銅藻主要活性物質的提取及其功能

彭雍博，汪秋寬,任丹丹,宋悅凡

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發分中心，遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

銅藻主要活性物質的提取及其功能

彭雍博，汪秋寬,任丹丹,宋悅凡

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發分中心，遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

銅藻；提取工藝；生物活性

銅藻(Sargassumhorneri)又名丁香屋、草茜、竹茜菜，隸屬于褐藻門、馬尾藻屬，是北太平洋西部特有的暖溫帶海藻，主要分布于我國遼寧、浙江、福建以及廣東等地[1]。銅藻黃褐色、樹狀、枝葉繁茂，是淺海區海藻場的主要連片大型褐藻，常被稱為“海中森林”[2-3]。作為單年生藻類，銅藻成熟時間隨季節而提前或推遲，我國東部沿海銅藻的成熟期多集中于3—5月[4-5]。現階段銅藻研究的熱點是資源調查及其形態學、生活史、人工增殖和繁殖等，而生物活性物質的提取和活性研究及應用卻鮮有報道[6-8]。

在近岸,銅藻形成的海洋生態海藻場支撐著數量眾多、種類多樣的生物資源，是許多魚類和小型無脊椎動物良好的索餌場、棲息地和庇護所，被海洋生態學家列為人工魚礁、淺海潮間帶修復的首選[9-11]。但近年我國海域環境嚴重惡化，銅藻的生物量也不斷下降，甚至出現海藻場成片消失[12]。這主要是因為排放的工業及生活廢水中含有大量的硫化物和氮化物降低了海水pH值[13-14]。低pH條件下銅藻孢子、幼體的存活率降低，畸形發育、生長或不能正常存活[15]。同時海水污染使近海水體CO2含量、透光率與溫度改變，顯著影響銅藻生長。低CO2含量和低光照條件下，銅藻的生長比高CO2含量和強光照下葉片數量少、株高較低且生長發育遲緩；低溫條件抑制了銅藻的正常發育及個體生長[16-17]。分子生物學鑒定則發現，不同地域的銅藻種群的基因雖然有一定的交流，但種群的遺傳多樣性呈現出衰退趨勢，因此種群基因交流不暢也已成為威脅我國銅藻生長的關鍵因素[18-19]。

銅藻含有混合多糖(褐藻膠、褐藻糖膠及褐藻淀粉)、蛋白質、脂質、維生素、氨基酸、纖維素、半纖維素、礦物質、甾醇類和萜類化合物等[20-21]，是海藻工業的優質原料，在醫藥、食品、飼料和有機肥料中具有較高的應用價值[22-24]。根據《中華本草》和《廣東中藥志》記載，銅藻常作為中藥治療水腫、咳嗽、甲狀腺腫大等疾病[25-26]，但開發利用尚處于初級階段，利用率極低，造成了銅藻資源的浪費[27]。基于上述考慮，筆者整理和總結了近年國內外關于銅藻多糖、巖藻黃質和纖維素等生物活性物質提取工藝的資料，闡述了銅藻源物質生物活性的研究現狀與應用，并展望了銅藻產業的發展，以期為銅藻生物活性物質的提取及研究提供參考。

1 銅藻多糖提取工藝及其功能研究

銅藻中含有多種多糖，其中褐藻膠和褐藻糖膠是銅藻細胞壁的填充物質；海帶淀粉則存在于細胞質中。三者在結構上也不相同：褐藻膠是由糖醛酸結合成的線型聚合物，褐藻糖膠是由褐藻糖結合成的含硫酸基多糖，而海帶淀粉則是以葡萄糖組成的葡聚糖。褐藻糖膠中的硫酸基多糖具有抗病毒、抗炎癥、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤和免疫調節等多重功效，一直是學術界研究的熱點。

1.1 銅藻多糖提取工藝

海藻多糖的提取一般采用水提法、堿提法和酸提法。這些方法工藝簡單、操作方便、成本低廉，但提取率低、純度不高、活性損失大、提取時間長，限制了海藻多糖的工業化生產[28]。因而，常采用一些輔助提取技術，如超聲波或微波輔助法、酶解法等，有效提高海藻多糖的提取效率。

