二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力的影響

程雨卉，蔣經偉，董 穎，高 杉，陳 仲，周遵春

( 1. 大連海洋大學，遼寧 大連 116023； 2. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023 )

二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力的影響

程雨卉1，蔣經偉2，董 穎2，高 杉2，陳 仲2，周遵春2

( 1. 大連海洋大學，遼寧 大連 116023； 2. 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023 )

二價金屬離子在海洋無脊椎動物免疫相關酶的活力調控中發揮重要作用。為了解二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力的影響，采用生化方法研究了8種二價金屬離子在體外不同濃度下對光棘球海膽體腔液中酸/堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶和髓過氧化物酶活力的影響。結果顯示，Cu2+可明顯增強堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力；Mn2+對酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和髓過氧化物酶有強烈的激活作用；Zn2+對超氧化物歧化酶和酚氧化酶有強烈的抑制作用；Fe2+抑制過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活力；Ca2+對酸性磷酸酶和髓過氧化物酶有抑制作用；Mg2+對堿性磷酸酶有抑制作用；Cd2+對超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用；Pb2+對過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶有抑制作用。試驗結果表明，適宜濃度的Mn2+和Cu2+對光棘球海膽的非特異性免疫系統可能有促進作用，而Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Pb2+和Cd2+可能會削弱光棘球海膽的免疫應答能力。

光棘球海膽；體腔液；二價金屬離子；免疫相關酶

棘皮動物體腔液中含有多種與免疫相關的酶，這些酶通過酶促反應參與機體的多種免疫應答過程[1-3]。迄今為止，在棘皮動物體腔液中已發現的免疫相關酶包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、酚氧化酶和髓過氧化物酶等[4-5]。這些酶在無脊椎動物的非特異性免疫系統中承擔不同的免疫功能。例如，酸性磷酸酶/堿性磷酸酶對病原磷酸基團的水解作用可以修飾或更改病原表面的分子結構，從而加速免疫細胞對病原的吞噬作用甚至直接殺傷病原[6]。過氧化氫酶和超氧化物歧化酶能夠清除機體免疫應答和抗應激等生理過程中產生的過量活性氧(如O2-等)，減少活性氧對機體自身的傷害[7-8]。酚氧化酶可催化酚類底物生成對應的醌類物質，醌類物質再通過系列的非酶促反應轉化為黑色素，黑色素對病原有凝集作用，而非酶促反應中的一些中間代謝產物對部分病原有顯著的殺傷抑制作用和促進吞噬作用[9]。髓過氧化物酶通過催化氯化物生成強效的殺菌物質―次氯酸從而廣泛參與病原菌的氧化殺傷過程[7]。免疫相關酶在對底物的催化反應中通常需要金屬離子的輔助參與，因此免疫相關酶的活力對二價金屬離子非常敏感。例如，在棘皮動物中，Mg2+的濃度為1～30 mmol/L時，可增強仿刺參(Apostichopusjaponicus)堿性磷酸酶的活力[10-11]，Cu2+(CuSO4·5H2O)質量濃度為0.05 mg/L時抑制中間球海膽(Strongylocentrotusintermdius)超氧化物歧化酶的活力[12]。在甲殼動物中，Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Mg2+、Cd2+和Ni2+在濃度為0.1～0.5 mmol/L時，對長毛明對蝦(Fenneropenaeuspencinillatus)酸性磷酸酶活力有顯著抑制作用，并且抑制作用呈現劑量依賴性[13]，Cu2+、Zn2+和Ca2+濃度為10 mmol/L時，強烈抑制日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)超氧化物歧化酶的活力[14]。Mg2+、Ca2+和Zn2+濃度為5 mmol/L時對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)中的酚氧化酶有抑制作用，但對海灣扇貝(Argopectenirradians)中的酚氧化酶有激活作用，并且金屬離子對這兩個物種中酚氧化酶活力的影響呈現非劑量依賴性[15-16]。上述研究也表明，二價金屬離子對免疫相關酶活力的影響具有物種特異性。

