細胞松弛素B誘導菲律賓蛤仔四倍體的初步研究

李永仁，梁 健，郭永軍

( 天津農學院 水產科學系，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384 )

細胞松弛素B誘導菲律賓蛤仔四倍體的初步研究

李永仁，梁 健，郭永軍

( 天津農學院 水產科學系，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384 )

采用不同質量濃度的細胞松弛素B抑制第一極體的釋放，誘導菲律賓蛤仔四倍體，觀察誘導各組胚胎的早期發育過程，結果表明，0.5、0.7 mg/L及1.0 mg/L的細胞松弛素B均能有效抑制第一極體的釋放，獲得四倍體誘導率分別為58.2%、55.1%及55.2%，無顯著差異；隨細胞松弛素B用量的升高，菲律賓蛤仔早期胚胎發育速度略有減慢，各發育階段胚胎畸形率顯著提高，畸形形式增加，孵化率降低。綜合分析，0.5 mg/L的細胞松弛素B適于誘導菲律賓蛤仔四倍體。

菲律賓蛤仔; 四倍體; 胚胎發育

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippenarum)俗稱花蛤、蜆子，屬雙殼類、簾蛤科、蛤仔屬，為廣溫、廣鹽性種類，是我國重要經濟貝類，目前已成為世界性養殖貝類[1]。2014年蛤仔產量約占海水貝類產量的1/3，為我國單種養殖產量最高的貝類，產業地位十分重要[2]。目前，蛤仔養殖業主要采用野生苗種，導致個體小型化、抗逆性差、繁殖季節死亡率高、單位產量降低[3]。

三倍體貝類因其不育性而具有生長速度快、成活率高、肉質佳等優良經濟性狀[4]，三倍體菲律賓蛤仔苗種的應用，有望克服其在養殖中出現的問題[5]，利用四倍體與二倍體雜交，可培育全三倍體貝類[6]，是實現三倍體貝類產業化的關鍵。

通過物理、化學以及生物等方法抑制第一極體釋放是誘導貝類四倍體的基本方法，其中，細胞松弛素B誘導法具有操作流程短、倍化率高的優點，可有效制備貝類多倍體胚胎[5]。目前，已對長牡蠣(Crassostreagigas)、櫛孔扇貝(Chlamysferreri)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、馬氏珠母貝(Pinctadamartenssi)、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)等多種貝類開展四倍體育種相關研究[7-11]，但尚無對菲律賓蛤仔的四倍體誘導的系統研究。對菲律賓蛤仔三倍體胚胎發育的相關研究表明，三倍體的早期胚胎發育與普通二倍體差異顯著[5]，而對四倍體蛤仔早期胚胎發育的相關研究未見報道。

采用細胞松弛素B誘導法制備菲律賓蛤仔四倍體胚胎，觀察胚胎的早期發育過程，探討菲律賓蛤仔四倍體的適宜誘導條件，以期為海水雙殼類的多倍體育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 精卵

菲律賓蛤仔親貝來源于天津大神堂海域的野生群體，性腺自然成熟，于5月底采捕，清洗待用。親貝陰干4 h，置入經紫外線照射2 h的砂濾海水，充氣，約12 min后開始排精產卵。迅速將開始排放配子的親貝撿出，淡水沖洗，單個置于盛有500 mL砂濾海水的燒杯中繼續排放配子。

分別鏡檢燒杯內的排放物，選擇外形渾圓、大小均勻、未被精子污染的卵子合并，得到卵子約400萬粒，以100 μm孔徑的篩絹濾除組織碎屑，30 μm孔徑的篩絹收集，將卵子懸浮于4000 mL砂濾海水中；選擇游動迅速、分散度好的一份精液，以30 μm孔徑篩絹濾入燒杯待用。

1.2 授精

觀察精、卵密度，取約含2500萬枚精子的上層精液，加入卵子懸浮液，迅速攪動使受精均勻。受精卵懸浮液均分為4組，各1000 mL，為對照組和3個處理組。受精后13 min，向3個處理組分別加入細胞松弛素B(SIGMA)的二甲基亞礬溶液，迅速混勻，細胞松弛素B終質量濃度分別為0.5、0.75、1.0 mg/L，受精后19 min，以30 μm孔徑的篩絹清洗受精卵。