熱水浸提法是海藻多糖較常用的提取方法。該法以水為提取劑，主要考慮料液比、浸提溫度、提取時間、提取次數等因素對多糖提取率的影響[29]。顧麗霞等[30]通過單因素與正交試驗優化了銅藻多糖的水提法提取工藝。結果表明，此法顯著影響銅藻多糖提取率的因素為提取溫度和提取時間，其次為料液比。其最優的提取工藝參數為:料液比1∶20(g/mL)、60 ℃下提取3 h，提取率4.59%。

目前常以熱水浸提法為基礎，利用超聲波的空化效應增大介質分子的運動速度，使可溶性活性成分迅速溶出。該方法為常溫常壓操作，活性成分損失少、提取效率高[31-32]。楊君等[33]根據響應面分析及Design-Expert軟件優化發現，超聲時間為顯著變化因素，超聲輔提法的多糖提取率隨時間的增加而上升，而振動頻率與物料比對提取率的影響不顯著。超聲波輔助提取的最佳條件為：水料比為56.7(mL/g)，超聲功率為480 W，提取時間為25 min，占空比為1∶1。多糖提取率達到10.82%，有效提高了多糖提取率。

微波輔助提取法利用了微波擁有強大的細胞穿透能力和在常溫下抽提熱敏性有效成分極為有效的特點[34]。此法操作方便、節約時間、效率高、無污染，但對多糖活性會造成一定程度的損失[35]。邵平等[36]研究了銅藻多糖微波輔提工藝，并通過響應面法優化得出微波輔提法的主要影響因素效應關系，結果發現，各因素的影響顯著程度為水料比>提取溫度>提取時間，其最佳工藝條件為：液料比為65∶1(mL/g)時，在72 ℃條件下提取39 min，銅藻多糖的提取率高達12.02%。

酶提法工藝技術溫和，有利于保護產物活性，環保低能耗，易于實現工業化。此法利用纖維素酶和蛋白酶破壞海藻細胞壁，使細胞壁軟化、膨脹、孔隙變大，提高胞內多糖的流出率，被廣泛應用于植物多糖提取[37]。劉麗佳等[38]探索了提取溫度、pH、加酶量和時間4個因素對銅藻多糖提取率的影響，結果發現，提取溫度與時間為主要因素，其次依次為pH、加酶量和時間。銅藻多糖酶解輔助提取法的最佳工藝條件為：酶解70 min，加酶量(纖維素酶∶中性蛋白酶=2∶1，質量比)2%，pH 4.0，溫度60 ℃。相較于水提法，多糖提取率提高了22.22%。

上述提取方法銅藻多糖提取率的差異較大，其主要原因,一是銅藻多糖屬于極性大分子化合物，不同水溫和pH 對多糖結構破壞明顯，且多糖的提取率與提取次數呈正相關，提取次數越多提取率越高；二是處理作為多糖提取過程中的關鍵步驟，不同處理措施，差異顯著，超聲波和微波技術應用于多糖的提取，穿透性強，激發細胞劇烈振動，使細胞開裂、破碎，有利于多糖的釋放。

