人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和消化相關(guān)指標(biāo)的影響

張 月, 段亞飛, 董宏標(biāo), 張真真, 張家松

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306 )

人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和消化相關(guān)指標(biāo)的影響

張 月1, 2, 段亞飛1, 董宏標(biāo)1, 張真真1, 張家松1

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306 )

將體長(zhǎng)1 cm的凡納濱對(duì)蝦飼養(yǎng)于池底鋪有黑膜的400 m2圓形高位池中，池中沿水流方向與池底垂直懸掛由40目雙層篩絹網(wǎng)制成的人工基質(zhì)(間距約1 m)，其中基質(zhì)與池底面積之比約為1∶2，常規(guī)飼養(yǎng)，分別于養(yǎng)殖第29、57 d和80 d測(cè)定對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力、溶菌酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性以及一氧化氮含量的變化，研究人工基質(zhì)對(duì)肝胰腺免疫和消化相關(guān)指標(biāo)的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，養(yǎng)殖第29 d，基質(zhì)添加組對(duì)蝦的免疫酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，消化酶活性變化不顯著(P>0.05)；養(yǎng)殖第57 d(臺(tái)風(fēng)期間)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦各免疫指標(biāo)和淀粉酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；養(yǎng)殖第80 d (臺(tái)風(fēng)過(guò)后26 d)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦總抗氧化能力、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性顯著升高(P<0.05)。研究表明，人工基質(zhì)可以顯著影響對(duì)蝦免疫和消化機(jī)能，而基質(zhì)生物膜系統(tǒng)遭臺(tái)風(fēng)等強(qiáng)天氣干擾破壞后仍具有一定的自我修復(fù)能力。

凡納濱對(duì)蝦; 人工基質(zhì); 免疫; 消化

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，又名南美白對(duì)蝦，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、易運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)重要的養(yǎng)殖對(duì)蝦[1]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，水體污染、疾病頻頻爆發(fā)等問(wèn)題日益凸顯，嚴(yán)重制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。因此，改善養(yǎng)殖環(huán)境、尋找健康的養(yǎng)殖模式已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)之一。

近年來(lái)，微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，其在調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水質(zhì)、改善動(dòng)物體機(jī)能中的作用已成為對(duì)蝦健康養(yǎng)殖的研究熱點(diǎn)。人工基質(zhì)，也稱(chēng)人工水草，屬于生物—生態(tài)修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，在養(yǎng)殖水體中形成一層生物膜狀結(jié)構(gòu)，用以吸附各種細(xì)菌、藻類(lèi)及水體中的懸浮顆粒物等[4-5]。研究表明，人工基質(zhì)作為微生物附著基，顯著影響?zhàn)B殖水體菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)，為養(yǎng)殖對(duì)蝦提供額外的棲息場(chǎng)所和食物源[6-7]。此外，筆者之前研究亦發(fā)現(xiàn)，人工基質(zhì)可降低對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中無(wú)機(jī)氮含量，增強(qiáng)水體菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高對(duì)蝦成活率和產(chǎn)量[8-9]。目前，人工基質(zhì)—生物膜技術(shù)已成為一種高效的養(yǎng)殖水體原位清潔修復(fù)技術(shù)，在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用逐漸增多。

然而，目前關(guān)于人工基質(zhì)在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究主要集中在水質(zhì)調(diào)控、菌群調(diào)節(jié)和對(duì)蝦生長(zhǎng)性能改善等方面，而其對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和消化功能影響的研究相對(duì)較少。為此，本研究將篩絹網(wǎng)作為人工基質(zhì)添加到凡納濱對(duì)蝦高位池精養(yǎng)系統(tǒng)中，通過(guò)測(cè)定對(duì)蝦免疫和消化酶的活性，以探討添加人工基質(zhì)對(duì)對(duì)蝦免疫和消化機(jī)能的影響，為人工基質(zhì)在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