1.3 胚胎發育及倍性測定

洗卵后，4組受精卵分別置入60 L砂濾海水內進行胚胎發育，初始密度20枚/mL，隔1 h攪動水體至胚胎浮游，微充氣，約21 h后發育至D形幼蟲。整個試驗過程，控制海水溫度24.8～25 ℃，鹽度25。

受精后，觀察各組受精卵的極體隨時間出現的比例，并分別于4細胞期、原腸期、擔輪期和D形期取樣，多聚甲醛固定，統計孵化率、各階段的畸形率及畸形形式。受精率設為卵裂胚胎數與總卵數的百分比；孵化率設為D形幼蟲數與受精卵的百分比。

D形幼蟲期，各組取樣，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚工作液固定，震蕩3 min，經30 μm孔徑的篩絹過濾，得單細胞懸液，紫外流式細胞儀檢測，幼蟲的四倍體率為四倍體峰面積與總積分面積之比。

試驗重復3次平行。

1.4 數據分析

利用單因素方差分析比較各組間4細胞期、原腸期、擔輪期以及D形期胚胎的畸形率、孵化率和誘導率。若差異顯著，用最小顯著性差異法比較組間均值差異。檢驗顯著性水平設為0.05。

2 結 果

2.1 早期胚胎發育進程

受精過程中，統計對照組及處理組第一極體隨時間的釋放，細胞松弛素B的使用有效抑制了3個處理組的第一極體，隨細胞松弛素B使用質量濃度的增加，第一極體抑制率提高(表1)；洗卵后，處理組第二極體迅速釋放，但釋放率低于同期對照組，其中，1.0 mg/L細胞松弛素B處理組的第二極體釋放比例顯著低于0.5 mg/L和0.75 mg/L細胞松弛素B處理組的第二極體釋放比例，說明高質量濃度的細胞松弛素B對受精卵的發育產生了負面影響。

表1細胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵極體釋放的時間進程 %

在2細胞、4細胞、8細胞期，處理組胚胎發育進程明顯慢于對照組；在各處理組，發育速度隨細胞松弛素B質量濃度的增加而略減緩；各組于受精后21 h同時發育至D形幼蟲階段。處理組受精率低于對照組，且受精率隨細胞松弛素B質量濃度的增加而降低(表2)。

表2 細胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵的胚胎發育進程

注：表中時間為受精后50%胚胎達到相應階段的時間.

2.2 致畸

細胞松弛素B的質量濃度對4～8細胞期、原腸期、擔輪期及D形期胚胎的畸形率影響顯著(P<0.05)，在同一組，胚胎發育后期的畸形率基本高于前期，特別在擔輪期及初孵D形幼蟲階段，胚胎畸形率迅速升高(表3)。在相同發育階段，胚胎畸形率隨細胞松弛素B質量濃度的增加而增加，其中，卵裂期與原腸期，0.5 mg/L與0.75 mg/L細胞松弛素B處理組之間的畸形率差異不顯著(表4)，但1 mg/L 細胞松弛素B處理組胚胎的畸形率迅速升高，D形幼蟲期的畸形率高達36%。

表3 細胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵各發育階段的畸形率 %

注：同一行內，具有相同字母的數值差異不顯著(P>0.05).下同.

表4 細胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵各發育階段的主要畸形形式

2.3 四倍體誘發

利用流式細胞術檢測各處理組及對照組菲律賓蛤仔胚胎細胞的DNA含量(圖1)，結果表明，細胞松弛素B的使用顯著抑制第一極體的釋放，獲得了四倍體胚胎，細胞松弛素B質量濃度為0.5～1.0 mg/L，四倍體誘導率為55.1%～58.2%(表5)，無顯著差異，其中，0.5 mg/L細胞松弛素B質量濃度下四倍體誘導率最高。