1.2 銅藻多糖生物活性研究

銅藻多糖生物學活性研究的另一熱點是提高免疫力及抗病毒活性。李偉等[42]在體外和體內試驗證明，銅藻多糖既能顯著增強NK細胞殺傷活性、促進腹腔巨噬細胞的吞噬能力和細胞毒性，也能顯著促進小鼠脾臟T、B淋巴細胞的增殖能力，調節免疫活性，但在體外試驗中不同的多糖組分具有不同的免疫活性。Kim等[43]探索了銅藻脂多糖對巨噬細胞RAW 264.7的抗炎癥調節機制， 發現銅藻脂多糖不僅可以誘導激活機體巨噬細胞的增殖分化，加強機體自身免疫力，間接發揮免疫作用；還可以直接抑制 ERK、 p-p38和NF-Κb等炎癥因子的產生和炎癥基因的表達，以達到抗炎目的。Barros等[44]的研究發現，銅藻多糖不僅對感染初期的巨細胞病毒和免疫缺陷Ⅰ型病毒有抗病毒功效，而且能抵抗處于復制階段的病毒。Preeprame的團隊[45]則從銅藻中提取巖藻聚糖硫酸酯并制備出多種衍生物，作用于皰疹Ⅰ型病毒以研究銅藻多糖的抗病毒效果。結果表明，銅藻多糖具有與Na-HOR類似的病毒抑制功效，可以用于抗皰疹病毒藥物制備；但這種抗病毒活性隨銅藻收獲季節不同而顯著不同，仍需進一步研究。

近些年來，很多研究關注了銅藻多糖的抗腫瘤活性。Ermakova等[46]在長期的抗腫瘤藥物研究中發現，從銅藻中分離的3種巖藻聚糖硫酸酯對人類黑色素瘤和結腸腫瘤細胞具有良好的抑制效果，而且這種抗腫瘤功效與多糖自身的取代基團無直接關聯。此外，銅藻多糖還可以誘導人結腸癌 DLD 細胞凋亡，結腸癌DLD細胞的被抑制效果與銅藻多糖的添加劑量呈正相關[47]。但現階段對銅藻提取物抗腫瘤活性的研究多為體外細胞試驗，體內活性尚未見報道。銅藻多糖的其他功能性研究還包括其具有預防骨質疏松的活性。Yamaguchi[48]自銅藻中提取出一種具有預防骨質疏松癥的物質。這種物質中含有大量的褐藻多糖，能刺激機體成骨細胞的形成，影響體外骨吸收的因子產生抑制作用，增加骨密度，預防骨質疏松。在銅藻提取物與裙帶菜(Undariapinnatifida)、孔石莼(Ulvapertusa)等海洋藻類的對比試驗中，發現銅藻提取物具有最好的抗骨質疏松效果，對糖尿病Ⅰ型動物模型骨丟失有預防作用，有助于改善肥胖型糖尿病患者的骨質疏松癥[49]。

2 銅藻其他生物活性物質提取工藝及其功能研究

2.1 銅藻巖藻黃質與膳食纖維提取工藝

巖藻黃質又名巖藻黃素、褐藻黃素，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類脂溶性色素，在褐藻綱、硅藻綱、金藻綱、定鞭藻綱中廣泛分布，特別是在褐藻中巖藻黃質的含量比胡蘿卜素和葉黃素的總量還要高。巖藻黃質最初作為著色劑添加到食品中，后來發現它是一種天然抗氧化劑，遠優于傳統抗氧化劑維生素C和維生素E，作為營養保健品有效成分逐漸得到認可。巖藻黃質結構中含有多個共軛雙鍵，還有羥基、羧基，既可發生分子間的酯化反應，也可能產生分子內部的綜合成環，雙鍵使得巖藻黃質分子在高溫條件下穩定性較差[50]。近些年對高純度巖藻黃素的提取工藝技術鮮有報道，制約了巖藻黃素的應用開發。因巖藻黃素是脂溶性色素，能溶于石油醚、丙酮、甲醇等有機溶劑，胡永東等[51]專門設計了銅藻巖藻黃質有機溶劑提取法，并通過正交試驗和響應面法優化了銅藻巖藻黃質提取工藝，發現其顯著影響因素為：提取溫度>液料比>時間，且提取溫度和液料比的交互作用影響最為顯著。最佳提取工藝條件為：溫度70 ℃，127 min，提取液料比68.3(mL/g)，巖藻黃質提取率為0.72 mg/g。

