褐藻多糖硫酸酯降解及其產物活性研究進展

叢 瑤，宋悅凡，汪秋寬

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發(fā)分中心，遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

褐藻多糖硫酸酯降解及其產物活性研究進展

叢 瑤，宋悅凡，汪秋寬

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發(fā)分中心，遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

低分子量褐藻多糖硫酸酯；降解方法；生物活性

褐藻多糖硫酸酯廣泛存在于海藻和海洋棘皮動物中，Kylin于1913年首次從掌狀海帶(Laminariadigitata)中提取并成功分離出了L-巖藻糖,將其命名為fucoidin；后許多研究者經熱水法、酸法、酶法提取分離表明，褐藻多糖硫酸酯除巖藻糖和硫酸基團外，還含有甘露糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖及糖醛酸等成分,確定了褐藻多糖硫酸酯雜多糖存在[1-3]。近年來報道主要集中在褐藻多糖硫酸酯的結構分析及其抗凝血、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)[4-16]等作用研究。

隨著國內外學者研究不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯相對分子質量較大，從幾萬到幾十萬甚至上百萬，在水中溶解度低、分子體積大，不利于生物體吸收[17]。低分子質量褐藻多糖硫酸酯主要由褐藻多糖硫酸酯分級或降解制得，分子式中含有硫酸基團，是較母體而言更小的組分或片段，分子量范圍從幾千至幾十萬不等；低分子褐藻多糖硫酸酯不僅可溶性好、黏度低、吸收率高，同時也保留了褐藻多糖原有的多種生物活性[18-20]，在食品、保健、醫(yī)藥等領域發(fā)展前景良好。海藻中天然的低分子褐藻多糖硫酸酯含量極低，主要由褐藻多糖降解生成，或經不同單糖合成獲得，后者生產周期長、成本高，制約規(guī)?；a。褐藻多糖硫酸酯降解研究中多以物理法、化學法及生物酶法為主。筆者綜述了褐藻多糖硫酸酯降解方法及其產物生物活性的研究發(fā)展現(xiàn)狀，以期為褐藻多糖硫酸酯的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 低分子質量褐藻多糖硫酸酯制備方法

1.1 物理降解法

物理法是一種綠色降解多糖的方法，操作簡便，不引入其他化學試劑，污染小。其中對超聲波法降解多糖機制研究較多[18-19,21-25]，普遍認為是自由基氧化還原機制及超聲波機械機制:自由基氧化還原是液體在超聲波作用下形成空穴，空穴瞬間閉合會產生局部的高溫高壓，形成高活性的自由基使聚合物降解；超聲壓強促使溶劑分子與樣品固體發(fā)生激烈高速運動,高分子物質在高速振動和剪切力的作用下發(fā)生共價鍵斷裂，導致高分子多糖分解或解聚。陳亞靜等[26]以還原糖釋放量為指標，用響應面設計優(yōu)化超聲波降解馬尾藻(Sargassum)褐藻多糖硫酸酯條件，即超聲波功率350 W、溫度50 ℃、超聲時間59 min，研究結果表明，降解后產物分子量與原樣品相比降低了36倍，其中總糖和L-巖藻糖含量降低1%～2%、硫酸基和糖醛酸含量升高，分析其原因可能是在超聲降解過程中，糖醛酸中隱藏的硫酸基團被釋放。Zhou等[27-28]在30 ℃、800 W條件下降解條斑紫菜(Porphyrayezoensis)多糖4 h，獲得21 ku的褐藻多糖，同時發(fā)現(xiàn)紫菜多糖降解速率隨超聲功率和反應溫度的升高而增大，而降解速率與超聲時間成指數(shù)關系，根據(jù)Arrhenius公式可得條斑紫菜多糖降解產物糖苷鍵活化能為52.13 kJ/mol。胡尊麗等[29]以超聲功率、多糖質量濃度和反應時間為影響因素設計三因素三水平正交試驗,確定了最佳降解條件：超聲波功率200 W、多糖質量濃度1 mg/mL、時間15 min，降解得到分子量為46.6 ku的褐藻多糖，經測定降解前后樣品的多糖與硫酸根含量沒有發(fā)生明顯變化,表明超聲波法對海帶褐藻多糖降解作用明顯，短時間內即可得到低分子量褐藻多糖硫酸酯，是一種很有前景的降解方法。