養(yǎng)殖試驗(yàn)在湛江恒興南方海洋科技公司863基地進(jìn)行，隨機(jī)選擇養(yǎng)殖條件相近、池底鋪有黑膜的6口400 m2圓形高位池塘。試驗(yàn)池的人工基質(zhì)為40目雙層篩絹網(wǎng)，沿水流方向與池底垂直懸掛(圖1)，間距約1 m，基質(zhì)與池底面積比例約為1∶2。基質(zhì)全部浸沒(méi)于水中，四周留有空隙以便對(duì)蝦和水流通過(guò)[5]。未放人工基質(zhì)的池塘為對(duì)照組，每組3個(gè)平行。

圖1 池塘人工基質(zhì)設(shè)置俯視圖[7]

1.2 日常管理

試驗(yàn)養(yǎng)殖高位池經(jīng)消毒后進(jìn)水1.5 m，同時(shí)投放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)浮游生物7 d。試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦平均體長(zhǎng)1 cm，放苗密度180 尾/m2。養(yǎng)殖水體鹽度24～25，pH 8.3～8.7，平均水溫31.75 ℃，溶解氧含量始終≥6 mg/L。養(yǎng)殖期間不換水，僅補(bǔ)充蒸發(fā)水。飼料粗蛋白含量≥42%，日投喂3次，日投喂量為蝦體質(zhì)量的3%～7%，依攝食情況進(jìn)行調(diào)整。本研究中，養(yǎng)殖第54 d時(shí)遭遇14級(jí)風(fēng)力的超級(jí)臺(tái)風(fēng)“溫比亞”，池塘養(yǎng)殖環(huán)境受到嚴(yán)重影響，期間中斷電力供應(yīng)6 h。

1.3 樣品制備

分別于養(yǎng)殖第29、57 d和80 d從每個(gè)平行組隨機(jī)取5尾蝦的肝胰腺，使用預(yù)冷的0.86%生理鹽水進(jìn)行漂洗，去除組織液，濾紙拭干，稱(chēng)量質(zhì)量后置于離心管中。按照1∶10 (m/V)加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水進(jìn)行超聲粉碎。將制備好的10%組織勻漿液于4 ℃，2000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜跍y(cè)定免疫和消化指標(biāo)。

1.4 免疫和消化指標(biāo)的測(cè)定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定免疫和消化指標(biāo)，包括總抗氧化能力、溶菌酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性以及一氧化氮與組織蛋白含量，相關(guān)操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，未做任何調(diào)整。各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定所用試劑盒均為同批次試劑。

37 ℃時(shí)，每分鐘每毫克組織蛋白，使反應(yīng)體系的吸光度值增加0.01時(shí)，定義為1個(gè)總抗氧化能力單位(U)；溶菌酶活性測(cè)定采用比濁法；一氧化氮含量測(cè)定采用硝酸還原法，利用硝酸鹽顯色劑生成紅色偶氮化合物來(lái)間接測(cè)定；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性主要利用其催化L-精氨酸與O2反應(yīng)生成一氧化氮，一氧化氮與親核性物質(zhì)作用生成有色化合物，通過(guò)測(cè)定530 nm吸光度進(jìn)行定量；37 ℃條件下，組織中每毫克蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位(U)；37 ℃下每毫克組織蛋白每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸定義為1個(gè)胃蛋白酶活力單位(U)；組織蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力在養(yǎng)殖第29 d時(shí)顯著升高(P<0.05)，隨后于第57 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；養(yǎng)殖第80 d，基質(zhì)添加組總抗氧化能力顯著升高，為對(duì)照組的4.11倍(P<0.05) (圖2a)。基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺中溶菌酶活性于養(yǎng)殖第29 d達(dá)到最高值，為對(duì)照組的1.67倍(P<0.05)，但第57 d和80 d均顯著低于對(duì)照組(P<0.05) (圖2b)。

圖2 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力(a)和溶菌酶(b)活性的影響*表示組間差異顯著(P<0.05).下同.