膳食纖維是銅藻含量最高的成分。按溶解性, 膳食纖維分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維。膳食纖維被現代醫學和營養學認定為“第七營養素”，對銅藻膳食纖維的關注也逐步提高。膳食纖維對防治多種疾病具有積極作用，其生理功能的高低，除與原料選取有關外，還與加工方法密切相關。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠、木質素等組成，它們之間的鏈接方式或者鑲嵌，或者抱合，所以用單一酶難以徹底降解植物細胞壁，使內容物不能完全釋放[52]。用復合酶能有效破壞細胞壁骨架結構，將纖維素降解成葡萄糖，促使細胞內活性成分溶出[37]。朱亞珠等[53]基于上述考慮研究了銅藻膳食纖維復合酶處理提取工藝，采用正交試驗優化銅藻中膳食纖維提取工藝。結果表明，纖維素酶量和酶解時間是影響提取率的主要因子，其次是蛋白酶用量；在此工藝條件下銅藻膳食纖維產率達35.4%，其膨脹力和持水力功能性指標分別為85.8(mL/g)和4220.0%。因此，酶解法提取銅藻膳食纖維是一種有效、活性強、有廣闊發展前景的提取工藝。

2.2 銅藻其他生物活性物質功能研究

銅藻色素類物質生物活性較強，對其活性的研究逐漸增多。胡永東[54]研究了銅藻中巖藻黃質的抗炎功效，表明此物質可以通過抑制促炎因子TNF-α、IL-6的釋放和提高抑炎因子IL-10的水平起到保護及修復炎癥損傷細胞的作用；在相同劑量下巖藻黃質的抗炎癥效果較銅藻多糖更佳。肖湘等[55]還研究了銅藻黑色素清除活性氧和抑制脂質過氧化的活性。源于銅藻中的黑色素是一種黃酮類色素，可作為自由基的受體阻斷自由基連鎖反應，對氧自由基和羥自由基均有良好的清除作用，能明顯地抑制卵黃脂蛋白PUFA 的過氧化。

褐藻多酚是另一種具有強抗氧化活性的物質，可能因其多與褐藻中其他物質結合在一起，研究其分離難度較大[56]。Luo等[57]分別采用水、石油醚、丁醇和乙酸乙酯萃取銅藻多酚粗品(氯仿/甲醇提取)，結果乙酸乙酯提取的多酚物質不僅多酚含量最高(27.66%)，而且其多酚具有最高的DPPH自由基和羥自由基清除能力，清除率分別為76.68%和69.32%。許亞如[58]則用70%的乙醇直接抽提銅藻多酚，結果銅藻中含有豐富的褐藻多酚，其含量高達6662.8 mg/kg，其DPPH和ABTS自由基清除率及FRAP值分別為51.32%、85.88%和351 mmol/kg，抗氧化能力遠高于同一水平下提取的泡葉藻褐藻多酚。這些結果都表明，銅藻多酚是一種潛在的天然抗氧化劑。

銅藻中還存在少量的甾醇類與總萜類物質，其生物活性也引起了科學家們的關注。Zhao等[59]采用經典的試驗發現，總甾醇和β-谷甾醇能顯著增加小鼠大腦內去甲腎上腺素、血清素和羥吲哚乙酸代謝物的含量；這表明銅藻甾醇可能是通過這些神經遞質發揮抗抑郁活性。銅藻總萜類物質的抗抑郁活性試驗結果顯示，與空白組相比，低、中、高劑量的三組銅藻總萜提取物均能不同程度提高小鼠小腦血清素含量(P<0.05或P<0.01)，呈現出劑量依賴性[60]。

隨著對銅藻各組分的研究不斷深入，一些新的生物活性也相繼報道，如銅藻提取物還具有抗輻射[61]、抗過敏[62]、抗菌[63]等生物學活性。

3 銅藻的其他應用研究

近些年用海藻多糖和甘露醇生物發酵制備乙醇的研究較多。海藻中提取的褐藻淀粉、甘露醇、褐藻酸以及粗纖維都能用于生物乙醇的開發[64]。目前，銅藻是褐藻糖膠、褐藻淀粉和褐藻膠等的重要來源，尤其是褐藻酸鈉在銅藻中的含量最高(約31%)[65]。銅藻富含纖維素，利用銅藻發酵生產生物乙醇具有良好前景[66]。蔣媛媛等[67]在用稀硫酸預處理銅藻的基礎上，系統研究了非等溫同步糖化發酵銅藻制備生物乙醇的技術，最終乙醇產率達到7.80%，表明銅藻是一種潛在的制備生物乙醇的原料。