多糖的輻射降解是另一種物理降解法，因降解時間短，不需要對產物進行后期的純化處理，且輻射降解具有一定的殺菌作用。γ射線輻射降解在降解一些多糖類高分子化合物中應用較為普遍，降解效果與多糖分子單元結構、輻照條件及環(huán)境等因素有關。近些年來，Choi等[17,30-33]在輻射法降解褐藻多糖硫酸酯方面做了大量研究，試驗以10 mg/mL的褐藻多糖硫酸酯為原料，通過改變γ射線的輻射劑量(10、30、50、100 kGy)以獲得不同分子量的褐藻多糖硫酸酯。試驗結果表明，產物分子量隨輻射劑量的增大而減小，在10 kGy輻射劑量下褐藻多糖硫酸酯分子量由217 ku降至38 ku，當輻射劑量達到100 kGy時，所得產物分子量為7 ku。Quitain等[34]對褐藻多糖硫酸酯進行微波輻射降解1 min，結果顯示當輻射功率為300 W時多糖不發(fā)生降解，分子量約3000 ku；當輻射功率增至900 W時，即可得到分子量低于100 ku的褐藻多糖硫酸酯。

1.2 化學法降解

化學法[35-37]降解褐藻多糖硫酸酯是最早引入研究的，對該法研究也最為廣泛，試驗所需試劑低廉易得。在反應體系中加入使糖鏈斷裂的試劑，促進相對分子質量降低，降解程度與褐藻多糖硫酸酯的結構及降解試劑性質有關。

酸法降解為常用的化學降解法，即向多糖溶液中加入酸溶液并在一定溫度下反應以達到降解效果，所用的酸為質子酸，無機酸類有鹽酸、硫酸、硝酸等，有機酸類有甲酸、乙酸、草酸等[35]。并且酸的濃度、反應溫度和反應時間均為影響褐藻多糖降解程度的重要因素，不同的酸解條件得到的多糖分子量也不同，從而對其表現(xiàn)的生物活性也有影響[37-40]。Yang等[36]用0.01 mol/L HCl在沸水浴、微波兩種加熱方式下分別反應0～15 min、0～120 s,所得褐藻多糖硫酸酯分子質量為30～5100 ku。薛勇等[41]將1% (m/V)褐藻多糖硫酸酯與0.01 mol/L的H2SO4在100 ℃下水浴降解4 h，后經中和、超濾可得到相對分子量高于5 ku、1～5 ku和低于1 ku 3個組分的褐藻多糖硫酸酯。蔡璐[42]采用不同濃度(0.01、0.05、0.10 mol/L)的H2SO4、不同降解溫度(40、60、80 ℃)及反應時間(2、4、8 h)分別對馬尾藻褐藻多糖硫酸酯組分F1和F2進行降解，得到的產物分子量范圍為7～16 ku，但降解后褐藻多糖的硫酸根含量下降顯著，尤其以組分F2損失嚴重，作者分析可能是硫酸在切斷糖苷鍵的過程中，硫酸基發(fā)生脫落，并且脫落程度隨反應溫度的升高而加劇。酸法水解多糖后還需對降解產物進行脫鹽純化處理，脫鹽處理可根據(jù)分子量大小采用超濾膜，也可通過不同類型的脫鹽柱進行該操作[43-44]。