光棘球海膽(S.nudus)又稱大連紫海膽，屬于棘皮動物門、海膽綱，是中國北方近海重要的增養殖經濟物種[17]，其免疫系統易受海洋環境中各類金屬離子的影響。但迄今為止，二價金屬離子對光棘球海膽體內不同免疫因子的影響尚不明確。因此，本研究通過生化和酶學手段分析了8種二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中6種免疫相關酶活力的影響，旨在為了解光棘球海膽的免疫機制和特點積累數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

體質量(23.6±4.4) g的光棘球海膽10只，取自遼寧省海洋水產科學研究院引育種中心，于實驗室暫養7 d后使用。暫養時水溫17～18 ℃、鹽度29、pH 8.6～8.8。

1.1.2 二價金屬離子

使用CuSO4、MnCl2、ZnSO4、FeCl2、CaCl2、MgSO4、CdCl2和 Pb(CH3COO)2(上海生工)作為二價金屬離子Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+的來源，用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 分別配制濃度為5、10、20、30、40、50、60 mmol/L的二價金屬離子溶液。

1.2 方法

1.2.1 體腔上清液的制備

用滅菌注射器從光棘球海膽(10只)的圍口膜處刺入體腔，抽取體腔液，每只海膽取體腔液2 mL。將10只海膽的體腔液混勻后，離心(4 ℃，3500 r/min，10 min)，取上清液作為體腔上清液，-20 ℃保存備用。

1.2.2 二價金屬離子與體腔上清液的預孵育

將等體積的體腔上清液分別與等體積的二價金屬離子溶液混勻，4 ℃，孵育20 min。對照組中，將二價金屬離子溶液替換為等體積的100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液。

1.2.3 酸性磷酸酶/堿性磷酸酶活力測定

酸性磷酸酶/堿性磷酸酶活力測定采用對硝基苯磷酸酯法[18]。在2.0 mL 2 mmol/LpNPP溶液(測定酸性磷酸酶活力時溶于100 mmol/L NaAc-HAc，pH 4.5；測定堿性磷酸酶時溶于50 mmol/L NaCO3-NaHCO3緩沖液，pH 9.5)中加入100 μL待測樣品，37 ℃孵育30 min，然后加入2.9 mL 100 mmol/L NaOH溶液終止反應，并在405 nm波長下測定吸光值。酶活力定義：反應體系中樣品在37 ℃與底物作用30 min產生1 mg對硝基苯酚為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 過氧化氫酶活力測定

過氧化氫酶活力測定采用過氧化氫底物法[19]。首先，用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)將過氧化氫溶液(75 mmol/L)調至A240在0.04～0.06范圍內，用作底物溶液。然后取100 μL待測樣品與2.9 mL底物溶液混勻，立刻在240 nm波長下連續測定吸光值。過氧化氫酶活力定義：反應體系中每秒鐘轉化1 μmol 過氧化氫定義為一個酶活力單位(U)。

1.2.5 超氧化物歧化酶活力測定

超氧化物歧化酶活力測定采用氯化硝基四氮唑藍法[20]。3 mL反應混合液(0.75 mmol/L NBT；13 μmol/L甲硫氨酸；20 μmol/L核黃素；0.1 mmol/L乙二胺四乙酸；50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.8)中加入100 μL待測樣品，在30 ℃下用4000 lx熒光照射5 min，然后在560 nm波長下測定吸光值。超氧化物歧化酶活力定義：每毫升反應體系中抑制率達50%時所對應的超氧化物歧化酶量為一個酶活力單位(U)。

1.2.6 酚氧化酶活力測定

酚氧化酶活力測定采用多巴絡合物生成法[21]。100 μL待測樣品與 2.0 mL左旋多巴溶液(20 mmol/L)混合后，在490 nm波長下連續測定吸光值。酚氧化酶活力定義：A490值每分鐘增加0.001為一個酶活力單位(U)。

1.2.7 髓過氧化物酶活力測定

髓過氧化物酶活力測定采用四甲基聯苯胺法[22]。2.9 mL反應混合液(1.6 mmol/L四甲基聯苯胺；0.1 mmol/L 過氧化氫)中加入100 μL待測樣品，混勻后立即在650 nm波長下連續測定吸光值。髓過氧化物酶活力定義：反應體系中每分鐘降解1 μmol 過氧化氫所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.2.8 數據分析