作為富含多種生物活性物質的褐藻，銅藻因含有豐富的植物生長素、赤霉素、類細胞分裂和多酚化合物及抗生素類等天然生物活性成分，能夠增強植物光合作用和根系的發育，促進作物的新陳代謝，提高作物抗逆性和免疫力[68]。此外，銅藻中的多糖類物質能螯合土壤中的金屬離子形成高分子量復合物，改善土壤團粒結構。武冬雪等[69]研究發現，銅藻提取液可提高多種中草藥種子的萌發率、發芽指數及發芽勢，促進幼苗生長。檢測發現，銅藻提取液可顯著提高月見草(Oenotherabiennis)葉片和根系的鮮質量，植物葉片中類胡蘿卜素含量及葉綠素a 與葉綠素b 的比值也有一定程度的上升；還可以降低葉綠素b 含量，改善植物光合作用水平[70]。

銅藻還可用于生物吸附劑。傳統的去除水體重金屬及其他污染物的材料普遍成本高、重金屬難以回收，而生物吸附法則具有比傳統方法成本低、效率高、無二次污染和利于改善生態環境等特點[71]，在種類繁多的生物質中海藻是公認的優質生物吸附劑[72]。曾淦寧等[73-74]分別采用熱水、ZnCl2和H3PO4法制備高比表面積銅藻基活性炭，除污性能檢測結果表明，3種方法制備的銅藻基活性炭吸附性能明顯優于其他大型海藻原料制備的活性炭，有效補充傳統陸地活性炭材料。Angelova等[75]以銅藻基活性炭作為載體，借用微波技術合成氧化鐵納米微粒，二階模型和吸附的熱力學結果表明，在低于90 min吸附時間內，銅藻吸附劑對5種水溶性染料均有較高的吸附能力，特別是吖啶橙和孔雀石綠，其吸附率分別高達193.8 mg/g和110.4 mg/g。眾多研究結果表明，銅藻是一種吸附容量大、安全有效、發展潛力巨大的商用吸附劑原料[76-77]。

4 銅藻應用研究的前景

在加快發展海洋產業的二十一世紀，人們對褐藻的研究已不僅僅局限于養殖技術和生態學調查，如何利用豐富的銅藻資源，低成本、高效益的提取和分離海藻生物活性物質，探索銅藻在醫藥保健、工農業、日化等領域的潛在應用價值，必然發展成為海洋開發的熱點方向。同時也需指出，近海水體污染和生長區域封閉導致的銅藻生長速度放緩、基因交流不暢、藻床退化等現象，需要廣大科研工作者和社會的高度重視。此外，海藻提取物提取率和純度低，有效利用率遠不及歐美、日韓等發達國家，制約了我國海藻產業健康發展，引進國外先進提取工藝和探索多種提取分離技術聯用是短時間大幅提升我國銅藻產品市場競爭力最有效的措施之一。

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AReview:ExtractingTechnologyandBioactivityofMajorBioactiveSubstancesinMarineBrownAlgaSargassumhorneri

PENG Yongbo, WANG Qiukuan,REN Dandan,SONG Yuefan

( Key and Open Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province, Nation Research and Development Branch Center For Seaweed Processing, College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

Sargassumhorneri; extractive technique; biological activity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.022

S917.3

C

1003-1111(2017)04-0531-07

2016-08-24；

2016-10-14.

國家自然科學基金資助項目(31471610).

彭雍博(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：農產品加工及貯藏工程.E-mail：pengyongbo2011@126.com.通訊作者：汪秋寬(1962—)，女,教授；研究方向：水產品加工及綜合利用.E-mail：wqk320@dlou.edu.cn.