兩種海水酸化模式對中間球海膽早期發育及存活的影響

孫景賢，劉敏博，李家祥，楊夢羽，胡婉彬，常亞青，黃顯雅，段立柱，湛垚垚

( 大連海洋大學 水產與生命學院，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連116023 )

兩種海水酸化模式對中間球海膽早期發育及存活的影響

孫景賢，劉敏博，李家祥，楊夢羽，胡婉彬，常亞青，黃顯雅，段立柱，湛垚垚

( 大連海洋大學 水產與生命學院，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連116023 )

采用二氧化碳法和強酸法模擬海水酸化效應，研究兩種海水酸化模式對中間球海膽早期發育及存活的影響。試驗結果顯示，兩種海水酸化模式均能降低中間球海膽胚胎的上浮率和四腕浮游幼體的存活率；顯微觀察得知，兩種海水酸化模式下，中間球海膽四腕浮游幼體均出現對稱性缺失和骨針外露現象，且對稱性缺失程度隨海水pH的降低而升高；掃描電鏡觀察發現，兩種海水酸化模式下，中間球海膽四腕浮游幼體骨針的表面及橫截面均有溶蝕痕跡，且溶蝕程度隨海水pH的降低而加劇。結果提示，海水酸化可通過降低胚胎上浮率、浮游幼體存活率以及破壞幼體對稱性和骨針結構影響中間球海膽的早期發育及存活。

海水酸化；中間球海膽；早期發育；存活；骨針

工業革命以來，由于化石燃料的大量燃燒和森林的退化，CO2在大氣中的體積分數已從工業革命前的約0.28‰升至目前的0.395‰，這些CO2中的30%～40%被海洋所吸收，導致海水酸化現象的產生[1]。海水酸化的本質是由于大氣中增加的CO2和海水中的H2O反應形成H2CO3,放出了H+,使海水的pH下降。增多的H+和碳酸鹽離子結合形成碳酸氫鹽,導致碳酸根離子減少[2]。聯合國政府間氣候變化專門委員會報告顯示，自1880年以來，海洋平均pH下降了0.12，預計到本世紀末(2100年)，地球海水的平均pH將會再降0.3～0.5[3]。有研究表明，地球海水表面的pH正在以難以預計的速度下降[4]，不斷加劇的海水酸化現象不僅破壞了海水碳酸鹽體系的動態平衡，也同時改變了海洋生物的棲息環境和生存環境，勢必會對海洋生物與海洋生態系統產生深遠的影響[5]。Doney等[6-7]曾指出，海水酸化對海洋環境下的食物鏈以及生態系統會產生深遠、復雜的影響，想要全面地認識和了解未來海水酸化將對海洋生態系統、食物鏈乃至全球生態系統造成的作用和影響，就必須全面地評估海洋生物對海水酸化的應答。迄今為止，已被評估的生物僅占海洋物種總數的2%[8]。

當前，評估海水酸化對海洋生物影響的主要方式是在實驗室條件下通過模擬海水酸化條件而進行的，模擬海水酸化的主要方法有CO2法[9]和強酸法[10]兩種，CO2法是指通過持續向海水中通入CO2氣體而達到模擬海水酸化的目的，而強酸法是指在海水中加入HCl、H2SO4等強酸來降低海水的pH。目前，人們已經利用CO2法或強酸法研究了海水酸化對海藻[10]、珊瑚[11]、棘皮動物[12]、軟體動物[13-14]、魚類[15-16]等海洋生物的生長和發育的影響。

海膽屬棘皮動物門、游在亞門、海膽綱，其早期發育可大致分為3個階段，即胚胎發育、浮游幼體以及匍匐變態階段[17]。其中，胚胎的健康發育是其后兩個發育階段的基礎和保障，浮游幼體階段則是關聯胚胎發育和匍匐變態兩個階段的關鍵環節。有研究表明，海膽在其胚胎發育和浮游幼體發育階段對于環境因子(pH、鹽度、溫度等)的變化最為敏感，若這兩個時期的生長發育受到影響，日后將會對該物種群落的地理分布、種群數量、遺傳多樣性以及環境適應能力等產生復雜而深刻的影響[18]，對經濟海膽而言，早期發育的健康與否將直接影響海膽日后的出苗率和成體海膽的產量，進而影響海膽產業和漁業經濟的發展。