自由基氧化降解也是目前制備相對低分子量褐藻多糖硫酸酯的一種化學降解方法，以過氧化氫與銅或鐵金屬離子相結合的形式為主，反應機制復雜，與Fenton反應類似，在催化作用下H2O2分解產生HOO-、HO·、O2·，這些自由基均含有不成對電子，可以奪取糖鏈上的氫原子，使糖苷鍵發(fā)生斷裂[18-19]。趙雪等[45-46]采用Cu2+-H2O2自由基氧化結合法并經分步超濾得到一種巖藻糖、硫酸根含量均較高的褐藻多糖硫酸酯；此外，該研究發(fā)現(xiàn)當H2O2含量為4.5%時，所得褐藻多糖硫酸酯相對分子質量分別為7.68 ku和3.89 ku，硫酸根含量分別為30.32% 和32.48%；其中相對分子質量為7.68 ku的組分主要由巖藻糖和半乳糖構成，二者比例約為2∶1；此外，作者還發(fā)現(xiàn)經自由基降解法制得的低分子褐藻多糖的硫酸根含量與H2O2反應含量有關：當H2O2含量分別為4.5%和9%時，所得產物硫酸根含量較為接近，分別為38.5%、36.5%；當H2O2含量達到15%時，產物硫酸根含量大幅度下降，僅為22.5%，研究人員推斷在自由基降解褐藻多糖過程中，H2O2含量過高時，使自由基氧化反應劇烈，產物的脫硫現(xiàn)象較為嚴重。Ouyang等[37]將質量濃度為30 mg/mL的海帶(Saccharinajaponica)褐藻多糖溶液與30%H2O2混合后在90 ℃下反應2 h，后經黏度測定法、GPC法測定褐藻多糖硫酸酯分子量分別為9.6、9.4 ku，但降解后硫酸根含量略有下降，這是因為脫硫反應常發(fā)生于高溫和酸性條件下，該降解反應溫度為90 ℃、H2O2溶液恰為弱酸性體系，因此導致了硫酸根的損失。Hou等[47]研究發(fā)現(xiàn)反應溫度、過氧化氫質量和反應時間是氧化法降解褐藻多糖的主要影響因素，而多糖溶液初始pH值對降解反應無顯著影響；當反應溫度分別為30、50 ℃時，多糖降解趨勢穩(wěn)定，相對分子量隨時間延長而減小，當溫度分別升高至70、90 ℃時，產物相對分子量在2 h內迅速降至最低，之后無顯著變化。

此外，也有部分研究采用物理法輔助化學法對褐藻多糖硫酸酯進行降解[48-50]，通過物理作用增加糖苷鍵與化學試劑接觸，從而提高降解速度。Li等[48]利用微波輔助酸法水解滸苔(Enteromorphaprolifera)褐藻多糖，通過改變酸濃度、反應溫度和反應時間得到了分子量為3.31～446.5 ku的褐藻多糖。馬夏軍等[50]利用30%H2O2、超聲波輔助降解異枝麒麟菜(Eucheumastriatum)硫酸多糖，相對分子質量可降至5 ku。上述研究表明，物理輔助化學法降解褐藻多糖硫酸酯具有可行性。