養(yǎng)殖第29 d時(shí)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量均顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的2.02和2.59倍(P<0.05)；第57 d時(shí)顯著降低，分別為對(duì)照組的0.20和0.54倍(P<0.05)；第80 d時(shí)，基質(zhì)添加組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性顯著高于對(duì)照組，而一氧化氮含量差異不顯著 (P>0.05) (圖3)。

圖3 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(a)活性和一氧化氮(b)含量的影響

2.2 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化指標(biāo)的影響

養(yǎng)殖第29 d時(shí)，基質(zhì)添加組和對(duì)照組對(duì)蝦肝胰腺淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)；第57 d時(shí)，基質(zhì)添加組淀粉酶活性顯著降低，于第80 d活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05) (圖4a)。第29 d和57 d時(shí)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺胃蛋白酶活性均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，而第80 d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05) (圖4b)。

圖4 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中淀粉酶(a)和胃蛋白酶(b)活性的影響

3 討 論

在對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中應(yīng)用人工基質(zhì)—生物膜技術(shù)，除了可以為對(duì)蝦提供棲息場(chǎng)所，還可以吸收轉(zhuǎn)化污物、維護(hù)良好水質(zhì)、補(bǔ)充餌料和控制水體弧菌(Vibrio)豐度等[5,7,10]。人工基質(zhì)表面生物膜的組成十分復(fù)雜，包括飼料殘餌、糞便等有機(jī)碎屑，各種藻類(lèi)，浮游動(dòng)、植物等，甚至?xí)性鷦?dòng)物。這些豐富的生物群體是一種優(yōu)質(zhì)的高蛋白質(zhì)生物餌料，可以為對(duì)蝦提供額外的蛋白營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[4]。有研究表明，添加人工基質(zhì)可以為對(duì)蝦提供額外的餌料補(bǔ)充，提高對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和產(chǎn)量[11-12]。

3.1 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

對(duì)蝦缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠各類(lèi)非特異性免疫因子來(lái)識(shí)別異己，抵御環(huán)境脅迫或病原感染。總抗氧化能力是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)[13-15]。溶菌酶是一種重要的抗菌蛋白，其活性可以作為衡量對(duì)蝦非特異性免疫功能的指標(biāo)[16-17]。一氧化氮是一種生物體內(nèi)的自由基，主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶催化L-精氨酸與O2反應(yīng)產(chǎn)生，通過(guò)與氧自由基結(jié)合生成強(qiáng)氧化劑或者抑制微生物代謝酶的活性來(lái)殺滅微生物[15,17]。李桂英[18]研究表明，飼料中添加益生菌及其滅活菌體能顯著提高養(yǎng)殖對(duì)蝦誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加甘蔗渣，第34 d時(shí)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組[19]。本研究中，養(yǎng)殖第29 d時(shí)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力、溶菌酶活性、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量均顯著升高，表明添加人工基質(zhì)有助于增強(qiáng)養(yǎng)殖對(duì)蝦肝胰腺的免疫防御機(jī)能。

3.2 人工基質(zhì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化指標(biāo)的影響

肝胰腺分泌的消化酶活性可以作為對(duì)蝦消化機(jī)能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中，在養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加人工基質(zhì)篩絹網(wǎng)后，第80 d凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中淀粉酶和胃蛋白酶活性顯著升高，表明人工基質(zhì)顯著影響凡納濱對(duì)蝦的消化功能。不同免疫或消化指標(biāo)的變化不同，可能與所用人工基質(zhì)材料、對(duì)蝦生長(zhǎng)期和投喂飼料等差異有關(guān)。

3.3 強(qiáng)天氣干擾對(duì)人工基質(zhì)的影響及其自我修復(fù)