中間球海膽(Strongylocentrotusintermedius)原產于日本北海道和俄羅斯遠東等地沿海，1989年自日本引入[19]，現已在大連、山東等地形成一定的人工養殖規模，是我國北方沿海最重要的經濟海膽種類。本研究以中間球海膽為對象，通過比較和分析CO2酸化脅迫和HCl酸化脅迫兩種模擬海水酸化模式下中間球海膽胚胎發育、浮游幼體存活及形態學變化等，探究海水酸化對中間球海膽早期發育及存活的影響，為更好地為評估海水酸化對經濟類海膽以及海洋生態的影響提供更多的參考資料，為進一步評估海水酸化對海洋漁業的發展提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用中間球海膽，平均殼徑(59.79±1.84) mm，購自大連海寶漁業有限公司，于大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室1 t循環水水槽中暫養5 d后用于試驗，暫養期間投喂海帶(Sacchrinajaponica)，養殖海水pH 8.00±0.03，溫度(20.06±0.12) ℃，鹽度31.23±0.13。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸化海水的制備

試驗使用“實驗室模擬海洋酸化系統”(專利號：ZL 2013 2 0267332.7)作為酸化海水制備裝置，CO2海水酸化模式的海水按照文獻[20]中方法進行制備，HCl海水酸化模式的海水按照文獻[12]中方法進行制備。根據政府間氣候變化專門委員會對2100年的海水pH的預測[3]，本試驗設置1個自然海水組，2個CO2脅迫組以及2個強酸(HCl)脅迫組，每組設置3個平行，組別設置及處理條件見表1。

表1 試驗組別與處理條件

每日采用pH計(HI 9124，HANNA，意大利)和水質儀(YSI 6920)對各試驗組海水的pH、溫度和鹽度進行監測，確保試驗前后海水參數的穩定性。試驗前后海水化學參數情況見表2。

1.2.2 配子的獲得

按照文獻[21]中的方法對中間球海膽進行人工催產和配子的收集。使用顯微鏡在人工授精前預先檢查配子的形態和活性，采用試受精率在95%以上的配子作為本試驗授精用配子。為避免由于個體差異而帶來的試驗誤差，本試驗使用多雌(3只)對多雄(3只)的授精方法。

1.2.3 酸化脅迫

按照文獻[20]中的方法進行CO2法的酸化脅迫，按照文獻[12]中的方法進行強酸法(HCl)的酸化脅迫，將活力良好的中間球海膽配子分別置于自然海水對照組和各個海水酸化脅迫組中進行授精。

1.2.4 樣本和數據的收集

采用五點取樣法[19]分別于授精后18 h和70 h時分別收集各試驗組樣品，每組各1 mL，重復3次，計算不同脅迫條件下，中間球海膽胚胎的上浮率及四腕浮游幼體的存活率：

上浮率/%=18 h采樣所得胚胎數量/初始密度×100%

存活率/%=70 h采樣所得浮游幼體數量/初始密度×100%

于光學顯微鏡下(50i，Nikon)觀察各組中間球海膽四腕浮游幼體的形態；參照文獻[22]中方法制備中間球海膽四腕浮游幼體骨針，并于掃描電鏡(Quanta200，FEI)下觀察各試驗組中間球海膽四腕浮游幼體骨針鈣化超顯微結構。

1.2.5 數據分析

試驗所得數據全部采用平均值±標準差表示。對試驗數據的整理及圖表的繪制采用Excel 2010，對試驗數據的統計學分析采用SPSS 16.00進行，對試驗結果進行顯著性分析利用單因素方差分析Tukey檢驗，差異顯著性水平設置為α=0.05，差異極顯著水平設置為α=0.01。

表2 試驗前后海水化學參數情況

2 結果與分析

2.1 兩種海水酸化模式對中間球海膽胚胎上浮率的影響

與自然海水組相比，授精18 h后，海水酸化處理組中間球海膽胚胎上浮率隨海水pH的降低而呈逐漸降低趨勢(圖1)。通過統計學分析發現，CO2酸化脅迫能夠顯著降低中間球海膽胚胎的上浮率，其中CO2酸化脅迫組1上浮率與自然海水組相比呈顯著性差異(P<0.05)，而CO2酸化脅迫組2上浮率與自然海水組相比差異極顯著(P<0.01)(圖1a)；2個HCl酸化處理組中間球海膽上浮率與自然海水組相比均無顯著性差異(P>0.05)(圖1b)。當△pH=-0.3時，兩種海水酸化模式對中間球海膽上浮率的影響無顯著性差異(P>0.05)，而當△pH=-0.5時，CO2酸化脅迫組中間球海膽上浮率低于HCl酸化脅迫組，且差異極顯著(P<0.01)(圖1c)。

