玻璃化凍存對斑馬魚卵母細胞的影響

方 晨，韋祥相，張 釗，李賢梅，張小雪

( 貴州大學 動物科學學院 水產系，貴州 貴陽 550025 )

玻璃化凍存對斑馬魚卵母細胞的影響

方 晨，韋祥相，張 釗，李賢梅，張小雪

( 貴州大學 動物科學學院 水產系，貴州 貴陽 550025 )

采用比色法測定了在不同玻璃化凍存液中凍存1、2、4、8 d時斑馬魚卵母細胞中谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶的活性，以研究玻璃化凍存對卵母細胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性的影響。試驗結果顯示，V4組斑馬魚(玻璃化液組分是：1.5 mol/L甲醇、6.0 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)卵母細胞凍存1、2、4、8 d后存活率最高[分別為(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%]，顯著高于其他組。經玻璃化凍存后，斑馬魚卵母細胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性均隨凍存天數的增加而顯著下降(P<0.05)。V4組的谷胱甘肽含量[(13.37±0.59) mg/g]和線粒體三磷酸腺苷酶活性較高，線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶[(3.823±0.144) U/mg]、Mg2+-三磷酸腺苷酶[(4.503±0.144) U/mg]和Na+/K+-三磷酸腺苷酶[(7.520±0.198) U/mg]活性最高。各組細胞的活性隨著凍存天數的增加而逐漸下降。試驗結果表明，玻璃化凍存不能完全避免低溫和冷凍保護劑的毒性和對卵母細胞的損傷。

斑馬魚；卵母細胞；玻璃化凍存；谷胱甘肽；線粒體三磷酸腺苷酶

斑馬魚(Daniorerio)原產于印度東部、巴基斯坦、緬甸以及孟加拉國的小溪、稻田及恒河中游地區，是一種常見的熱帶觀賞魚[1]。斑馬魚為重要的脊椎動物模式系統之一, 具有養殖水體小、成本低、繁殖周期短、產卵量大、品系資源豐富等特點及其他模式脊椎動物所不具備的胚胎體外受精、體外發育、胚體透明等優勢，已成為生命科學研究的新寵[2]。目前已對斑馬魚的胚胎發育、毒理、營養、生長、細胞分子等進行了廣泛研究[3-9]，但尚未見到有關玻璃化冷凍對斑馬魚卵母細胞谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶活性的研究。

玻璃化凍存技術是近年來發展的一項新興技術，是超低溫保存技術中保存效果較好的一種方法。對卵母細胞進行玻璃化凍存可以建立雌性動物的基因庫，保存物種的遺傳多樣性、優良品種及瀕危動物的種質資源，為現代育種技術的發展提供技術支持；可以在任意時間內將冷凍的卵母細胞復蘇，突破時間和空間的限制，解決魚類的雌雄成熟不同步和遠緣雜交等問題，對遺傳育種具有重要意義，給水產養殖業帶來新曙光[10-11]。

本研究檢測了玻璃化凍存后斑馬魚卵母細胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性的變化， 探討玻璃化凍存對卵母細胞存活率和酶活性的影響規律，分析了玻璃化凍存對卵母細胞造成的損傷及抗氧化能力的變化，以期為魚類卵母細胞的冷凍保存及損傷機理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

谷胱甘肽試劑盒與線粒體三磷酸腺苷酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，膠原酶Ⅱ型(索萊寶公司，北京)，臺盼藍(鼎國昌盛公司，北京)，青鏈酶素(索萊寶公司，北京)，DMEM培養液(Hyclone公司，美國)，蔗糖(索萊寶公司，北京)，甲醇(國藥公司，上海)，乙二醇(國藥公司，上海)等。

1.2 主要儀器

解剖鏡(Olympus，SZ61型)，顯微鏡(Olympus，CH20型)，超凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-ID型)，10 L液氮容器(成都，LSD-10)等。

1.3 主要溶液配制

膠原酶消化溶液：準確稱量0.015 g膠原酶溶入1 mL DMEM培養液中配成15%的母液，保存在-20 ℃冰箱中備用。試驗時將母液稀釋50倍，配成0.3%的膠原酶溶液用于分解組織。

臺盼藍溶液：準確稱量0.4 g臺盼藍，溶于10 mL 0.85%生理鹽水中配成4%母液，保存在4 ℃冰箱中備用。試驗時用生理鹽水把母液稀釋10倍，配成0.4%臺盼藍溶液，用于細胞染色檢測細胞的存活率。

玻璃化冷凍液：參考Godoy等[12]試驗，設計9種不同的玻璃化液配方，根據乙二醇的濃度分成3個大組，9個小組(表1)。

表1 玻璃化液配方 mol/L

注：A組：V1～V3，5.0 mol/L乙二醇；B組：V4～V6，6.0 mol/L乙二醇；C組：V7～V9，7.0 mol/L乙二醇.

