鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序檢測技術的建立

劉 瑤，尹偉力，張四化，岳志芹，孫 濤

( 1.榮成出入境檢驗檢疫局，山東 榮成 264300； 2.煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫中心，山東 煙臺 264000；3.武漢市動物疫病防控中心，湖北 武漢 430003； 4.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東 青島 266002 )

鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序檢測技術的建立

劉 瑤1，尹偉力2，張四化3，岳志芹4，孫 濤4

( 1.榮成出入境檢驗檢疫局，山東 榮成 264300； 2.煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫中心，山東 煙臺 264000；3.武漢市動物疫病防控中心，湖北 武漢 430003； 4.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東 青島 266002 )

通過收集鯉春病毒血癥病毒基因序列，設計了鯉春病毒血癥病毒最為保守的指紋序列，以及測序引物，建立了鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序檢測方法。對所構建的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測方法進行特異性試驗和靈敏度檢測，試驗結果表明所建立的方法特異性好，在8種魚類病毒中能夠特異性檢測出目的病毒，檢測方法靈敏度高，最低檢出核酸量為10 pg/μL。對建立的焦磷酸測序檢測方法進行了實際應用研究，選取國內采集與進口的魚類樣本共計80批次進行鯉春病毒血癥病毒檢測。結果顯示，焦磷酸測序檢測方法可以有效的檢出常規RT-PCR不能檢出的假陰性樣本和弱陽性樣本，該方法的靈敏度和特異性可以滿足水生動物疫病檢測的需要。

鯉春病毒血癥病毒；焦磷酸測序；檢測

鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)又稱鯉魚彈狀病毒，是魚類強致病性病毒之一[1]。鯉春病毒血癥會引起鯉科魚類急性出血性疾病，該病為必須向世界動物衛生組織申報的疫病。鯉春病毒血癥病毒會造成魚類出現傳染性出血性壞死，死亡率高達90%，損失極其慘重[2]。鯉春病毒血癥病毒在歐洲廣為流行[3-5]。鯉春病毒血癥病毒在美洲的太平洋沿岸，從秘魯到墨西哥的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)養殖場流行，偶爾也發現在這些地區的野生虹鱒有鯉春病毒血癥病毒感染。美洲的大西洋、加勒比海和墨西哥灣的沿海地區養殖金魚(Carassiusauratus)也發現了鯉春病毒血癥病毒，但在當地野生金魚種群中尚未發現鯉春病毒血癥病毒感染[6]。2002年美國首次報道在國內分離出兩株鯉春病毒血癥病毒，2006年加拿大首次報道分離出鯉春病毒血癥病毒[7]。我國在2004年首次分離出鯉春病毒血癥病毒，標志著該病毒已經隨著國際貿易增長傳入境內[8]。

鯉春病毒血癥病毒是影響世界魚類養殖業的主要病害，如何控制好疫病的爆發，做好病害防治，成為目前我國水產養殖業和進出口行業的重中之重。參照世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》[9]及我國的出入境檢驗檢疫行業標準[10]，細胞分離與RT-PCR方法是目前普遍適用且有效的兩種檢測方法。細胞分離操作復雜，需要盲傳2代，檢測周期長，而RT-PCR方法必須與測序聯合使用才能作為疫病確診的依據。RT-PCR方法作為一種常規的核酸檢測方法，其操作需要經歷核酸提取、核酸擴增、瓊脂糖電泳、擴增產物回收以及擴增產物測序5個階段，全程耗時3～5 d，耗時長。如果PCR擴增產物含量低而不能達到測序要求時，測序將無法進行，進而不能對檢測到的疑似陽性樣品進行最終確診。

在實際檢測工作中，需要建立一種對病原體一段很短但是特別保守的片段進行測序的方法，這種方法要求快速簡潔并滿足對病原體大量檢測的需要。因焦磷酸測序檢測方法能夠短時間內精準測出短DNA片段的序列，同時可以測96份樣品[11-12]，操作簡便，能夠形成標準化的檢測流程，特別適合水生動物疫病病原體的檢測與確證。本研究以鯉春病毒血癥病毒為研究對象，設計特異的測序引物及其指紋序列，優化焦磷酸測序條件，建立特異、準確的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序檢測技術體系，為水生動物病毒病害的監測和防控提供新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株核酸

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、病毒性神經壞死病毒(VNNV)和錦鯉皰疹病毒(KHV)核酸均由華中農業大學友情提供。鯉春病毒血癥病毒毒株由本實驗室保存。

