鯪魚致病性遲鈍愛德華氏菌的鑒定及藥敏分析

陳言峰,卓孝磊,王 超,鄭宗正,付 強

( 1.佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231； 2. 清遠市北江水產科學研究所，廣東 清遠 511510； 3. 清遠市水生動物防疫檢驗站，廣東 清遠 511510 )

鯪魚致病性遲鈍愛德華氏菌的鑒定及藥敏分析

陳言峰1,卓孝磊2,王 超3,鄭宗正1,付 強1

( 1.佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231； 2. 清遠市北江水產科學研究所，廣東 清遠 511510； 3. 清遠市水生動物防疫檢驗站，廣東 清遠 511510 )

自廣東省清遠市某養殖場患病鯪魚的肝、腎、脾組織分離到兩株優勢菌QY15814、QY15815，通過細菌生化鑒定管與16S rDNA序列分析對這兩株菌進行鑒定，采用紙片擴散法進行藥敏試驗，并測定了這兩株菌對鯪魚的半致死劑量。試驗結果顯示，這兩株菌為革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，有動力，能利用蔗糖、甘露糖、麥芽糖，硝酸鹽還原、吲哚、MR試驗均為陽性；根據其生理生化特性，鑒定為遲鈍愛德華氏菌，通過PCR擴增其16S rDNA基因，經測序及NCBI比對，結果與遲鈍愛德華氏菌的同源性高達99%。這兩株致病菌對頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛等抗生素高度敏感，對鏈霉素、克拉霉素、紅霉素中度敏感，對阿米卡星、復方新諾明、大觀霉素、克林霉素不敏感。這兩株菌對鯪魚具有較強的致病力，半致死劑量分別為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g。

鯪魚；遲鈍愛德華氏菌；鑒定；藥物敏感性

鯪魚(Cirrhinusmolitorella)，俗名土鯪、雪鯪、鯪公、花鯪，屬鯉科、野鯪亞科、鯪屬，是我國南方地區重要的經濟魚類[1]。該品種具有食性雜、產量高、飼料來源廣等特點，且肉質細嫩，味道鮮美[2]，深受廣大消費者喜愛。目前關于鯪魚的研究主要涉及其生長特性[3]、形態變異特征[4]、肌肉營養成分[1]、營養需求[5]、生長因子[6]、線粒體基因組序列[7]，群體遺傳結構[8]與遺傳多樣性[9-10]等方面。自然條件下，鯪魚抗病能力較強，但在高密度養殖條件下，一旦養殖水體水質惡化，鯪魚患病也時有發生，已造成了較大的經濟損失[11]。長期以來，引發鯪魚病害的病原主要以各類寄生蟲為主[12-15]，而有關鯪魚細菌性疾病的報道并不多，目前僅方蘋等[11]報道過由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)混合感染引發鯪魚的紅鰓病、劉禮輝等[16]報道過由無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)引發的鯪魚病害。筆者于2015年8月從廣東省清遠市某養殖場得到部分患病的鯪魚，并對病原菌進行了分離鑒定及藥物敏感性分析，可為鯪魚養殖過程中疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病魚為采自廣東省清遠市某養殖場所養殖的鯪魚。癥狀為體表充血，有部分潰爛的病灶，肛門紅腫，解剖發現肝、腎腫大，并有血紅色的腹水。健康的鯪魚取自廣東省佛山市某養殖場。

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、SS瓊脂培養基、細菌微量生化鑒定管購于廣東環凱微生物有限公司，抗生素紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq聚合酶、dNTP和PCR緩沖液(含Mg2+)購于寶生物工程(大連)有限公司。細菌16S rDNA引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。

1.2 病原菌的分離純化

無菌操作從瀕死鯪魚的肝、腎、脾及體表病灶處取樣，接種于營養瓊脂培養基，37 ℃培養48 h。挑取優勢菌落進行純培養，并接種于營養肉湯培養基，37 ℃培養24 h后，加入無菌甘油，置于冰箱-80 ℃保存備用。