1.4 樣品制備

挑選發育成熟(腹腔飽滿)的斑馬魚約150尾, 體質量(1.25±0.18) g，解剖取出兩側的卵巢，卵巢質量(0.26±0.04) g。

卵巢稱量質量后放入青鏈霉素(100 U/mL)中涮洗1～2次，取出后放在載玻片上，用解剖刀切割成大小相同的小段(每小段30～50個卵母細胞)，然后放入膠原酶溶液中在20 ℃下酶解約20 min(酶解的時間以卵母細胞分解程度為判斷標準)，用生理鹽水涮洗卵母細胞3～4次，除去剩余的膠原酶，置0.85%生理鹽水中室溫保存備用。

1.5 卵母細胞的冷凍與復蘇

將酶解后的卵母細胞放入0 ℃中，采用三步平衡法進行預平衡。具體操作為：取卵母細胞依次置于濃度為1/4倍、1/2倍和1倍的玻璃化液(原玻璃化液)中各平衡10 min，取出卵母細胞和相應的玻璃化液一起裝到200 μL冷凍管中。將冷凍管直接放入液氮中，凍存時間分別為1、2、4 d和8 d。

將冷凍管從液氮中取出后直接放入37 ℃溫水中，迅速振蕩搖動使玻璃化液融化。融化后將卵母細胞快速轉移到離心管中，加入0.5 mol/L的蔗糖溶液，搖勻，洗脫10 min，去上清液，再加入0.25 mol/L的蔗糖溶液，搖勻，洗脫10 min，去上清液。最后將卵母細胞轉移到生理鹽水中，搖勻，洗脫，去上清液，重復2次后加入生理鹽水搖勻備用。

1.6 卵母細胞存活率檢測

取出約30個卵母細胞，加入臺盼藍溶液常溫下染色5 min，解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，計算細胞的存活率。

細胞的存活率=未染色的卵母細胞/卵母細胞總數×100%

1.7 線粒體三磷酸腺苷酶活性與谷胱甘肽含量的檢測

采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定卵母細胞中的線粒體三磷酸腺苷酶活性和卵母細胞中谷胱甘肽含量，包括線粒體中Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶等3種三磷酸腺苷酶的活性，以每小時每毫克蛋白分解三磷酸腺苷產生1 μmol無機磷的量為1個三磷酸腺苷酶活性單位(U)。每毫克蛋白質每分鐘扣除非酶促反應的作用，使反應體系中谷胱甘肽濃度下降1 μmol/L為1個酶活性單位(U)。

1.8 統計分析

所有試驗均重復3次以上，數據以平均值±標準差表示，用Excel和SPSS 17.0進行分析，采用單因素方差分析比較多組樣本的均數。

2 結 果

2.1 玻璃化凍存后卵母細胞的存活率

玻璃化凍存后各組(V1～V9組)卵母細胞的存活率都隨冷凍天數的增加而顯著下降，V1～V8各組卵母細胞的存活率在凍存1、2、4 d和8 d后明顯下降，差異顯著(P<0.05)，而V9組卵母細胞凍存4 d后存活率下降不顯著(P>0.05)。冷凍1～8 d后，V4組卵母細胞存活率最高，顯著高于其他組(P<0.05)，凍存1、2、4 d和8 d后分別為(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%(圖1)。

2.2 玻璃化凍存后卵母細胞內線粒體三磷酸腺苷酶的活性

隨著冷凍天數的增加，各試驗組卵母細胞的線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性顯著下降(圖2)。V1～V7組在凍存1、2、4 d和8 d后線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性下降明顯，差異顯著(P<0.05)。V8組和V9組卵母細胞的線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性在1、2 d和4 d顯著減少，差異顯著(P<0.05)；4～8 d，線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。比較發現，V4組卵母細胞線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶在玻璃化凍存1、2 d和4 d后顯著高于其他組(P<0.05)，其酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后分別為(3.823±0.144) U/mg、(3.492±0.084) U/mg、(2.554±0.097) U/mg和(1.930±0.076) U/mg。

圖1 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細胞的存活率注：相同字母的平均值間差異不顯著(P>0.05)，不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

圖2 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細胞線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性

隨著冷凍天數的逐漸增加，各試驗組卵母細胞的線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性下降(圖3)。V1、V3、V4、V5、V6和V8組在1、2、4 d和8 d后線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性顯著下降，差異顯著(P<0.05)。V2、V7和V9組在1 d、2 d和4 d后線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性顯著減少，差異顯著(P<0.05)；4～8 d，線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。比較表明，V4組卵母細胞的線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后顯著高于其他組(P<0.05)，其酶活力在凍存1、2、4 d和8 d分別為(4.503±0.144) U/mg、(4.134±0.182) U/mg、(2.972±0.096) U/mg和(2.113±0.073) U/mg。

隨著凍存天數的增加，各試驗組卵母細胞的線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性顯著下降(圖4)。V1～V7組在1、2、4 d和8 d后，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性顯著下降，差異顯著(P<0.05)。V8和V9組在1～2 d和2～4 d，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性顯著減少(P<0.05)；4～8 d，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。V4組的線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后顯著高于其他組，其酶活力在1、2、4 d和8 d分別為(7.520±0.198)、(5.828±0.184)、(3.204±0.197) U/mg和(2.031±0.176) U/mg。