1.3 酶解法

酶解法制備低分子量褐藻多糖硫酸酯是利用糖苷酶特有的專一性、高效性促使褐藻多糖中的糖苷鍵發(fā)生斷裂，一般不影響硫酸基團的含量及其在單糖殘基上的位置。酶解反應條件溫和，不引入其他試劑，可以對降解產物的相對分子質量進行有效控制，且酶解后無副產物生成。目前主要以生物酶為主，通常以貝類肝胰腺和海洋微生物等作為酶的提取原料[44，51-53]。1966年Thanassi等[54]成功從鮑(Haliotussp.)肝胰腺中提取出一種褐藻多糖水解酶，經CM-Sephadex (A-50)凝膠過濾法測定該酶分子量為100～200 ku，利用純化后的水解酶與褐藻多糖硫酸酯反應2 h后還原糖產率可達31.5%。Tanaka 等[55]同樣以鮑肝胰腺為原料，提取得到了α-L-巖藻糖苷酶和褐藻多糖水解酶兩種底物酶，并比較了兩種水解酶活性與pH的關系，褐藻多糖水解酶在pH 4.5時活性最高，略低于α-L-巖藻糖苷酶的pH 5。1999年,Daniel等[51]從歐洲大扇貝(Pectenmaximus)消化腺中分離出一種巖藻糖苷酶，該酶可促使褐藻多糖硫酸酯釋放L-巖藻糖，酶解產物相對分子量顯著下降。Keiko等[56]以蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)肝胰腺為提取原料，經硫酸銨分段鹽析、陰離子交換層析、等電點沉淀等一系列方法純化得到了一種巖藻多糖酶；通過TSK gelG 3000SW 凝膠柱和SDS凝膠電泳兩種方法測定該酶分子量分別為85 ku和84 ku；利用該酶降解海蘊褐藻多糖硫酸酯，結果顯示多糖溶液黏度降低，硫酸化寡糖的得率約為29.9%。閆相勇等[57]自九孔鮑(Haliotisdiversicoloraquatilis)肝胰腺中提取純化出兩種巖藻聚糖裂解酶，底物褐藻多糖硫酸酯降解率為8%～15%，且酶解后產物的硫酸根含量無顯著變化。除從海洋生物中提取褐藻多糖降解酶之外，海洋微生物是獲得具有降解效果的多糖酶的另一重要來源。經單因素和正交試驗，萬瑋等[58]優(yōu)化了太平洋火色桿菌(Flammeovirgapacifica)降解龍須菜(Gracilarialemaneiformis)多糖的條件，使得發(fā)酵液中海藻寡糖含量達到3.83 g/dm3。Kim等[59]培養(yǎng)一種海洋細菌—鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)PF-1，該菌株可將褐藻多糖硫酸酯降解成7種含有巖藻糖的低聚糖，分子量為305～3749 u，經鑒定該菌株所釋放的酶可能是具有內切作用的巖藻多糖酶。

部分藻類褐藻多糖硫酸酯的降解方法及其產物分子量的分布范圍見表1。

表1 部分藻類褐藻多糖硫酸酯降解方法及產物分子量分布范圍

2 低分子量褐藻多糖硫酸酯生物活性及應用

隨著生物分子學技術的發(fā)展，研究者對低分子量褐藻多糖硫酸酯也日益了解。低分子量褐藻多糖硫酸酯的低黏度、高溶解性、無毒等特點使其在藥物、食品應用方面具有很大的潛在用途，包括清除體內自由基、保護腎臟、抗腫瘤[72-77]、治療心腦血管疾病[78-79]、改善糖尿病高血壓[80]、促進腸道健康等[81-83]，對促進健康、預防疾病等作用越來越大，甚至超過其營養(yǎng)價值。

2.1 清除自由基

2.2 抗腫瘤

惡性腫瘤是目前危害人類生命健康的重大疾病之一，由惡性腫瘤引起的死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。惡性腫瘤生長繁殖快，易浸潤轉移，故而會造成人體器官功能損害，重則危及生命，在臨床上具有較大的根治難度。Anastyuk等[87]發(fā)現(xiàn)從墨角藻中所提取的天然褐藻多糖硫酸酯及其降解產物具有抗腫瘤功能，在同一劑量下，低分子量褐藻多糖硫酸酯對人皮膚惡性黑色素瘤細胞SK-MEL-5的增殖、集落形成抑制效果弱于褐藻多糖硫酸酯，而對人皮膚惡性黑色素瘤細胞SK-MEL-28表現(xiàn)出的抑制活性與褐藻多糖硫酸酯效果相當，可能與多糖主鏈上硫酸基團、巖藻糖殘基位置或降解產物片段的硫酸根含量相關。Yang 等[36]通過沸水浴加熱方式酸水解褐藻多糖，所得低分子量褐藻多糖硫酸酯表現(xiàn)出一定的抗癌活性，當褐藻多糖在沸水浴中酸解10 min后降解產物的抗癌活性更加顯著。Choi等[17]研究了γ射線照射制備的低分子量褐藻多糖硫酸酯對人體乳腺癌細胞MCF-7、胃癌細胞AGS和肝癌細胞HepG-2的抑制作用，結果表明，低分子量褐藻多糖對癌細胞抑制力隨對褐藻多糖照射量的增加而增大，當射線照射劑量達到 100 kGy時,抑制效果最佳；此外，Choi等[33]還發(fā)現(xiàn)低分子量褐藻多糖對黑色素瘤細胞B16-BL6同樣具有抑制作用。

