg/L和28.05 mg/L，安全質量濃度為7.86 mg/L；對幼蟹的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為43.55、40.70、36.53 mg/L和31.60 mg/L，安全質量濃度為10.67 mg/L；對日本沼蝦的24、48、72 h和96 h的半致死質量濃度分別為17.14、14.98、12.02 mg/L和9.50 mg/L，安全質量濃度為3.43 mg/L。根據安全質量濃度的大小，對過氧乙酸的耐受性順序為中華絨螯蟹幼蟹>Ⅲ期仔蟹>日本沼蝦。

過氧乙酸對伊樂藻、金魚藻和苦草的96 h半有效質量濃度分別為20.13、39.78 mg/L和33.67 mg/L,對過氧乙酸的耐受性順序為金魚藻>苦草>伊樂藻。

因此，在套養日本沼蝦的池塘中使用過氧乙酸時，使用質量濃度應盡量控制在3.43 mg/L以下，防止過氧乙酸造成藥害。

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ToxicityofPeraceticAcidtoJuvenileChineseMittenHandedCrabEriocheirsinensisandAquaticOrganismsinPonds

ZHENG Chuan，PAN Liande

( Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai 201306，China )

A static toxicity test was conducted to study toxicity of peracetic acid to Chinese mitten handed crab (Eriocheirsinensis) moulted three times (Ⅲ) and juveniles, oriental river prawn (Macrobrachiumnipponense)，and three species of aquatic plantsElodeanuttallii，CeratophyllumdemersumandVallisnerianatansat water temperature of (20±1) ℃.The results showed that the median lethal concentration (LC50)of Ⅲ stage Chinese mitten handed crab juveniles was 39.36 mg/L at 24 h, 34.36 mg/L at 48 h, 30.55 mg/L at 72 h and 28.05 mg/L at 96 h, with safe concentration (SC)of 7.86 mg/L. The LC50of the Chinese mitten handed crab juveniles was 43.55 mg/L at 24 h, 40.70 mg/L at 48 h, 36.53 mg/L at 72 h and 31.60 mg/L at 96 h, with SC of 10.67 mg/L. The LC50of oriental river prawn was 17.14 mg/L at 24 h, 14.98 mg/L at 48 h,12.02 mg/L at 72 h and 9.50 mg/L at 96 h, with SC of 3.43 mg/L, indicating that the toxic resistance of the aquatic animals in the experiment to peracetic acid was followed as juvenile Chinese mitten handed crab>Ⅲ stage Chinese mitten handed crab juvenile>oriental river prawn. The concentration for 50% of maximal effect(EC50)at 96 h on theE.nuttallii,C.demersumandV.natanswas 20.13 mg/L, 39.78 mg/L and 33.67 mg/L,respectively. Therefore, peracetic acid disinfection should be applied as a dose of less than 3.43 mg/L in a Chinese mitten handed crab culture pond to prevent the harm of peracetic acid.

acute toxicity; peracetic acid; safety concentration

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.002

S948

A

1003-1111(2017)04-0403-08

2016-05-24；

2016-09-12.

水產動物遺傳育種上海市協同創新中心資助項目(ZF1206).

鄭串(1992-)，男，碩士研究生；研究方向：水產動物醫學.E-mail:15001885650@163.com. 通訊作者： 潘連德(1960-)，男，教授；研究方向：水產動物健康養殖和醫學.E-mail：landp@shou.edu.cn.