1.3 病原菌的生理生化特征

對已純化的優勢菌(QY15814、QY15815)按常規方法[17]進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。并將細菌接種于營養瓊脂培養基、SS瓊脂培養基，37 ℃培養48 h，觀察其菌落的形態特征。按照細菌微量生化鑒定管的說明書操作并判定該細菌各項生化指標的結果。

1.4 半致死劑量的測定

將分離所得的菌株QY15814接種于營養瓊脂培養基37 ℃培養24 h后，用無菌生理鹽水將其菌落洗下，依次稀釋成密度為1.53×109、1.53×108、1.53×107、1.53×106、1.53×105cfu/mL和1.53×104cfu/mL的菌懸液，并按每尾0.3 mL的劑量，分別將6個密度的菌懸液對6個組(每組10尾，共60尾)的健康鯪魚[(167±19) g]進行腹腔注射，為6個感染組；對照組的10尾鯪魚，每尾注射0.3 mL無菌生理鹽水。連續觀察15 d。試驗過程中，每日觀察記錄受試魚的發病癥狀和死亡情況，并對死亡的魚進行細菌再分離、鑒定，根據改進的寇氏法[18]計算半致死劑量(LD50)。相同的方法用于QY15815對鯪魚的半致死劑量的測定。

1.5 16S rDNA序列分析

選用細菌16S rDNA通用引物(正向: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，菌落PCR法直接擴增QY15814和QY15815的16S rDNA。50 μL的PCR反應體系包含：新鮮菌液2 μL，上、下游引物(濃度10 mmol/L)各1 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+) 5 μL，Taq聚合酶(5 units/μL) 0.25 μL，ddH2O 36.75 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min 1次；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共進行30個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，送上海美吉生物醫藥科技有限公司純化后測序。測序結果經BLAST分析后，選取相似性高的序列，采用ClustalX 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過Mega 4.1軟件構建系統發育樹。

1.6 抗生素敏感試驗

用滅菌棉簽將QY15814和QY15815的新鮮菌液均勻涂布于營養瓊脂表面，用無菌鑷子夾取每種抗生素紙片并貼在上面，37 ℃培養48 h后，測量抑菌圈直徑的大小。根據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執行標準(CLSI-M100-S18)[19]，判定該菌對34種抗生素的敏感程度。

2 結 果

2.1 病原菌的形態特征

分離得到的QY15814和QY15815為革蘭氏陰性短桿菌，在營養肉湯里培養時菌液呈均勻渾濁，接種到營養瓊脂培養基上37 ℃培養48 h，形成圓形、凸起、灰白色、有光澤的菌落，直徑1.0～2.0 mm。該菌在SS瓊脂培養基上生長，其菌落中央有黑色小點。

2.2 病原菌的生化特征

除QY15814、QY15815蔗糖為陽性、QY15815 L-阿拉伯糖為陽性外，其他指標與遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)一致(表1)。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[17]，鑒定菌株QY15814、QY15815為遲鈍愛德華氏菌。

表1 分離菌的生化特征

注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應.

2.3 半致死劑量的測定

人工感染后，發病鯪魚的主要癥狀與自然發病鯪魚的癥狀相似，從感染后瀕死魚的肝、腎等處均能分離到與原致病菌形態、特征一致的菌株。對照組的魚無發病癥狀和死亡現象。計算得到菌株QY15814和QY15815對鯪魚的半致死劑量分別為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g (表2)。

2.4 16S rDNA序列分析及發育樹的構建

將測序得到的菌株QY15814和QY15815的16S rDNA的序列 (Accession No. KU711814和KU711815)分別在GenBank中進行BLAST分析，顯示與遲鈍愛德華氏菌的同源性均為99%，表明這兩株菌為遲鈍愛德華氏菌。根據上述序列構建系統發育樹，菌株QY15814、QY15815與遲鈍愛德華氏菌親源關系最近(圖1)。