2.3 糖尿病治療

糖尿病是一種世界性的常見病和多發(fā)病，患者在高血糖、高血脂等多種有害因素刺激下會引起血管內皮功能紊亂及血管病變，進而造成動脈粥樣硬化、高血壓及血管疾病[88-89]，某些抗氧化劑、L-精氨酸或蛋白激酶C抑制劑對心血管可起到保護作用。Cui等[80]以GK大鼠建立2型糖尿病模型，分別測定海帶低分子量褐藻多糖硫酸酯對大鼠體內血壓、局部血流量和離體血管內皮依賴性舒張反應、內皮一氧化氮合成酶表達以及對體外內皮細胞中eNOS磷酸化作用，結果表明低分子量褐藻多糖硫酸酯具有維護內皮細胞活性的特點，可用來預防治療糖尿病心血管并發(fā)癥。Jeong等[90]發(fā)現(xiàn)低分子量褐藻多糖硫酸酯可減少肥胖，維持db/db糖尿病小鼠體內血脂和葡萄糖平衡，并通過在體內外激活AMP依賴的蛋白激酶來改善內質網應激反應誘導的胰島素抵抗，緩解2型糖尿病引起的代謝失衡。Chen 等[91]同樣以GK大鼠模型研究低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病性腎病的預防保護作用，通過組織學評價、蛋白質印記分析、血液肌酐和尿素氮等試驗，發(fā)現(xiàn)低分子量褐藻多糖硫酸酯可顯著降低糖尿病大鼠模型中血液肌酐和尿素氮，蘇木精—伊紅染色、高碘酸—希夫反應染色和馬松三色染色的腎組織顯示腎間質纖維化顯著減少，證明低分子量褐藻多糖是預防治療糖尿病腎病腎臟纖維化的潛在藥物。Yang等[92]研究了低分子褐藻多糖硫酸酯對糖尿病小鼠血管內皮生長因子的生長增殖的保護作用。對小鼠喂食低分子量褐藻多糖 [50、100、200 mg/(kg·d)]4個月，分別通過免疫熒光染色和熒光素血管造影、ELISA、RT-PCR技術檢測缺氧誘導因子-1α水平表達及視網膜血管內皮生長因子，結果表明低分子褐藻多糖硫酸酯通過抑制缺氧誘導因子-1α和視網膜血管內皮生長因子過度表達來緩解由糖尿病引起的視網膜病變，可作為預防或治療糖尿病性視網膜病變的候選藥物。Yu等[93]以goto-kakizaki大鼠建立糖尿病性心肌病模型，用低分子褐藻多糖[50、100 mg/(kg·d)]處理3個月，經超聲心動圖、離體心臟灌注及心室染色等試驗，表明低分子量褐藻多糖硫酸酯可增強心肌收縮力、減少心臟纖維化、改善機體中的超氧化物歧化酶；此外，低分子褐藻多糖硫酸酯對糖尿病心臟中活性氧產生和肌細胞凋亡也具有一定的抑制作用，也可抑制蛋白激酶Cβ在糖尿病心臟中的過度激活。