2.3 玻璃化凍存后卵母細胞谷胱甘肽的含量

隨著冷凍天數的增加，各試驗組斑馬魚卵母細胞中谷胱甘肽含量顯著減少(圖5)。V1、V4、V5、V6和V7組卵母細胞中谷胱甘肽含量在凍存1、2、4 d和8 d后顯著減少(P<0.05)。V2、V3、V8、V9組在凍存1、2 d和4 d后的谷胱甘肽含量下降幅度大，差異顯著(P<0.05)，但在4 d后谷胱甘肽含量變化不大，無顯著性差異(P>0.05)。雖然冷凍1 d后卵母細胞中V5組的谷胱甘肽含量比V4組要高一些，但差異不顯著(P>0.05)，而V4組卵母細胞谷胱甘肽含量在2、4 d和8 d均都高于V5組，且差異顯著(P<0.05)。綜合來看，V4組凍存后卵母細胞谷胱甘肽含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)，在經過1、2、4 d和8 d凍存后，谷胱甘肽含量分別為(13.37±0.59)、(10.57±0.73)、(6.25±0.89) mg/g和(4.16±0.57) mg/g。

圖3 不同玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細胞線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性

圖4 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細胞線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性

圖5 不同玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細胞谷胱甘肽的含量

3 討 論

3.1 玻璃化凍存對魚卵母細胞線粒體三磷酸腺苷酶活性的影響

Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶均屬三磷酸腺苷酶，對維持細胞的生理功能起重要作用[13]。關于低溫凍存對三磷酸腺苷酶活性影響的研究大多集中于冷凍保存的精子；凍存后三磷酸腺苷酶活性大多顯著下降[14-17]。三磷酸腺苷酶作為廣泛分布于有機體中一種極為重要的膜蛋白酶，在卵母細胞凍存后的變化研究不多。

本試驗發現，卵母細胞凍存后，Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶的變化規律相似，活性均顯著下降；卵母細胞中谷胱甘肽含量也顯著下降，說明清除氧自由基的能力減弱，線粒體產生的大量氧自由基又作用于線粒體膜，引起膜脂質氧化損傷，甚至會引起細胞壞死、自溶，影響了三磷酸腺苷酶活性，導致其活性下降。也有可能在降溫與復溫過程中，部分損傷了線粒體，使線粒體三磷酸腺苷酶的分布發生改變，甚至引起酶的活力降低或失活；也有可能是冷凍保護劑的毒性破壞了線粒體的結構，引起酶復合蛋白體解聚，引起酶系結構和功能的變化，降低了線粒體三磷酸腺苷酶活性。

3.2 玻璃化凍存對魚卵母細胞谷胱甘肽含量的影響

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EffectsofVitrifiedCryopreservationonGSHContentandMitochondrialATPaseActivityinOocytesofZebrafishDaniorerio

FANG Chen, WEI Xiangxiang, ZHANG Zhao, LI Xianmei, ZHANG Xiaoxue

( Animal Science College, Guizhou University, Guiyang 550025, China )

The effects of vitrified cryopreservation on glutathione(GSH) content and mitochondrial ATPase activity in oocytes were investigated in zebrafish(Daniorerio) cryopreservated in different vitrification solutions for 1 d, 2 d, 4 d and 8 d by a chromatometry method. The results showed that the maximal survival rate was observed in the oocytes cryopreservated in group V4 in which the vitrification solution was consisted of 1.5 mol/L methanol, 6.0 mol/L ethylene glycol and 0.25 mol/L sucrose, with survival rate of (48.89±2.58)% in 1 d, (39.35±1.34)% in 2 d, (24.18±2.32)% in 4 d, and (14.56±1.64)% in 8 d, significantly higher than in other groups (P<0.05). The GSH contents and the activities of mitochondrial ATPase in zebrafish oocytes were found to be significantly decreased with increase in elapse of vitrified cryopreservation (P<0.05), with the maximal GSH contents and activities of mitochondrial ATPase in group V4, including Ca2+-ATPase of(3.823±0.144) U/mg, Mg2+-ATPase of (4.503±0.144) U/mg and Na+/K+-ATPase of(7.520±0.198) U/mg. The oocytes exposed to the vitrification solutions showed lower cytoactive as the increase in vitrification time, indicating that vitrification did not completely avoid the damages to zebrafish oocytes caused by the low temperature and the toxicity of cryoprotectants.

Daniorerio; oocyte; vitrification cryopreservation; glutathione; mitochondrial ATPase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.014

S965.8

A

1003-1111(2017)06-0773-05

2016-12-06；

2017-03-27.

貴州省優秀科技教育人才省長專項資金資助項目[黔省專合字(2009)102號].

方晨(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：水產動物繁殖與發育.E-mail：1727105435@qq.com.通訊作者：張小雪(1962—)，女，教授；研究方向：水產動物繁殖與發育.E-mail：zhangxx508@163.com.