2.5 藥敏試驗

遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛等抗生素高度敏感，對鏈霉素、克拉霉素、紅霉素中度敏感，對阿米卡星、復方新諾明、四環素、麥迪霉素、萬古霉素、大觀霉素、克林霉素與苯唑西林不敏感(表3)。

表2 人工感染試驗結果

圖1 根據菌株QY15814和QY15815的16S rDNA序列構建的系統發育樹

抗生素每片含量μg抑菌圈直徑/mmQY15814QY15815敏感性阿米卡星卡那霉素鏈霉素復方新諾明慶大霉素頭孢唑啉四環素頭孢噻肟左氟沙星諾氟沙星多粘菌素B環丙沙星頭孢吡肟麥迪霉素青霉素G氨芐西林呋喃妥因頭孢曲松頭孢他啶紅霉素萬古霉素頭孢西丁大觀霉素米諾環素頭孢噻吩氯霉素克林霉素妥布霉素頭孢呋辛克拉霉素頭孢哌酮苯唑西林氧氟沙星哌拉西林30301023．75/1．2510303030510300units530301010300303015303010030303021030157515100224160202693930．523．51232367．5212724．539321483572124300233411358．53033224．51602025938302312323682128243932．5148357．52124．53002334．51135930．533RSIRSSRSSSSSSRSSSSSIRSRSSSRSSISRSS

注：“S”為高度敏感，“I”為中度敏感，“R”為不敏感.

3 討 論

3.1 病原菌的分離及對鯪魚的致病力

近年來，鯪魚除可用于加工、食用外，還可作為尖塘鱧(Oxyeleotris)、鱖魚(Sinipercachuatsi)等品種的餌料魚，因此需求量逐年上漲，已成為華南地區熱門的養殖品種之一。盡管目前國內外有關鯪魚病原的文獻報道主要集中于各類寄生蟲，但在實際生產中，由病原細菌引發的鯪魚病害已日趨嚴重[11,16]。本次從患病鯪魚分離到遲鈍愛德華氏菌，這在鯪魚的細菌性疾病研究中尚屬首次。

本研究中，人工感染后鯪魚的癥狀與自然發病時的癥狀相似，并從瀕死的魚體內重新分離到了與遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815形態、生化特征一致的細菌，證實這兩株菌即為本次導致鯪魚發病的病原菌。經計算遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對鯪魚的半致死劑量依次為1.93×105cfu/g和9.65×104cfu/g，顯示這兩株菌對鯪魚具有較強的致病力[20]。

3.2 病原菌的表型特征

Grimont等[21]根據遲鈍愛德華氏菌的生理生化特征，將其分為野生型和生物型Ⅰ。野生型的菌株能夠產生硫化氫，但不能利用某些糖類(如蔗糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖)作為能源，并與人和動物的感染密切相關；生物型Ⅰ菌株的以上4個生化指標的特征與野生型的相反，該類型的菌株只從水體中和蛇體內分離過，也尚未見生物型Ⅰ感染動物致病的文獻報道[22]。本研究所檢測的生化指標中，除蔗糖和L-阿拉伯糖之外，其他指標的結果與遲鈍愛德華氏菌一致。本研究中，QY15814蔗糖為陽性，而硫化氫、D-甘露醇、L-阿拉伯糖均為陰性；QY15815蔗糖、L-阿拉伯糖為陽性，而硫化氫、D-甘露醇為陰性，此兩菌株均未嚴格符合野生型和生物型Ⅰ的特征。因此，本次分離到的兩株遲鈍愛德華氏菌，屬于表型有差異的野生型，還是屬于表型有差異的生物型Ⅰ，尚需進一步驗證。