圖1 對照組及細胞松弛素B處理組菲律賓蛤仔胚胎細胞的DNA含量分析a：對照組；b：細胞松弛素B處理組

3 討 論

3.1 四倍體誘導

細胞松弛素B是貝類多倍體的主要誘導劑之一，通過阻遏微絲的形成，抑制受精卵第一次成熟分裂縊縮環的形成，導致第一極體不能釋放，染色體加倍[12]。不同雙殼類的卵子，因其大小及卵子結構的差異，對細胞松弛素B的敏感性不同，細胞松弛素B處理的適宜質量濃度不同[5]。Scarpa等[10]采用1.0 mg/L的細胞松弛素B抑制第一極體釋放得到了17.4%的四倍體紫貽貝稚貝；常亞青等[11]采用0.4～1.0 mg/L的細胞松弛素B抑制第一極體誘發蝦夷扇貝四倍體，得到22%～56.5%的誘導率，其中，0.8 mg/L的細胞松弛素B質量濃度下四倍體誘導率最高；王愛民等[9]以0.5～1.0 mg/L的細胞松弛素B抑制第一極體誘導四倍體馬氏珠母貝四倍體，在0.7 mg/L的細胞松弛素B質量濃度下獲得最高誘導率。本研究中，采用了0.5、0.75、1.0 mg/L 3種細胞松弛素B質量濃度，其誘導效果無顯著差異，在同一質量濃度下，不同平行組之間的誘導率存在明顯差異，可能由于胚胎發育同步性的差異導致，而卵的成熟度與受精過程是決定胚胎發育同步性的主要因素[13]，因此，可通過對卵子的嚴格選擇以及受精過程的精確控制進一步提高四倍體胚胎的誘導率。

3.2 細胞松弛素B的致畸效應

目前，鮮見對雙殼類早期胚胎發育的系統研究，李永仁等[5]在高效誘導菲律賓蛤仔三倍體的基礎上發現，細胞松弛素B抑制第二極體的釋放，顯著提高了胚胎的畸形率，且畸形率與處理強度呈正相關。在本研究中，隨細胞松弛素B質量濃度的升高，菲律賓蛤仔各發育階段的畸形率隨之升高，同時，孵化率迅速下降。在初孵D形幼蟲階段，0.5 mg/L與0.75 mg/L細胞松弛素B處理組胚胎的畸形率比對照組平穩提高，而1 mg/L細胞松弛素B處理組胚胎的畸形率則大幅度提高，不適于菲律賓蛤仔四倍體誘導。對原腸期、擔輪期和D形期胚胎的畸形形式進行統計，對照組主要有4種畸形形式，0.5～0.75 mg/L細胞松弛素B處理組胚胎包括6～7種畸形形式，而1 mg/L細胞松弛素B處理組胚胎涵蓋全部10種畸形形式，其中包括分裂球破裂、胚胎解體等極端畸形形式。細胞松弛素B對胚胎的影響可能有兩方面原因：細胞松弛素B本身具有毒性，受精卵內殘留的細胞松弛素B影響微絲合成，從而影響正常的細胞的分裂過程，導致胚胎畸形；另一方面，第一極體的抑制，導致第二次成熟分裂異常，出現多種染色體分離形式，造成大量的非整倍體胚胎[12]，而非整倍體胚胎難以正常發育。

發育進度方面，細胞松弛素B有效抑制了第一極體的釋放，且處理組第二極體的釋放率低于對照組，在4～8細胞期，處理組的發育速度較對照組慢1～2 min。Argyriou-Tirita等[14]認為，四倍體胚胎的DNA含量較普通二倍體胚胎高一倍，細胞分裂時，DNA復制量顯著增加，紡錘體等有絲分裂器的負載增加，導致細胞分裂異常或分裂速度緩慢。

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TetraploidInductioninManilaClamRuditapesphilippenarumwithCytochalasinB

LI Yongren， LIANG Jian， GUO Yongjun

( Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Sciences, Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384, China )

An effective chemical treatment, cytochalasin B (CB), was selected to induce tetraploid in fertilized eggs and to observe early embryonic development of Manila clamRuditapesphilippinarumat polar body I (PB1). The results showed that PB1 was inhibited effectively by CB at concentration of 0.5 mg/L，0.7 mg/L and 1.0 mg/L with induction rate as high as 58.2%,55.1% and 55.2%, respectively. In addition, there was no significant difference in the induction rate each other. With the increase in CB concentration, the development of early embryos was slightly slower, the malformation rate and abnormal form were significantly increased, and the hatching rate decreased significantly. As a result, the findings suggested that 0.5 mg/L of CB was the optimal concentration for tetraploid induction of Manila clam.

manila clamRuditapesphilippenarum; tetraploid; embryonic development

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.022

2016-07-20；

2016-12-25.

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(15JCYBJC30400)；天津市科技特派員項目(16JCTPJC46200)；天津市現代產業技術體系—水產—貝類養殖崗位項目(ITTFRS2017013)；天津市農業科技成果轉化與推廣項目(201602050).

李永仁(1978-)，男，副教授；研究方向：海洋生物學. E-mail：lyr1018@163.com.

S968.317

A

1003-1111(2017)05-0666-04