酶活檢測試驗均做4次重復，試驗數據使用SPSS 13.0軟件分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 二價金屬離子對酸性磷酸酶活力的影響

Cu2+在濃度為2.5 mmol/L時抑制酸性磷酸酶活力，在其他測試濃度下增強酸性磷酸酶活力；Mg2+同樣在濃度為2.5 mmol/L時抑制酸性磷酸酶活力，但在其他測試濃度下對酸性磷酸酶活力無明顯影響；Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+在所選濃度下均對酸性磷酸酶有明顯激活作用；Ca2+在所選濃度下抑制酸性磷酸酶活力(圖1)。

圖1 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中酸性磷酸酶活力的影響

2.2 二價金屬離子對堿性磷酸酶活力的影響

Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+和Cd2+在所選濃度下均對堿性磷酸酶活力有明顯的激活作用；Mg2+在所有測試濃度下對堿性磷酸酶有抑制作用；Pb2+在濃度為2.5 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L時抑制堿性磷酸酶活力，而在其他測試濃度下增強堿性磷酸酶活力(圖2)。

圖2 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中堿性磷酸酶活力的影響

2.3 二價金屬離子對過氧化氫酶活力的影響

Cu2+在所選濃度下對過氧化氫酶有強烈的激活作用；Mn2+、Zn2+和Ca2+在所選濃度下對過氧化氫酶活力無明顯影響；Fe2+和Pb2+在測試濃度下抑制過氧化氫酶活力；Mg2+在2.5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L時抑制過氧化氫酶活力，在5 mmol/L和25 mmol/L時增強過氧化氫酶活力，而在20 mmol/L和30 mmol/L時對過氧化氫酶活力無明顯影響；Cd2+在2.5 mmol/L時抑制過氧化氫酶活力，在5 mmol/L和20 mmol/L時增強過氧化氫酶活力，在其他測試濃度下對過氧化氫酶活力無明顯影響(圖3)。

圖3 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中過氧化氫酶活力的影響

2.4 二價金屬離子對超氧化物歧化酶活力的影響

Cu2+、Mn2+和Ca2+在所選濃度下對超氧化物歧化酶有明顯激活作用；Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對超氧化物歧化酶活力有強烈抑制作用；Mg2+在2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L時抑制超氧化物歧化酶活力，在15 mmol/L時增強超氧化物歧化酶活力，在20 mmol/L、25 mmol/L和30 mmol/L時對超氧化物歧化酶活力無明顯影響(圖4)。

圖4 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中超氧化物歧化酶活力的影響

2.5 二價金屬離子對酚氧化酶活力的影響

Cu2+和Fe2+測試濃度下明顯增強酚氧化酶活力；Zn2+、Cd2+和Pb2+在測試濃度下抑制酚氧化酶活力；Mn2+和Ca2+在測試濃度下對酚氧化酶活力無明顯影響；Mg2+在20 mmol/L時對酚氧化酶活力有抑制作用，在其他測試濃度下對酚氧化酶活力無明顯影響(圖5)。

圖5 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中酚氧化酶活力的影響

2.6 二價金屬離子對髓過氧化物酶活力的影響

Cu2+在2.5 mmol/L時強烈抑制髓過氧化物酶活力，在其他測試濃度下增強髓過氧化物酶活力；Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+在測試濃度下均對髓過氧化物酶有強烈的激活作用；Ca2+在測試濃度下明顯抑制髓過氧化物酶活力；Mg2+在2.5 mmol/L時抑制髓過氧化物酶活力，在10 mmol/L時增強髓過氧化物酶活力，在其他測試濃度下對髓過氧化物酶活力無明顯影響(圖6)。

圖6 二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中髓過氧化物酶活力的影響

3 討 論

3.1 了解二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力影響的意義

光棘球海膽缺乏特異性免疫系統，主要依賴體腔液中的各種免疫相關酶和其他一些活性蛋白來識別、抑制、殺傷和清除病原[1-2,4]。已有研究表明，海洋生物體內的免疫相關酶活力受二價金屬離子影響顯著[13-15]。在光棘球海膽的育苗、養殖過程中，投喂的餌料、藥物等常含有各種二價金屬離子，此外，排放到近海的工業、農業和生活污水中也含有大量的二價金屬離子[23-24]，因此，了解二價金屬離子對光棘球海膽體腔液中免疫相關酶活力的影響對海膽的健康養殖具有重要意義。