3.3 可防治鯪魚遲鈍愛德華氏菌病的抗生素的篩選

當前，使用抗生素仍是防治水產養殖動物細菌性疾病的主要手段[23]。本研究得出的對34種抗生素敏感性的結果，可為在對由遲鈍愛德華氏菌引發的鯪魚感染癥防治用藥時提供參考。然而，抗生素選用時要以不同地區、不同來源、不同菌株的藥敏試驗結果為依據，避免藥物的濫用。目前對青霉素G耐藥的魚源遲鈍愛德華氏菌的菌株[24-27]較多，而本次分離得到的兩株遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對青霉素G敏感，此外，Xiao等[28-30]也分別報道過對青霉素G敏感的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)源、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)源與斑馬魚(Daniorerio)源遲鈍愛德華氏菌菌株。本研究發現遲鈍愛德華氏菌QY15814和QY15815對水產養殖中常用漁藥如克拉霉素、紅霉素、鏈霉素的敏感性降低，且對四環素、麥迪霉素、大觀霉素、克林霉素已產生耐藥性，推測由養殖戶長期投放此類藥物所致。

本研究還發現，分離得到的兩個菌株對34種抗生素的敏感性并未由于菌株的不同而出現明顯的差異。此外，有趣的是，本次分離到的兩個菌株對部分二、三、四代頭孢類抗生素(如頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢呋辛)的敏感性最高。通過比較抑菌圈直徑，這些抗生素的抑菌能力明顯強于第一代頭孢菌素如頭孢唑啉、頭孢噻吩。本研究的藥敏試驗結果又一次證實，新型頭孢類抗生素相比早期頭孢類抗生素在抗菌作用方面具有更顯著的優勢。

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IdentificationandAnalysisofAntibioticSensitivityofPathogenicBacteriumEdwardsiellatardafromCulturedMudCarp(Cirrhinusmolitorella)

CHEN Yanfeng1, ZHUO Xiaolei2, WANG Chao3, ZHENG Zongzheng1, FU Qiang1

( 1. College of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528231, China; 2. Qingyuan North River Fishery Science Institute，Qingyuan 511510， China; 3. Epidemic Prevention Station of Aquatic Animal in Qingyuan City, Qingyuan 511510， China )

Two dominant bacterial strains (QY15814 and QY15815) were isolated from hepatopancreas, kidney and spleen of diseased mud carp (Cirrhinusmolitorella) in an aquafarm in Qingyuan city, Guangdong province. They were identified through biochemical identification tubes and 16S rDNA sequence analysis, and antibiotic susceptibility test was performed through Kirby-Bauer disk diffusion method. Moreover, the median lethal dose values (LD50) for the isolates to mud carp were determined. The results showed that the isolates were facultative anaerobes which were gram negative, rod in shape, and motile. Their indole, MR and nitrate reduction test were positive, and they utilized sucrose, mannose and maltose. The isolates were identified asEdwardsiellatardaaccording to their physiological and biochemical characteristics. The 16S rDNA sequences of the isolates showed a high similarity (99%) to that ofE.tardavia BLAST network services in NCBI. The isolates were highly susceptible to cefotaxime, cefepime, ceftriaxone, cefoxitin, cefoperazone, cefuroxime and the others, intermediately susceptible to phytomycin, clarithromycin, erythromycin, and not susceptible to amikacin, complex sinomin, spectinomycin, and clindamycin. The LD50values for the isolates to healthy mud carps were 1.93×105cfu/g and 9.65×104cfu/g, respectively, indicating that they had strong pathogenicity to mud carp.

Cirrhinusmolitorella;Edwardsiellatarda; identification; drug sensitivity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.008

S941.42

A

1003-1111(2017)01-0048-06

2016-03-08；

2016-06-03.

廣東省自然科學基金資助項目(2014A030310020); 廣東高校優秀青年創新人才培養計劃項目(2014KQNCX183); 佛山科學技術學院優秀青年教師培養計劃項目(fsyq201507).

陳言峰(1981-), 男, 博士；研究方向: 水產養殖病害防治技術. E-mail: chyfwf@126.com.