1.2 試劑與設備

引物、檢測探針均由TaKaRa(寶生物, 大連)公司合成；生物素標記通用引物由Invitrogen(英駿，上海)公司合成；dNTP、ExTaq DNA聚合酶混液、onestep RT-PCR試劑盒、DL2000分子標記均購自TaKaRa(寶生物, 大連)公司；Qiagen DNA提取試劑盒(52906)、Qiagen RNA提取試劑盒(74104)購自于Qiagen公司；Pyro SQA Reagents DNA序列分析試劑盒(96次)、鏈霉親和素包被磁珠購自北京基因有限公司。Qiagen PYROMARKID焦磷酸測序儀；PCR擴增儀(Eppendorf)；電泳儀(北京六一，DYY-8C)；凝膠成像儀(天能，G-BOX-EF)；紫外燈觀察箱(上海路陽，Icm-26)。

1.3 測序指紋序列的確定及測序引物設計

選取鯉春病毒血癥病毒較為保守的G基因作為研究對象。通過美國國立生物信息技術中心(NCBI)查詢檢索已公開的鯉春病毒血癥病毒G基因。去除一些信息不全、不完整的序列片段，對來自同一地點，同一年份，序列差異極小的毒株，選取其中一株，最后選取的序列號如下：

鯉春病毒血癥病毒G基因序列登陸號分別為：AJ318079.1、DQ491000.1、U18101.2、JQ666284.1、AY842484.1、AY842485.1、AY842486.1、DQ227500.1、DQ227501.1、DQ227502.1、DQ227503.1、DQ227504.1、AY842488.1、AY842489.1、EU370915.1、AY527273.1。

用DNAStar 7.1軟件中附帶的Editseq和MegAlign功能，將上面找到的序列輸入至軟件中，每個堿基進行比對。找到鯉春病毒血癥病毒最為保守的20 bp以內的一段序列，作為焦磷酸測序的指紋序列。在指紋序列上、下游設計測序引物。

1.4 測序引物RT-PCR反應

按照Qiagen RNA提取試劑盒說明書提取組織樣品或病毒液的RNA。

取2 μL鯉春病毒血癥病毒核酸，按照RT-PCR試劑盒說明配置反應體系，加入上游測序引物0.5 μL，標記生物素下游測序引物0.5 μL，DEPC水補足體積至50 μL。PCR儀設定如下程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，摸索測序引物的退火溫度，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

取10 μL RT-PCR產物和1 μL加6×Loading buffer混合，在1%瓊脂糖凝膠上以5 V/cm電壓電泳，以標準分子量作參考，觀察是否擴增成功。

1.5 焦磷酸測序反應

取50 μL PCR擴增產物，加入200 μg包被了鏈酶親和素的磁珠，室溫孵育20 min，讓磁珠與PCR產物連接。用測序儀自帶的真空泵工具將連接磁珠的PCR產物吸起，然后用70%酒精清洗5 s；放入denatureation buffer清洗5 s；用washing buffer清洗10 s；用真空泵工具將PCR磁珠產物放入反應板中，加入測序引物2 μL，輕輕振搖，釋放磁珠。將待測物放入80 ℃烘箱2 min，放置室溫冷卻。

將待測物放入焦磷酸測序儀中反應，反應溫度設置為28 ℃。每次進樣的壓力選擇60 kPa，進樣時間設置為8 ms，每輪測序時間設置為65 s。測序引物沿著待測模板，隨著不同dNTP的加入而擴增。每當有單個dNTP結合，反應會釋放信號，測序儀收集信號，生成測序峰。

1.6 特異性測定

將鯉春病毒血癥病毒的測序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、牙鲆彈狀病毒、病毒性神經壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒和錦鯉皰疹病毒的RNA模板進行RT-PCR擴增，將RT-PCR產物進行焦磷酸測序分析。

1.7 靈敏度檢測

將鯉春病毒血癥病毒核酸進行10倍倍比稀釋后，采用建立的焦磷酸測序方法進行檢測，并檢測其靈敏度。

1.8 實際樣本的檢測

2013—2015年，采集我國國內養殖的魚類樣品共計50批次，進口魚樣共計30批次，每批次采集魚樣本至少30尾，魚品種為鯉魚(Cyprinuscarpio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、虹鱒，采樣樣品為魚苗、幼魚或成魚。取魚樣本的腎、脾、肝、眼、腦等器官。對于魚苗，取整尾魚作為樣品，將組織勻漿，提取RNA，進行病毒性出血性敗血癥病毒焦磷酸測序檢測。