3.2 二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力的非劑量依賴性影響

在仿刺參[10]、海灣扇貝[15]、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[25]等無脊椎動物中的研究表明，二價金屬離子濃度為0～30 mmol/L時，可相對完整的反映二價金屬離子在不同濃度條件下對免疫相關酶活力的影響。因此，本研究中二價金屬離子的濃度為0～30 mmol/L。在本研究中，二價金屬離子對光棘球海膽免疫相關酶活力的影響與金屬離子濃度相關，但這種影響在多數情況下并不是隨著金屬離子的濃度增大而增強，而是呈現出非劑量依賴性，與仿刺參[10]、海灣扇貝[15]、菲律賓蛤仔[16]中的報道相似。二價金屬離子影響免疫酶活力的機制目前尚不明確，有報道推測二價金屬離子是通過結合于酶的活性部位來影響酶的活力[13]，也有研究發現二價金屬離子是通過改變酶的部分肽段的二級結構來影響酶的活力[25]，然而，這些推論和發現不能合理解釋本研究和其他研究中報道的二價金屬離子對酶活力的非劑量依賴性影響，金屬離子影響酶活力的機制仍有待深入研究。

3.3 二價金屬離子對光棘球海膽酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的影響

在光棘球海膽酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力檢測試驗中，Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+對酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均有明顯的激活作用，表明這幾種金屬離子可能會增強光棘球海膽體內基于磷酸酶的抑菌和吞噬等免疫應答活動。Cu2+除了在2.5 mmol/L時抑制酸性磷酸酶活力，在其他測試濃度下可增強光棘球海膽磷酸酶活力，表明適當濃度的Cu2+也可能會增強光棘球海膽磷酸酶系統的應答能力。二價金屬離子對光棘球海膽磷酸酶的影響與對雜色鮑(Haliotisdiversicolor)和長毛明對蝦中的結果差異巨大，而與仿刺參中的結果差異較小。在長毛明對蝦中[13]，Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+均明顯抑制酸性磷酸酶活力，在雜色鮑中[26]，Cu2+、Zn2+、Cd2+強烈抑制堿性磷酸酶活力，而在仿刺參中[10]，Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+對酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均有明顯的激活作用，表明不同物種間二價金屬離子對磷酸酶活力的影響特性可能與物種親緣關系相關。

3.4 二價金屬離子對光棘球海膽過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力的影響

在過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力檢測中，Cu2+可同時增強光棘球海膽體腔液中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力， Mn2+和Ca2+可增強超氧化物歧化酶活力而對過氧化氫酶活力無明顯影響，表明Cu2+、Mn2+和Ca2+對光棘球海膽的抗氧化保護系統可能有促進作用。Cu2+對抗氧化系統的促進作用在翡翠貽貝(Pernaviridis)[27]和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[28]中也有報道，但在日本沼蝦中[14]，Cu2+對抗氧化系統起抑制作用。Fe2+和Pb2+對光棘球海膽體腔液中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力均有抑制作用，Mg2+和Cd2+在多個濃度下抑制過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，Zn2+對超氧化物歧化酶活力有抑制作用，表明上述幾種金屬離子可能會削弱光棘球海膽免疫系統的抗氧化能力。

3.5 二價金屬離子對光棘球海膽酚氧化酶活力的影響

在酚氧化酶活力測定中，Cu2+和Fe2+對光棘球海膽體腔液中酚氧化酶有明顯激活作用，Zn2+、Cd2+、Mg2+和Pb2+對體腔液中酚氧化酶有抑制作用，表明Cu2+和Fe2+可能會增強光棘球海膽體內酚氧化酶誘導的黑化凝集作用、促吞噬包埋作用和氧化殺傷作用，而Zn2+、Cd2+、Mg2+和Pb2+可能是光棘球海膽酚氧化酶應答系統的限制因子。無脊椎動物中的酚氧化酶通常為含銅的金屬酶，其對底物的催化活動需要Cu2+的參與[29]。然而，Cu2+對酚氧化酶活力的影響在不同海洋無脊椎動物中并不一致。例如，在光棘球海膽，Cu2+對酚氧化酶有激活作用；在菲律賓蛤仔[16]、日本蟳(Charybdisjaponica)[29]和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)[30]中，Cu2+對酚氧化酶有抑制作用；在海灣扇貝中[15]，Cu2+在低濃度時增強酚氧化酶活力，而在高濃度時抑制酚氧化酶活力。因此，無脊椎動物酚氧化酶的催化機制仍有待于進一步研究。