2.2 兩種海水酸化模式對中間球海膽浮游幼體存活率的影響

受精后70 h，檢測計算各試驗組中間球海膽浮游幼體存活率發現，海水酸化可顯著降低中間球海膽浮游幼體的存活率，且呈現浮游幼體存活率隨海水pH降低而降低的趨勢(圖2)。與自然海水組相比，當△pH=-0.3時，CO2酸化脅迫組1和HCl酸化脅迫組1中間球海膽浮游幼體存活率成顯著下降趨勢(P<0.05)(圖2a,b)；當△pH=-0.5時，CO2酸化脅迫組2和HCl酸化脅迫組2中間球海膽浮游幼體存活率與自然海水組相比均顯著降低，且差異極顯著(P<0.01)。同一pH條件下，兩種模擬海水酸化模式對中間球海膽浮游幼體存活率的影響并無顯著性差異(P>0.05)(圖2c)。

圖1 兩種海水酸化模式對中間球海膽胚胎上浮率的影響a. CO2法模擬海水酸化對中間球海膽胚胎上浮率的影響；b. HCl法模擬海水酸化對中間球海膽胚胎上浮率的影響；c. 兩種酸化模式下中間球海膽胚胎上浮率的比較.*表示與自然海水組相比差異顯著(P<0.05)；**表示與自然海水組相比差異極顯著(P<0.01).

圖2 兩種海水酸化模式對中間球海膽浮游幼體存活率的影響a.CO2法模擬海水酸化對中間球海膽浮游幼體存活率的影響；b. HCl法模擬海水酸化對中間球海膽浮游幼體存活率的影響；c.兩種酸化模式下，中間球海膽浮游幼體存活率的比較. *表示與自然海水組相比差異顯著(P<0.05)；**表示與自然海水組相比差異極顯著(P<0.01).

2.3 兩種模擬海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響

在光學顯微鏡下對中間球海膽四腕浮游幼體的形態進行觀察，發現自然海水組中間球海膽浮游幼體形態對稱性良好，骨針發育完整(圖3)。與自然海水組浮游幼體相比，CO2酸化脅迫組中間球海膽四腕浮游幼體則出現體長變短、骨針外露、一側骨針缺失及對稱性缺失現象，這些現象隨著pH的降低而加劇(圖3a)。同樣，HCl酸化脅迫組中的中間球海膽浮游幼體與自然海水組相比也出現了對稱性缺失、骨針外露、一側骨針發育不全的現象，且這些現象也隨pH的降低而加劇(圖3b)。△pH=-0.5時，CO2酸化脅迫組中間球海膽四腕浮游幼體體長變短、骨針外露、一側骨針發育不全及對稱性缺失現象較HCl酸化脅迫組明顯(圖3)。

圖3 兩種海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響a. CO2法模擬海水酸化對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響；b. HCl法模擬海水酸化對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響.箭頭指示外露骨針；紅色虛線表示四腕浮游幼體不對稱程度.

2.4 兩種模擬海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體骨針超顯微結構的影響

掃描電鏡結果顯示，自然海水組中間球海膽四腕浮游幼體骨針的表面和橫截面比較光滑，鈣化結構較為均勻且致密，無溶蝕痕跡(圖4)。隨著海水pH值的降低，兩種海水酸化模式下，中間球海膽四腕浮游幼體呈現出鈣化結構疏松和溶蝕現象，且疏松及溶蝕程度隨海水pH值的降低而加劇。其中，CO2酸化脅迫組1四腕浮游幼體的骨針表面雖然也比較致密均勻，但相比自然海水組則更為粗糙，可觀察到明顯的溶蝕痕跡；CO2酸化脅迫組2四腕浮游幼體的骨針結構疏松，溶蝕現象十分嚴重，有大量、明顯的溶蝕痕跡(圖4b)；HCl酸化脅迫組1四腕浮游幼體的骨針表面與自然海水組相比，結構依然致密，但表面更加粗糙，有溶蝕痕跡，HCl酸化脅迫組2四腕浮游幼體的骨針表面，與自然海水組相比，結構疏松，被溶蝕程度嚴重，骨針表面密布溶蝕痕跡(圖4c)。pH相同時，兩種海水酸化模式對中間球海膽四腕幼體骨針結構的影響程度較為一致，不存在明顯的差異。

圖4 兩種酸化脅迫模式對中間球海膽浮游幼體骨針結構的影響a.中間球海膽四腕浮游幼體骨針模式圖；b.CO2法模擬海水酸化對中間球海膽浮游幼體骨針結構的影響；c. HCl法模擬海水酸化對中間球海膽浮游幼體骨針結構的影響；箭頭指示溶蝕部位.