取樣本核酸，進行鯉春病毒血癥病毒的常規RT-PCR檢測，檢測引物參考世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》[9]，將這兩種檢測結果進行比較。

2 結 果

2.1 測序指紋序列的確定及測序引物設計

鯉春病毒血癥病毒G基因序列比對后，發現包含712～722位點的核酸序列“TGGGGGCGAATGCAGA”高度保守，將其作為標準指紋序列(圖1，圖2)。

根據鯉春病毒血癥病毒的指紋序列，設計測序引物(表1)。

表 1 測序引物設計

圖1 鯉春病毒血癥病毒的指紋序列

圖2 鯉春病毒血癥病毒G基因引物設計結果

2.2 測序引物的RT-PCR擴增

通過對PCR的變性、退火、延伸溫度和時間的優化，最后確定測序引物RT-PCR的循環條件為：94 ℃預變性5 min后，進入94 ℃變性30 s，退火58 ℃，30 s，72 ℃延伸30 s的循環，共循環30次。然后72 ℃再延伸10 min，4 ℃結束。

用所建立的鯉春病毒血癥病毒測序引物RT-PCR方法，擴增鯉春病毒血癥病毒病毒核酸，檢測結果均擴增出與試驗設計相符的目的條帶(138 bp)，電泳結果見圖3。

圖3 電泳結果M:DNA標準DL2000; 1,2:鯉春病毒血癥病毒; 3:陰性對照.

2.3 焦磷酸測序結果

鯉春病毒血癥病毒的RT-PCR產物，經焦磷酸測序反應，所測序列為“TGGGGGCGAATGCAGA”(圖4)，與設計的指紋序列一致。

圖4 鯉春病毒血癥病毒測序結果

2.4 特異性測定

將鯉春病毒血癥病毒的特異性測序引物分別與病毒性出血性敗血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、牙鲆彈狀病毒、病毒性神經壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒和錦鯉皰疹病毒的RA模板進行RT-PCR擴增及焦磷酸測序，只有與特異性引物相吻合的鯉春病毒血癥病毒RNA模板得到預期擴增片段大小(138 bp，圖5)及相應峰型，其余病毒均未得到特異性條帶及和已知序列吻合的峰型，由此鑒定了引物設計的特異性。

圖5 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序特異性擴增結果M:DNA標準DL2000；1:鯉春病毒血癥病毒； 2:傳染性造血器官壞死病毒； 3:病毒性出血性敗血癥病毒； 4:流行性造血器官壞死病毒； 5:牙鲆彈狀病毒； 6:傳染性胰臟壞死病毒；7:病毒性神經壞死病毒；8:錦鯉皰疹病毒； 9:陰性對照.

2.5 靈敏度測試

將鯉春病毒血癥病毒核酸進行10倍倍比稀釋后采用該焦磷酸測序方法檢測，結果發現，隨著核酸質量濃度的降低，測序結果隨之減少。該方法對鯉春病毒血癥病毒核酸的最低檢出量達10 pg/μL(圖6)。

圖6 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序靈敏度結果M:DNA標準DL2000； 1:鯉春病毒血癥病毒核酸 10 ng/μL； 2:鯉春病毒血癥病毒核酸 1 ng/μL； 3:鯉春病毒血癥病毒核酸 100 pg/μL； 4:鯉春病毒血癥病毒核酸 10 pg/μL； 5:鯉春病毒血癥病毒核酸 1 pg/μL； 6:鯉春病毒血癥病毒核酸 100 fg/μL.