3.6 二價金屬離子對光棘球海膽髓過氧化物酶活力的影響

在髓過氧化物酶活力測定中，Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對光棘球海膽體腔液中的髓過氧化物酶有激活作用，而Ca2+明顯抑制髓過氧化物酶活力，表明Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+可能會增強光棘球海膽髓過氧化物酶系統的殺菌、抑菌能力，而Ca2+可能會削弱光棘球海膽髓過氧化物酶系統的應答能力。此外，與酸性磷酸酶測試中的結果相似，Cu2+除了在2.5 mmol/L時抑制髓過氧化物酶活力，在其他測試濃度下可增強光棘球海膽磷酸酶活力。本研究結果表明適當濃度的Cu2+對光棘球海膽髓過氧化物酶系統可能會起促進作用。

3.7 小 結

綜上所述可以得知，不同二價金屬離子對不同免疫酶活力的影響不同。Mn2+可增強酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和髓過氧化物酶的活力，對過氧化氫酶和酚氧化酶活力無明顯影響，表明Mn2+對提高光棘球海膽的免疫力可能是有益的；Cu2+可增強堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活力，并且在2.5 mmol/L以外的其他測試濃度下增強酸性磷酸酶和髓過氧化物酶活力，表明適當濃度的Cu2+對光棘球海膽的免疫力可能也有促進作用；Zn2+抑制超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，Fe2+抑制過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，Ca2+抑制M酚氧化酶活力，Mg2+抑制堿性磷酸酶活力，Cd2+抑制超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，Pb2+抑制過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶活力，表明上述幾種金屬離子可能會削弱光棘球海膽的免疫應答能力。

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EffectsofDivalentMetalIonsonActivitiesofImmune-relatedEnzymesinSeaUrchinStrongylocentrotusnudus

CHENG Yuhui1, JIANG Jingwei2, DONG Ying2, GAO Shan2, CHEN Zhong2, ZHOU Zunchun2

( 1. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

In order to understand the effects of divalent metal ions on the activities of immune-related enzymes in sea urchinStrongylocentrotusnudus, the coelomic fluid of the sea urchin was incubated with Cu2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, Mg2+, Cd2+and Pb2+at different concentrations, respectively, and then the activities of acid phosphatase (ACP) and alkaline phosphatase (AKP), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), phenoloxidase (PO) and myeloperoxidase (MPO) in the incubation mixture were determined with biochemical methods. The results showed that Cu2+led to increase the activities of AKP, CAT, SOD and PO; Mn2+enhanced the activities of ACP, AKP, CAT and MPO; Zn2+showed inhibitions on SOD and PO activities; Fe2+inhibited the activities of CAT and SOD; Ca2+inhibited the activities of ACP and MPO; Mg2+showed inhibition on AKP activities; Cd2+inhibited the activities of SOD and PO; Pb2+showed inhibitions on CAT, SOD and PO activities. The results implied that Mn2+and Cu2+promoted the immune-response capacity of the sea urchin at certain concentrations, while Fe2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+, Pb2+and Cd2+might be harmful to the innate immune system in the sea urchin.

Strongylocentrotusnudus; coelomic fluid; divalent metal ion; immune-related enzyme

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.004

S968.9

A

1003-1111(2017)01-0022-07

2015-12-02；

2016-05-06.

遼寧省科技計劃項目(2015103044)；遼寧省農業領域青年科技創新人才培養計劃項目(2015018)；遼寧省海洋與漁業廳項目(201502).

程雨卉(1991-)，女，碩士研究生；研究方向：棘皮動物免疫學. E-mail: 1132689854@qq.com. 通訊作者： 周遵春(1967-)，男，研究員；研究方向：海洋生物技術.E-mail：zunchunz@hotmail.com.