3 討 論

3.1 兩種海水酸化模式對中間球海膽胚胎上浮率和四腕浮游幼體存活率的影響

在傳統的經濟海膽育苗中，海膽胚胎的上浮率和浮游幼體的存活率是衡量海膽成活率和出苗率的重要指標[17]。而海洋酸化的加劇會降低海洋生物的呼吸代謝酶活性，改變其呼吸代謝方式，會嚴重影響海洋生物的存活能力[23]。本研究結果顯示，CO2海水酸化模式和HCl海水酸化模式均可顯著降低中間球海膽胚胎的上浮率和四腕浮游幼體的存活率，這一結果與Kurihara等[12]的研究結果具有一定相似性。推測其原因，可能是由于海水pH的降低改變了中間球海膽胚胎內部[H+]-[OH-]離子的動態平衡，導致[H+]在胞內大量堆積，破壞了其內部的離子調節系統，進而引發細胞組織滲透壓的改變，造成細胞的損傷或破裂，最終導致其無法繼續生存[24]。值得注意的是，當△pH=-0.5時，相較于HCl海水酸化脅迫而言， CO2海水酸化脅迫可顯著降低中間球海膽胚胎的上浮率。有報道指出[25]，由CO2過量排放而導致的海水酸化可通過影響南極硅藻(Nitzschialecointei)的碳代謝而抑制其生長，因此，筆者推測CO2海水酸化脅迫對中間球海膽早期存活的影響比HCl海水酸化脅迫的更為復雜，需進一步開展相關的分子生物學研究，以探明其復雜的基因調控網絡。

3.2 兩種模擬海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響

發育良好的形態是影響海膽浮游幼體生存的關鍵因素之一，不良的浮游幼體形態將會影響海膽浮游幼體的攝食和生態分布[26]。本研究結果顯示，CO2海水酸化模式和HCl海水酸化模式下中間球海膽四腕浮游幼體均出現體長變短、骨針外露、一側骨針缺失以及對稱性喪失等現象，相比于HCl海水酸化模式，CO2海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體形態的影響更為嚴重，這一結果與對白棘三列海膽(Tripneustesgratilla)[27]、馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)和梅氏長海膽(Echinometramathaei)[12]的研究結果一致。Matson等[28]通過試驗證實，海洋酸化并不影響紫球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)的蛋白質代謝和脂類代謝，但是，他們推測紫球海膽可能是通過減小身體體積節省能量的方式來緩解海水酸化的脅迫效應，據此推測，與紫球海膽同屬于球海膽科的中間球海膽也應該是通過減小身體體積的方式應答海水酸化的脅迫效應，但其分子機制仍需進一步的深入研究。

3.3 兩種模擬海水酸化模式對中間球海膽四腕浮游幼體骨針超顯微結構的影響

3.4 小結

綜上所述，海水酸化可影響中間球海膽的早期發育及存活，進而對中間球海膽產業和海洋生態產生一定的影響。相比由HCl引起的海水酸化而言，由CO2過量排放而引起的海水酸化對中間球海膽早期發育和存活的影響更為復雜，關于其詳細的作用機制，還需要進一步在分子水平上進行更深入的研究，才能使我們更加清晰和全面地了解中間球海膽響應海水酸化的機制。

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EffectsofTwoKindsofSeawaterAcidificationScenarioonEarlyDevelopmentandSurvivalinSeaUrchinStrongylocentrotusintermedius

SUN Jingxian, LIU Minbo, LI Jiaxiang, YANG Mengyu, HU Wanbin, CHANG Yaqing, HUANG Xianya, DUAN Lizhu, ZHAN Yaoyao

( Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North Chinas Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

The carbon dioxide (CO2) method and strong acid (HCl) method were used to simulate seawater acidification scenario to study the effects of seawater acidification on early development and survival in the sea urchinStrongylocentrotusintermedius. Results showed that the percent hatched blastulae and four-armed larval survival rate were decreased as seawater pH decreased compared to that in the control; as compared to the larvae reared in control condition, the symmetry of four-armed larvae were affected either in CO2-induced seawater acidification conditions or HCl-induced seawater acidification conditions; scanning electron microscopy(SEM) revealed that the surface and cross-section of spicules of the sea urchin larvae in control group were smooth, dense and uniform. However, corrosion was observed in both surface and cross-section of spicules of the sea urchin larvae cultured in both CO2-induced seawater acidification and HCl-induced seawater acidification scenarios as compared to that in the control, the corrosion degree being increased as seawater pH decreased. The finding suggested that both CO2-induced seawater acidification and HCl-induced seawater acidification affected the early development and survival of the sea urchin negatively, especially CO2-induced seawater acidification.

seawater acidification;Strongylocentrotusintermedius; early development; survival; spicule

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.005

S968.9

A

1003-1111(2017)04-0429-07

2016-04-26；

2016-09-06.

國家自然科學基金資助項目(41206128).

孫景賢(1991—), 碩士研究生；研究方向: 生物化學與分子生物學. E-mail: 537739sun@gmail.com. 通訊作者: 湛垚垚(1978—), 副教授, 博士；研究方向: 海洋生物學、生物化學與分子生物學.E-mail:zhanyaoyao@dlou.edu.cn.