胡曉娟等[20-21]研究表明，熱帶風(fēng)暴和臺(tái)風(fēng)等強(qiáng)降雨天氣干擾會(huì)降低池塘養(yǎng)殖水體pH和鹽度，大量滋生病原微生物，導(dǎo)致對(duì)蝦產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，免疫能力降低，發(fā)病及死亡機(jī)率增加。本研究中，對(duì)蝦養(yǎng)殖第54 d時(shí)遭遇超級(jí)臺(tái)風(fēng)“溫比亞”，嚴(yán)重影響了池塘養(yǎng)殖環(huán)境。課題組前期研究表明，臺(tái)風(fēng)“溫比亞”導(dǎo)致的池塘環(huán)境驟變，嚴(yán)重破壞了人工基質(zhì)生物膜系統(tǒng)，使其分解能力下降，基質(zhì)添加組養(yǎng)殖水體氨氮、亞硝態(tài)氮和弧菌含量顯著升高，導(dǎo)致池塘水體生態(tài)系統(tǒng)崩潰，引起對(duì)蝦大量死亡[10]。姜令緒等[22]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體氨氮含量的劇烈波動(dòng)會(huì)降低對(duì)蝦機(jī)體免疫力。本研究中，養(yǎng)殖第57 d基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺總抗氧化能力、溶菌酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮含量、淀粉酶活性均顯著低于對(duì)照組，同樣佐證了臺(tái)風(fēng)“溫比亞”破壞人工基質(zhì)生物膜系統(tǒng)，造成對(duì)蝦免疫和消化功能紊亂。董宏標(biāo)等[9]研究表明，人工基質(zhì)生物膜中生物群落的成熟是較為緩慢的自然馴化過(guò)程，一般需要約30 d才能夠完成。本研究中，養(yǎng)殖第80 d時(shí)，基質(zhì)添加組對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、淀粉酶和胃蛋白酶活性再次顯著升高，表明臺(tái)風(fēng)“溫比亞”襲擊后26 d，基質(zhì)生物膜系統(tǒng)已基本完成重建過(guò)程，水體氨氮含量逐漸下降，對(duì)蝦免疫和消化機(jī)能基本可以恢復(fù)正常。

綜上所述，添加人工基質(zhì)顯著影響了凡納濱對(duì)蝦肝胰腺免疫和消化指標(biāo)，而臺(tái)風(fēng)前后基質(zhì)添加組對(duì)蝦免疫和消化指標(biāo)嚴(yán)重分化，表明人工基質(zhì)可能更適用于天氣波動(dòng)較小的季節(jié)或室內(nèi)對(duì)蝦養(yǎng)殖。此外，人工基質(zhì)生物膜系統(tǒng)遭受臺(tái)風(fēng)等強(qiáng)天氣干擾破壞后，具有一定的自我修復(fù)能力。本研究可以為人工基質(zhì)在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究提供參考。

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[22] 姜令緒, 潘魯青, 肖國(guó)強(qiáng). 氨氮對(duì)凡納對(duì)蝦免疫指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(6):537-541.

EffectofArtificialSubstrateAdditiononImmuneandDigestiveRelatedIndicatorsinPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

ZHANG Yue1,2, DUAN Yafei1, DONG Hongbiao1, ZHANG Zhenzhen1, ZHANG Jiasong1

( 1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China )

The total antioxidant capacity (T-AOC), activities of lysozyme (LSZ), nitrio oxide synthase (iNOS), amylase, and pepsin, and the content of nitrio oxide (NO) were monitored in hepatopancreas of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwith body length of 1 cm reared in a 400 m2circular pond in which a double-layer artificial substrate made of 40 mesh size sieve screen was suspended spacing of about 1 m along the direction of the water flow in 29 d, 57 d and 80 d during the culture to investigate the effect of artificial substrate on the immune and digestive related indicators of the shrimp. The results showed that comparing with the control group, the shrimp in artificial substrate-treated group had significantly higher immune enzyme activities on the 29th day (P<0.05), while the digestive enzyme activities have no significant difference (P>0.05). On the 57th day of rearing during the typhoon period, all the immune indices and amylase activity in artificial substrate-treated group were decreased significantly (P<0.05), but T-AOC, iNOS and amylase activities were increased on the 80th day (26 days after typhoon period) (P<0.05). The findings indicated that artificial substrate significantly improved the immune and digestive abilities of the shrimp, and that the substrate-biofilm has a certain ability to repair itself after the damage of severe weather such as typhoon.

Litopenaeusvannamei; artificial substrate; immune; digestion

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.010

S968.22

A

1003-1111(2017)04-0462-05

2016-05-17；

2016-08-24.

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所)資助項(xiàng)目(2016TS07);廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(A201501B15, A201508B05)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015A030310393).

張?jiān)?1992—)，女，碩士研究生；研究方向：對(duì)蝦健康養(yǎng)殖技術(shù). E-mail: zhangyue9236@163.com. 通訊作者：張家松(1971—)，男，副研究員；研究方向：對(duì)蝦健康養(yǎng)殖技術(shù). E-mail: jiasongzhang@hotmail.com.