2.6 實際樣品的檢測

鯉春病毒血癥病毒陽性檢出樣品數量：焦磷酸測序檢測方法與常規RT-PCR方法檢測結果相同，共計9批陽性，常規RT-PCR方法9批陽性，其中弱陽性2批。除2批RT-PCR弱陽性樣品外，其余RT-PCR檢出陽性樣品均經測序確證為鯉春病毒血癥病毒陽性。陽性檢出樣品涉及兩種被采樣魚品種。檢測結果見表2。

表2 鯉春病毒血癥病毒焦磷酸測序檢測方法與常規RT-PCR檢測結果

(續表2)

編號采樣地點樣品名稱檢測結果焦磷酸測序RT-PCR38廣州草魚--39廣州草魚--40廣州草魚--41廈門黃顙魚--42廈門黃顙魚--43廈門黃顙魚--44廈門黃顙魚--45廈門黃顙魚--46廈門黃顙魚--47廈門黃顙魚--48廈門黃顙魚--49廈門黃顙魚--50廈門黃顙魚--51南昌鯉魚++(弱陽)52南昌鯉魚--53南昌鯉魚--54南昌鯉魚--55南昌鯉魚--56南昌鯉魚--57南昌鯉魚++58南昌鯉魚--59南昌鯉魚++60南昌鯉魚--61重慶鯉魚++62重慶鯉魚--63重慶鯉魚--64重慶鯉魚--65重慶鯉魚--66重慶鯉魚--67重慶鯉魚++68重慶鯉魚--69重慶鯉魚--70重慶鯉魚--71加拿大虹鱒--72加拿大虹鱒--73加拿大虹鱒--74加拿大虹鱒--75加拿大虹鱒--76加拿大虹鱒--77加拿大虹鱒--78加拿大虹鱒--79加拿大虹鱒--80加拿大虹鱒--

3 討 論

本試驗建立了鯉春病毒血癥病毒的焦磷酸檢測方法，并對其進行了反應條件的優化。該方法為國內外首次建立鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測技術。

3.1 焦磷酸測序檢測方法與傳統檢測方法的比較

世界動物衛生組織對于鯉春病毒血癥病毒推薦的檢測方法為病毒分離與RT-PCR方法。病毒分離需要建立合適的水生動物細胞系，即使已有構建好的細胞系，還需對細胞進行傳代、凍存等操作。在進行病毒分離時，需要將樣品溶液進行倍比稀釋，每個稀釋度接種細胞，觀察7 d為一代。如果這一代細胞沒有出現細胞病變則需要盲傳第二代，還需觀察7 d。病毒分離方法總計需要約14 d的時間，操作繁瑣，周期較長，不適合口岸對大量進出境水生動物快速檢疫的需求。

對于RT-PCR方法來說，由于靈敏度有限及其引物在擴增時可能產生錯配導致非特異性結合，檢測結果會存在假陽性、假陰性和非特異性擴增，為保證結果的準確性，世界動物衛生組織和我國出入境檢驗檢疫行業標準明確規定需要對PCR產物進行測序。測序需要送到專門的生物公司，檢測周期較長。本研究建立的焦磷酸方法耗時短，一般3～4 h就可以出結果，并且以具體序列為檢測結果，這杜絕了假陽性的出現。本研究利用建立的鯉春病毒血癥病毒焦磷酸檢測方法對我國國內養殖魚與進口魚80份樣本進行檢測，涉及鯉魚、草魚、黃顙魚、大菱鲆、虹鱒等多個品種，進行了鯉春病毒血癥病毒的檢測，草魚曾經在我國出口魚類養殖業中占據重要地位，而鯉魚是近些年常有疫病檢出的主要宿主魚。將檢測結果與世界動物衛生組織推薦的常規RT-PCR方法相對比，結果可以看出，焦磷酸方法對于常規RT-PCR方法的弱陽性樣品樣本有明顯的檢出，且檢測結果與PCR方法完全一致，因而可以有效的證明，焦磷酸方法的高靈敏度是有效的，避免了假陽性檢出。而常規PCR檢測方法檢出的弱陽性樣品，由于不能滿足測序對樣本含量的要求，因而不能進行有效測序，參照世界動物衛生組織水生動物疫病診斷手冊和我國檢驗檢疫行業標準，由于不能進行有效測序，因而不能作為疫病陽性檢出確診的依據。

3.2 焦磷酸檢測方法的核心設計

焦磷酸測序方法的核心是設計特異性的測序引物與指紋序列。據文獻所述[13]，焦磷酸測序時，測序引物5′末端特異性無嚴格要求，而3′段需要與目的核酸序列完全互補。本研究所設計的測序引物的5′末端與3′末端DNA熔解溫度值一致，因而引物兩端可以同時與模板結合，具有一致性，有利于提高檢測的準確率。指紋序列的設計需要通過比對病毒各個基因的序列，選擇最為保守的一段序列。因為焦磷酸測序技術不能測過長的片段，指紋序列應該選擇20 bp以內的長度。

本研究建立的焦磷酸測序技術結合PCR的靈敏度和DNA測序技術的精確度兩方面的優勢，測序引物與指紋序列高度保守的情況下，對一段短序列進行測序，檢測結果直觀可見、操作簡便、檢測周期短。

[1] Bjoklund H V, Emmenegger E J, Kurath G. Comparison of the polymerases (L genes) of spring viremia of carp virus and infectious hematopoietic necrosis virus [J].Vet Res, 1995, 26(5):394-398.