2.4 心腦血管治療

心腦血管疾病是心臟血管和腦血管疾病的統(tǒng)稱，主要由體內一些不必要的脂類醇類等物質氧化后損傷血管引起，是目前危害人類健康的重大疾病之一，而吸煙飲酒、不健康飲食、肥胖、糖尿病等不良因素均可增大患病風險[94-96]。Millet等[97]通過對雄性新西蘭兔皮下注射褐藻多糖硫酸酯(分子量8 ku)，并在離體條件下分析該樣品對血液樣品的抗凝血活性、出血效應及對凝血酶產生的影響，研究結果發(fā)現(xiàn)，低分子量褐藻多糖硫酸酯具有抗靜脈血栓活性，且呈劑量相關，在單次皮下注射(20 mg/kg) 30 min后活性最佳，4 h時活性可達70%。 Hlawaty等[68]建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，用低分子量褐藻多糖硫酸酯[5 mg/(kg·d)]注射14 d，經形態(tài)學分析和增殖細胞核抗原免疫染色后表明，低分子量褐藻多糖可防止大鼠胸主動脈內膜增生，而體外研究證明質量濃度為10 μg/mL的低分子量褐藻多糖硫酸酯可使人臍靜脈內皮細胞的遷移率增加，血管平滑肌細胞的遷移率降低，還可通過基質細胞衍生因子的釋放來促進干細胞動員，對大鼠頸動脈球囊損傷后內膜增生具有預防和減弱作用。針對治療性血管再生，Luyt等[98]建立大鼠后肢缺血模型，并通過靜脈對大鼠進行低分子量褐藻多糖硫酸酯(5 mg/kg)注射，結果顯示大鼠血漿中的基質細胞衍生因子水平顯著增加。

除上述提到的幾種生物活性之外，低分子量褐藻多糖硫酸酯在預防治療高血脂癥、風濕關節(jié)炎、肌細胞分化、腸道免疫[19,99-101]等方面具有一定療效。

3 低分子量褐藻多糖硫酸酯的研究趨勢

物理法、化學法以及生物酶法在低分子量褐藻多糖硫酸酯的制備中均具有重要意義；超聲及輻射等物理方法作為降解多糖的新技術，無污染、不會造成多糖結構破壞，目前對物理法的研究多集中于多糖的降解效果，與多糖降解機制的相關報道較少，而且物理法對儀器設備性能要求較高、樣品處理量小，在實現(xiàn)工業(yè)與綠色化生產相結合過程中具有一定困難。酶法反應條件溫和、不會產生有害副產物，生物酶的來源也較為廣泛，目前可降解褐藻多糖硫酸酯的酶試劑尚未完全商品化，大多數(shù)報道還處在實驗室酶提取發(fā)酵階段，制備成本較高；此外，生物酶試劑需在特定條件范圍內才可保持活性?；瘜W法降解多糖反應操作簡便，在短時間內即可獲得大量的低分子量褐藻多糖，目前工業(yè)生產多采用此法降解；但化學法降解具有隨機性，產物分子量分布范圍廣，且會對多糖結構造成一定程度的破壞，可考慮與物理法相結合，使降解反應溫和高效化。低分子質量褐藻多糖硫酸酯在生物醫(yī)藥、保健食品研究上已獲得一定成果，可為各類臨床試驗提供理論依據(jù)，主要以動物體內、外試驗居多，未能廣泛的應用到實際治療當中，特別是與抗炎免疫、糖尿病和心腦血管治療等領域的相關研究較少，此外低分子量褐藻多糖硫酸酯也是近年來一些熱門功能性食品組成成分。因而在未來研究中可將目光聚焦在新領域中，在現(xiàn)有資源基礎上獲得更深層次的成果。

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AdvancesonResearchofDegradationofFucoidanandActivitiesofItsProducts

CONG Yao, SONG Yuefan, WANG Qiukuan

( National Research and Development Branch Center for Seaweed Processing, Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province, College of Food Science and Technology, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

low molecular weight fucoidan; degradation method; biological activity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.024

2017-01-12；

2017-04-28.

國家自然科學基金資助項目(31471610)；海洋公益性行業(yè)科研專項(201405040).

叢瑤(1991-)，女，碩士研究生；研究方向：海洋生物活性物質.E-mail:congyao2030@163.com. 通訊作者：汪秋寬(1962-)，女，教授；研究方向：水產品加工及綜合利用.E-mail:wqk320@dlou.edu.cn.

S986.2

C

1003-1111(2017)05-0674-09