[2] Bj?klund H V, Higman K H, Kurath G. The glycoprotein genes and gene junctions of the fish rhabdoviruses spring viremia of carp virus and hirame rhabdovirus:analysis of relationships with other rhabdoviruses [J].Virus Res, 1996, 42(6):65-80.

[3] Bj?rklund H V, Olesen N J, Jorgensen P E V. Biophysical and serological characterization of rhabdovirus 903/87 isolated from European lake troutSalmotruttalacustris [J].Dis Aquat Organ, 1994, 19(1):21-26.

[4] Encinas P, Garcia V P, Chinchilla B,et al. Identification of multipath genes differentially expressed in pathway-targeted microarrays in zebrafish infected and surviving spring viremia carp virus (SVCV) suggest preventive drug candidates [J].PloS One, 2013, 66(3):89-97.

[5] Hoffmann B, Schütze H, Mettenleiter T C. Determination of the complete genomic sequence and analysis of the gene products of the virus of spring viremia of carp, a fish rhabdovirus [J].Virus Res, 2002, 84(8):89-100.

[6] Kiuchi A, Roy P. Comparison of the primary sequence of spring viremia of carp virus M protein with that of vesicular stomatitis virus [J].Virology,1984, 134(2):238-243.

[7] Kurath G, Higman K H, Bjorklund H V. Distribution and variation of NV genes in fish rhabdoviruses [J].J Gen Virol, 1997, 78(5):113-117.

[8] 張利峰，張鶴曉，喬衛虹，等. 熒光RT-PCR檢測魚類鯉春病毒血癥病毒的研究 [J].檢驗檢疫科學，2005，32(6):24-27.

[9] Office International Des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals [EB/OL].2015[2016-6-18] http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/.

[10] 張利峰,高隆英,史秀杰, 等. SN/T 1152-2011,鯉春病毒血癥檢疫技術規范[S]. 北京:中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 2011.

[11] Gruber J D, Colligan P B, Wolford J K. Estimation of single nucleotide polymorphism allele frequency in DNA pools by using Pyrosequencing [J].Hum Genet, 2002, 110(5):395-401.

[12] Nordstrom T, Ronaghi M, Forsberg L. Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by Pyrosequencing [J]. Biotechnol Appl Biochem, 2000, 31(2):107-112.

[13] Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing [J]. Genome Res，2001,11(1):3-11.

DevelopmentofPyrosequencingMethodforDetectingSpringViremiaofCarpVirus

LIU Yao1，YIN Weili2，ZHANG Sihua3，YUE Zhiqin4，SUN Tao4

( 1. Rongcheng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Rongcheng 264300，China；2. Inspection and Quarantine Center of Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China；3.Wuhan Center For Animal Disease Control and Prevention，Wuhan 430003，China；4. Technical Center of Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002，China )

By collecting the sequences of spring viremia of carp virus (SVCV), the fingerprint sequences and the sequencing primers of the virus were designed and the pyrosequencing method for detection of SVCV was established successfully. The specificity and sensitivity of the method is well, which can specifically identify the objective virus in the eight fish viruses. The method has highly sensitivity and the minimum nucleic acid detection limit of 10 pg/μL. The method was verified by the detection of SVCV in 80 batches of the samples collected from domestic and imported fishes. The results indicate that the pyrosequencing method can effectively detect the false negative and weakly positive samples, while the traditional method RT-PCR cannot detect them in these situations. The specificity and sensitivity of the method meet the requirement for detection of aquatic animal diseases.

spring viremia of carp virus(SVCV); pyrosequencing; detection

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.008

S948

A

1003-1111(2017)04-0449-07

2016-07-01；

2016-09-23.

國家質檢總局科研項目(2015IK195).

劉瑤(1980—)女，工程師；研究方向：海水養殖. E-mail: 13561863668@163.com.通訊作者：尹偉力(1982—)男，高級獸醫師；研究方向：獸醫學. E-mail: vi123vi@163.com.